姜梅杰，劉麗娟，趙書平*

(1.泰安市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 泰安 271000；2.濟(jì)南市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 271100)

大腸埃希菌是院內(nèi)感染重要病原菌之一。中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測顯示，大腸埃希菌分離率位居第一位[1]。目前，碳青霉烯類抗菌藥物是臨床治療由腸桿菌引起的感染常用抗菌藥物，但隨著此類藥物的大量使用，耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌(CRE)的檢出率也逐年增高，由于各地區(qū)抗生素應(yīng)用習(xí)慣及院感防控措施的不同，各地區(qū)的檢出率、耐藥機(jī)制及分子流行病學(xué)特征也有一定差異，給臨床經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療帶來了極大的困難。為尋找院內(nèi)大腸埃希菌對碳青霉烯類菌藥物耐藥的原因，防止院內(nèi)多重耐藥大腸埃希菌在院內(nèi)傳播流行，對泰安市中心醫(yī)院2020年6月-2020年12月臨床分離的10株非重復(fù)亞胺培南耐藥的大腸埃希菌(IREC)分布、耐藥性及分子流行病學(xué)特征進(jìn)行了分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株來源收集泰安市中心醫(yī)院2020年6-12月住院患者臨床分離到的非重復(fù)耐碳青霉烯大腸埃希氏菌(亞胺培南或美羅培南MIC≥2 mg/L)，所有菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)采用BD hoenixTM100

NMIC/ID-4復(fù)合板進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性檢測，用K-B紙片擴(kuò)散法補(bǔ)充檢測頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢曲松、頭孢頭孢唑林、頭孢呋辛、厄他培南的敏感性，肉湯稀釋法補(bǔ)充替加環(huán)素的敏感性，藥敏試驗(yàn)執(zhí)行2020CLSI標(biāo)準(zhǔn)。其中替加環(huán)素敏感性試驗(yàn)執(zhí)行FDA的標(biāo)準(zhǔn)，頭孢哌酮/舒巴坦敏感性試驗(yàn)執(zhí)行CLSI中頭孢哌酮的標(biāo)準(zhǔn)。M-H瓊脂和藥敏紙片均為英國Oxoid產(chǎn)品。銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.3 臨床資料收集采用回顧性分析方法收集耐藥菌感染患者的臨床資料，包括標(biāo)本來源、科室分布、基礎(chǔ)疾病、抗生素應(yīng)用、是否有創(chuàng)傷性操作、呼吸機(jī)的應(yīng)用情況等。

1.4 碳青霉烯酶檢測-改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)依據(jù)CLSI M100S-28th文件的改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)，mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)篩選碳青霉烯酶產(chǎn)酶菌株。

1.5 碳青霉烯耐藥基因檢測及測序結(jié)果采用煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)方法檢測碳青霉烯酶類相關(guān)耐藥基因。碳青霉烯酶類相關(guān)耐藥基因引物參照文獻(xiàn)[2]。PCR陽性產(chǎn)物送青島睿博興科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上查詢。

1.6 多位點(diǎn)序列分型分析(MLST)大腸埃希菌MLST擴(kuò)增管家基因引物序列參照網(wǎng)站：

http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html對大腸埃希菌的7個管家基因(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)進(jìn)行序列擴(kuò)增并測序。PCR反應(yīng)體系為：引物各10 pmol，含MgCl2的Dntp8 μl，10×Buffer 25 μl,Taq酶0.5 μl,約0.1 μg基因組DNA作為模板，無菌純水補(bǔ)足使總體積為50 μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min,1個循環(huán)；94℃變性1 min,退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃充分度延伸5 min，1個循環(huán)。測序結(jié)果與MLST網(wǎng)站(http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli)數(shù)據(jù)庫比對，確定序列類型(sequence ST)。

