汪錦江，李佳曦，鄧周峰，劉子梅，喬光磊，馬俐君

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院 腫瘤科，上海 200336)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是女性中第二常見，男性中第三位常見的癌癥，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制受多因素影響，大部分死亡歸因于局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肝轉(zhuǎn)移不僅作為結(jié)直腸癌最易發(fā)生的轉(zhuǎn)移[2]，也是結(jié)直腸癌死亡的主要原因[3]。除此之外，對(duì)于轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞如何適應(yīng)和定植新的組織環(huán)境知之甚少。因此，探究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的病理生理機(jī)理，對(duì)于了解轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以及開發(fā)靶向治療CRC的藥物具有十分重要的意義。

失巢凋亡(Anoikis)是指當(dāng)正常的上皮細(xì)胞失去了與細(xì)胞外基質(zhì)的連接時(shí)觸發(fā)的一種特殊的程序性細(xì)胞死亡方式[4]。有研究表明腫瘤細(xì)胞抵抗失巢凋亡的能力決定了細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)后的存活能力，這是惡性腫瘤獲得侵襲和轉(zhuǎn)移特性的前提[5-7]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)的過程被視為是對(duì)失巢凋亡發(fā)生的抵抗，促進(jìn)了細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過程。除了EMT之外，這種可塑性增強(qiáng)的另一個(gè)表現(xiàn)是腫瘤干細(xì)胞亞群的出現(xiàn)[8]，它們和發(fā)生EMT的細(xì)胞一樣，對(duì)失巢凋亡具有抗性，這些都是癌癥的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。

GRHL2是粒狀頭樣(GRHL)3個(gè)家族成員之一[9]，參與調(diào)控胚胎發(fā)育、上皮細(xì)胞分化、表皮屏障形成以及表皮損傷修復(fù)等一系列重要生命過程[10-12]，并可通過靶向上皮表型基因E-鈣黏蛋白(E-cadherin)和Claudin 4調(diào)控上皮頂端連接復(fù)合體的形成[13]。有研究報(bào)道了GRHL2在乳腺癌間質(zhì)樣上皮細(xì)胞表達(dá)降低[14]。因此，GRHL2可能是EMT一個(gè)重要調(diào)控因子。但關(guān)于GRHL2在結(jié)直腸癌中對(duì)于細(xì)胞失巢凋亡的影響報(bào)道較少，且可能受制于以往研究技術(shù)的限制，GRHL2在腫瘤中復(fù)雜的功能尚未完全揭曉。因此，這次研究使用本課題組在前期研究中通過CRISPR/CAS9技術(shù)構(gòu)建的GRHL2的沉默及回補(bǔ)細(xì)胞系來研究該基因?qū)θ私Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞侵襲遷移和失巢凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株、GRHL2-KO細(xì)胞株以及GRHL2-KO基礎(chǔ)上過表達(dá)細(xì)胞株(GRHL2-OE)來自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院馬俐君課題組(文章另發(fā))。高糖DMEM和PBS購自美國GIBCO公司；胰酶和雙抗購自美國Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板來自Coring公司；熒光定量試劑盒購自日本TAKARA公司；8.0 μm的transwell小室購自美國Millipore公司；失巢凋亡試劑盒購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含10%胎牛血清和1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HCT116細(xì)胞株、GRHL2-KO株和GRHL2-OE細(xì)胞株，在37℃、5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為3組：分別為HCT116對(duì)照組、GRHL2沉默組(GRHL2-KO)和GRHL2回補(bǔ)組(GRHL2-OE)。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)GRHL2的mRNA表達(dá)

RNA抽提試劑盒抽提3組細(xì)胞的總RNA并測(cè)定濃度，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用熒光定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。以β-actin為內(nèi)參引物，上游引物：5′- CCTTCCTGGGCATGGAGTC -3′，下游引物：5′-GATCTTCATTGTGCTGGGTG -3′，GRHL2基因上游引物：5′-CGCCTATCTCAAAGACGACCAG -3′，下游引物：5′- CCAGGGTGTACTGAAATGTGCC -3′，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blotting

提取細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)取濃度，按20 μg/孔上樣進(jìn)行電泳分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉2 h后加入一抗(1∶500)，4℃搖床過夜，洗膜3次。二抗(1∶1000)室溫1.5 h，顯影曝光。使用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行定量分析。

1.5 光學(xué)顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)

稀釋細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，待克隆長成，于鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。每組細(xì)胞隨機(jī)拍攝 5 個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 失巢凋亡實(shí)驗(yàn)