1.7 脈沖場瓊脂糖凝膠電泳(PFGE )使用限制性內(nèi)切酶XbaI對染色體DNA進(jìn)行消化，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：14℃，電壓6 V/cm，相對分子質(zhì)量50-400 kb,電場夾角120℃,脈沖4-40 S，電泳時間20 h。EB染色30 min后在紫外燈下觀察結(jié)果，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像，Bionumeric軟件分析，作出進(jìn)化樹分析菌株親緣性，各菌株間相似性大于85%判斷為同一克隆株。

1.8 統(tǒng)計分析用WHONET5.6軟件進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料2020年6-12月共收集10株(檢出率為2.3%)非重復(fù)耐碳青霉烯大腸埃希氏菌(亞胺培南或美羅培南MIC≥2 mg/L)，主要來源于尿液標(biāo)本，其中4株來源于ICU、3株來源腎內(nèi)科、2株來源于康復(fù)科、1株來源于全科醫(yī)學(xué)。具體臨床資料見表1。

表1 臨床資料

2.2 藥敏試驗(yàn)及改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)檢測結(jié)果10株IRCE菌株對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮鈉/舒巴坦鈉、阿莫西林/克拉維酸、美羅培南、厄他培南、亞胺培南、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星均耐藥。有1株對慶大霉素、阿米卡星、氨曲南敏感，其余9株對慶大霉素、阿米卡星、氨曲南都耐藥。來源于尿液標(biāo)本中的8株菌株，有6株對呋喃妥因敏感，其余2株對呋喃妥因耐藥。對替加環(huán)素、多粘菌素B 100%敏感。10株IRCE菌株碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)mCIM試驗(yàn)及eCIM試驗(yàn)均為陽性，即均產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶，與PCR結(jié)果一致(見表2)。

表2 10株IRCE菌株對抗菌藥物的MIC值(μg/ml)及mCIM、eCIM結(jié)果

2.3 碳青霉烯酶類耐藥基因及測序結(jié)果10株IRCE菌株中，100%(10/10)的PCR擴(kuò)增出NDM基因目標(biāo)片段(見圖1)，經(jīng)測序分析2株為NDM-1金屬酶基因(見圖2)、8株為NDM-5金屬酶基因(見圖3)。未檢出A類、D類碳青霉烯酶。

圖1 NDM 基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果

圖2 NDM-1金屬酶基因測序圖

圖3 NDM-5金屬酶基因測序圖

2.4 MLST分子分型及PFGE同源性分析結(jié)果10株IRCE菌株MLST分子分型共檢出3個ST型，分別為ST405(6/10)、ST167(3/10)、ST131(1/10),ST405是主要的序列類型，其次為ST167。PFGE同源性分析共分為5個克隆群，分別為A群(菌株10)、B群(菌株5)、C群(菌株9)、D群(菌株4)、E群(菌株1、2、3、6、7、8)，均為ST405型。詳見圖4。

圖4 10株大腸埃希氏菌株P(guān)FGE聚類分析

3 討論

大腸埃希菌是院內(nèi)感染常見的致病菌。本研究對2020年6-12月期間臨床分離的425株非重復(fù)大腸埃希菌中進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，其中56.5%來自尿液標(biāo)本，其次是血液和痰液標(biāo)本，IREC檢出率為2.3%，略高于以往研究[3]和全國報道一致[1]。近年來泰安市中心醫(yī)院IRCE菌株檢出率雖然沒有明顯增高，但是其耐藥性嚴(yán)重，已給臨床抗感染治療帶來極大困難。本研究結(jié)果顯示IRCE菌株主要分布于重癥醫(yī)學(xué)科(4/10)和腎內(nèi)一科(3/10)，耐藥菌檢出前均有三代、四代頭孢菌素或碳青霉烯類抗菌藥物應(yīng)用史，其中有8例患者在耐藥菌檢出前曾有過機(jī)械通氣、尿路或靜脈置管等創(chuàng)傷性操作。IRCE主要來源于尿液標(biāo)本(8/10)，其中4例感染無臨床癥狀，被臨床認(rèn)定為定植菌，均來源于尿液標(biāo)本。10株IREC對臨床常用藥物β-內(nèi)酰胺類及加酶抑制劑、喹諾酮類、氨基糖苷類抗菌藥物均表現(xiàn)出了高水平多重耐藥的特性，只有1株菌株對慶大霉素、阿米卡星、氨曲南敏感。8株來自于尿液的菌株,6株對呋喃妥因敏感，因此臨床治療IRCE菌引起的泌尿道感染應(yīng)慎重，應(yīng)首選呋喃妥因作為經(jīng)驗(yàn)性用藥。未發(fā)現(xiàn)對替加環(huán)素和多粘菌素耐藥的菌株，但替加環(huán)素在尿液中藥物濃度低，不建議治療泌尿道感染。有研究報道，CPE感染病例中定植史的比例占65%[4]，80%的尿培養(yǎng)CPE陽性患者沒有臨床癥狀[5]，主動篩查院內(nèi)重點(diǎn)科室碳青霉烯酶腸桿菌(CPE)定植率是下一步預(yù)防控制CRE感染的研究方向。

碳青霉烯酶是能夠引起亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物敏感性降低的β-內(nèi)酰胺酶，包括A、B、D 3類[6]。KPC是A類碳青霉烯酶，NDM是金屬β內(nèi)酰胺酶。有報道耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌僅產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶[7-8]。山東地區(qū)耐碳青霉烯類抗菌藥物的大腸埃希菌主要攜帶NDM-5金屬酶基因[9-10]。本研究10株IREC 2株攜帶blaNDM-1、8株攜帶blaNDM-5,均屬于B類金屬酶，與報道[7-8]相同。mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)篩選碳青霉烯酶和金屬酶與PCR結(jié)果一致。阿維巴坦作為新一代β-內(nèi)酰胺類加酶抑制對A類絲氨酸碳青霉烯酶具有較好抑制作用，但對B類金屬酶缺乏活性[11]，所以出現(xiàn)IRCE感染病例不適合經(jīng)驗(yàn)性使用新型抗菌藥物孢他啶-阿維巴坦治療。10株大腸埃希菌MLST分子分型共檢出3個ST型，ST405是主要的序列類型，6株，其次為ST167，3株。PFGE同源性分析共分為5個克隆群，A、B、C、D、E群。6株MLST分型為ST405均屬于E克隆群，其中4株直接來源于重癥醫(yī)學(xué)科患者，其余2株分別來源于康復(fù)科和神經(jīng)內(nèi)三科的患者，均有出入重癥醫(yī)學(xué)科的轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)出記錄，最早檢出菌株來源于重癥醫(yī)學(xué)科。表明院內(nèi)存在E群ST405型大腸埃希氏菌克隆傳播。3株ST167型菌株分別來源于腎內(nèi)一科(2株)和康復(fù)科(1株)，但分別屬于A群、B群、C群不同克隆群。腎內(nèi)一科檢出的3株CREC株分別屬于A群、C群和D群不同克隆群,不存在克隆傳播。

綜上所述，院內(nèi)IREC耐藥性嚴(yán)重，以攜帶blaNDM-5和NDM-1為主，主要流行于重癥醫(yī)學(xué)科和腎內(nèi)科，尿液標(biāo)本是其主要來源。院內(nèi)存在E群ST405型大腸埃希氏菌克隆傳播。應(yīng)進(jìn)一步規(guī)范抗菌藥物的合理應(yīng)用，減少多重耐藥菌的產(chǎn)生，加強(qiáng)重癥醫(yī)學(xué)科的消毒隔離及該科室轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)出多重耐藥菌患者的管理，控制傳播途徑，預(yù)防院內(nèi)感染爆發(fā)。主動篩查院內(nèi)重點(diǎn)科室碳青霉烯酶腸桿菌(CPE)定植率是下一步預(yù)防控制CRE感染的研究方向。