每一步按照試劑盒要求進(jìn)行，消化3組細(xì)胞，制成每毫升1×106的細(xì)胞懸液。在96孔抗錨板中每孔加入500 μl細(xì)胞懸液。在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)48 h。每孔添加1 μl的Calcein AM (500X)和1 μl的EthD-1 (500X)的染料在37℃孵育1 h，后進(jìn)行熒光檢測(cè)并拍照。吸光度Calcein AM為綠色 (Ex/Em=485/515 nm)，EthD-1為紅色 (Ex/Em=525/590 nm)。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞在六孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至匯合度90%左右，用200 μl的槍頭在兩組細(xì)胞分別均勻劃下，經(jīng)PBS洗1遍換成無血清培養(yǎng)基。于培養(yǎng)0 h和48 h分別拍照。

1.8 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

消化細(xì)胞離心后用無血清培養(yǎng)基重懸，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，上室500 μl培養(yǎng)基，下室加入800 μl完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)24 h,侵襲實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)48 h。取出小室后用PBS漂洗，并用4%多聚甲醛固定30 min,最后結(jié)晶紫染色10 min,棉簽輕擦小室內(nèi)壁干燥后放置在倒置顯微鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證GRHL2基因沉默及回補(bǔ)的效果

與對(duì)照組細(xì)胞相比，GRHL2-KO組的mRNA和蛋白表達(dá)幾乎不表達(dá)；回補(bǔ)組細(xì)胞與沉默組細(xì)胞對(duì)比，mRNA和蛋白表達(dá)均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)。見圖1,2。

圖1 qRT-PCR法檢測(cè)GRHL2-KO及GRHL2-OE的mRNA表達(dá)情況,****P<0.0001

圖2 Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組細(xì)胞中GRHL2蛋白的表達(dá)情況

2.2 沉默GRHL2對(duì)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照與GRHL2-OE兩組細(xì)胞呈圓形或梭形，細(xì)胞之間排列緊密抱團(tuán)生長。而相比之下GRHL2-KO組細(xì)胞多呈梭狀形態(tài)，黏附能力降低，克隆中呈松散狀態(tài)均勻散布，且細(xì)胞間空泡較多(見圖3)。

圖3 顯微鏡下觀察對(duì)照組、GRHL2沉默組以及回補(bǔ)組細(xì)胞的形態(tài)變化

2.3 沉默GRHL2對(duì)于失巢凋亡的影響

失巢凋亡作為細(xì)胞死亡的一種形式，對(duì)于腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有著重要的作用。Calcein AM/EthD-1 熒光雙染法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比GRHL2沉默后，存活細(xì)胞率明顯增加〔Calcein AM:(147.25±20.06)% vs(343.50±6.62)%,P<0.001〕，失巢凋亡率明顯減少〔EthD-1:(72.12±9.19)% vs(53.96±5.35)%,P<0.01〕；GRHL2回補(bǔ)后存活細(xì)胞率明顯下降〔Calcein AM:(343.50±6.62)% vs(119.73±14.48)%，P<0.0001〕,細(xì)胞失巢凋亡率明顯回升〔EthD-1:(2.25±0.10)% vs(53.96±5.35)%，P<0.001〕。見圖4。

圖4 Calcein AM/EthD-1 熒光雙染法檢測(cè)GRHL2沉默及回補(bǔ)后細(xì)胞失巢凋亡的變化 **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001

2.4 沉默GRHL2對(duì)于細(xì)胞遷移的影響

為了探究GRHL2沉默后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的影響，先后進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲遷移實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)取0 h和48 h作為觀測(cè)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，48 h后GRHL2-KO組相較于對(duì)照組劃痕明顯變窄；回補(bǔ)組細(xì)胞相較于GRHL2-KO組的劃痕明顯更寬(見圖5)。侵襲遷移的結(jié)果顯示，GRHL2沉默組與對(duì)照組相比，細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)顯著降低(P<0.001)；回補(bǔ)組細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量明顯增加(P<0.001)(見圖6)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 劃痕實(shí)驗(yàn)顯示沉默GRHL2促進(jìn)細(xì)胞的遷移而回補(bǔ)組細(xì)胞抑制細(xì)胞遷移

圖6 侵襲遷移實(shí)驗(yàn)顯示沉默GRHL2增加HCT116細(xì)胞侵襲遷移能力而回補(bǔ)組細(xì)胞侵襲遷移能力下降

2.5 GRHL2表達(dá)沉默和基因回補(bǔ)對(duì)細(xì)胞內(nèi)E-cadherin、N-cadherin和RAB25表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，GRHL2-KO組的western blot結(jié)果顯示E-cadherin以及RAB25表達(dá)量明顯下降，而N-cadherin的表達(dá)增加；而在GRHL2基因回補(bǔ)組，E-cadherin以及RAB25的蛋白恢復(fù)表達(dá)，N-cadherin表達(dá)相對(duì)下降(見圖7)。

圖7 Western blot 檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin和RAB25蛋白表達(dá)情況

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的胃腸道腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。預(yù)計(jì)在2022年，結(jié)直腸癌占近一半 (48%) 的男性新發(fā)病例，對(duì)女性來說，乳腺癌、肺癌和結(jié)直腸癌占所有癌癥的 51%新發(fā)病例[15]。根據(jù)最新的基于國家癌癥中心(NCC)結(jié)直腸癌多學(xué)科專家小組設(shè)計(jì)的CorCCRES調(diào)查研究報(bào)告顯示，從2005年～2014年的10年間，我國人均結(jié)直腸癌相關(guān)支出上升了近2倍，且一經(jīng)確診就為晚期的結(jié)直腸癌患者比例有所增加[16]。

在結(jié)直腸癌中，EMT在腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中具有重要作用。來自臨床前和早期臨床研究的越來越多的證據(jù)表明，EMT 標(biāo)志物可能作為結(jié)直腸癌的預(yù)測(cè)因子和潛在的治療靶點(diǎn)[17]。癌細(xì)胞從原發(fā)性腫瘤中分離出來，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)生的細(xì)胞死亡被稱為失巢凋亡[18]，其在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等方面起重要作用。癌細(xì)胞具有逃避失巢凋亡的能力[18]，對(duì)失巢凋亡的抗性是高度侵襲性結(jié)直腸癌細(xì)胞的關(guān)鍵特征[19]。癌相關(guān)的成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs) 是腫瘤和宿主之間的一種微環(huán)境組分，研究者Schafer和其同事通過研究揭示了CAFs在通過分泌胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBPs)阻斷失巢凋亡中發(fā)揮的作用，通過利用IGFBPs的精確分子機(jī)制可以抑制失巢凋亡的發(fā)生[20]。作為“細(xì)胞自殺”的一種形式，細(xì)胞程序性死亡的失巢凋亡會(huì)殺死游離上皮細(xì)胞，但在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程，癌細(xì)胞必須抵抗失巢凋亡從而進(jìn)化表達(dá)蛋白質(zhì)TrkB受體，使他們能夠在失巢凋亡作用下生存[21]。目前關(guān)于失巢凋亡在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的分子機(jī)制仍不清楚。

粒狀頭樣2(graineyhead-like-2，GRHL2)是粒狀頭樣(graineyhead-like，GRHL)家族成員之一，作為一個(gè)新型轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[22-23]。在先前的綜述中，闡述了GRHL2在腫瘤中作為雙刃劍的作用[24]。GRHL2 已被證明可以抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[25- 26]。在EMT過程中，細(xì)胞的E-鈣黏蛋白被N-鈣黏蛋白取代，腫瘤細(xì)胞中的EMT過程的出現(xiàn)成為腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移最為關(guān)鍵的一步[27]。但GRHL2與結(jié)腸癌細(xì)胞EMT過程以及失巢凋亡的關(guān)系仍不清楚。本研究首次在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中采用CRISPR/Cas9對(duì)GRHL2進(jìn)行基因沉默。失巢凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GRHL2的沉默會(huì)抵抗結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞失巢凋亡，而回補(bǔ)GRHL2會(huì)恢復(fù)對(duì)失巢凋亡的敏感性。

蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示GRHL2的沉默抑制了EMT過程中的關(guān)鍵分子E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)了N-cadherin的表達(dá)，從而促進(jìn)了EMT的發(fā)生。同時(shí)，GRHL2的沉默抑制了其下游靶向基因RAB25[28]的表達(dá)，而RAB25的下調(diào)可通過調(diào)節(jié)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[29]，促進(jìn)細(xì)胞侵襲從而使細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。GRHL2的回補(bǔ)提示E-cadherin和RAB25的蛋白恢復(fù)，提示細(xì)胞的MET[30]過程。

綜上所述，通過CRISPR沉默GRHL2后失巢凋亡抗性增強(qiáng)，細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)；而回補(bǔ)GRHL2的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)這些過程。從而提示GRHL2是治療轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌的一個(gè)新潛在靶點(diǎn)。未來還需更多的研究來探究GRHL2作為靶點(diǎn)開發(fā)新型靶向療法的臨床價(jià)值。