徐夕冶 柳迪 唐麗

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生命組學(xué)研究所)

惡性腫瘤起源于獲得特定遺傳改變的單個(gè)體細(xì)胞，其發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜且不斷適應(yīng)的過(guò)程[1]，該過(guò)程涉及到許多腫瘤細(xì)胞本身功能的改變，包括細(xì)胞分化狀態(tài)、端粒維持、細(xì)胞增殖控制、營(yíng)養(yǎng)環(huán)境變化適應(yīng)、血管生成能力、避免細(xì)胞死亡等[2]。免疫系統(tǒng)的生理功能之一是在腫瘤形成后對(duì)其進(jìn)行殺傷，在腫瘤細(xì)胞和免疫系統(tǒng)博弈的過(guò)程中有一部分腫瘤細(xì)胞可逃避免疫系統(tǒng)的殺傷，塑造免疫抑制性微環(huán)境，獲得免疫監(jiān)視適應(yīng)，最終產(chǎn)生一些原有腫瘤所不具備的生物學(xué)特性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[3-7]。已有研究表明，體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生的腫瘤，在外界藥物刺激下可逐漸進(jìn)化[4]，相較之下，機(jī)體自身因素對(duì)腫瘤進(jìn)化的作用尚不十分清楚。本研究誘導(dǎo)相同腫瘤模型但惡性程度不同的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)特征基因的表達(dá)水平、體外增殖能力以及體內(nèi)成瘤能力評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞惡性程度，分析其惡性程度與腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞表型的相關(guān)性，并首次探究機(jī)體自身因素導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞惡性化過(guò)程中，介導(dǎo)免疫抑制性微環(huán)境形成的關(guān)鍵免疫細(xì)胞亞群?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源

6～8周齡C57BL/6小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2021-0006，動(dòng)物飼養(yǎng)于北京國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心動(dòng)物房SPF級(jí)環(huán)境中。

1.2 主要試劑

CCK8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自金普來(lái)公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買于日本TaKaRa公司，熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購(gòu)自日本TOYOBO公司，抗小鼠CD163-PerCP-eFlour710、Foxp3-FITC、IFNγ-PE、CTLA-4-APC、PD-1-APC-eFlour?780、Granzyme B-FITC抗體購(gòu)買于美國(guó)Thermo Fisher公司，抗小鼠Ly6G-PE、CD11b-BUV395、CD3-BV421、NK1.1-BV510、CD4-PE-Cy7抗體購(gòu)買于美國(guó)BD公司，抗小鼠CD16/CD32、F4/80-APC、CD11c-PE-Cy7、Ly6C-FITC、CD45-redFluorTM710抗體及死活染料購(gòu)買于美國(guó)Tonbo公司，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3 細(xì)胞系來(lái)源、培養(yǎng)及傳代

原始Hepa1-6小鼠肝癌細(xì)胞系購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。將5×105個(gè)原始Hepa1-6細(xì)胞種植到C57BL/6小鼠皮下，30 d后流式分選荷瘤小鼠瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后獲得一輪馴化細(xì)胞系Hepa1-6-A。將5×105個(gè)Hepa1-6-A細(xì)胞種植到C57BL/6小鼠皮下，30 d后流式分選荷瘤小鼠瘤內(nèi)腫瘤細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)后獲得二輪馴化細(xì)胞系Hepa1-6-B。

將細(xì)胞置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用含質(zhì)量濃度100 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，加入胰酶消化。消化2～3 min后顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈圓形時(shí)加入等體積含質(zhì)量濃度100 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化。混勻成單細(xì)胞懸液后轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，加入適量含質(zhì)量濃度100 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，按1∶2比例傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 采用qPCR法檢測(cè)3種細(xì)胞系當(dāng)中己糖激酶2(HK2)、堿性螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Twist1)、波形蛋白(VIM)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)、細(xì)胞周期蛋白B1(CCNB1)及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)mRNA表達(dá)

通過(guò)QIAGEN RNA提取試劑盒和自動(dòng)核酸提取儀分別提取3種細(xì)胞的RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲取cDNA，以cDNA作為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。以GPDH為內(nèi)參分析目的基因表達(dá)。引物名稱及其序列見(jiàn)表1。

表1 引物名稱及其序列Tab.1 Primer names and sequences

1.5 CCK-8法檢測(cè)3種細(xì)胞增殖能力

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后制備細(xì)胞懸液(2×108個(gè)/L)，接種在96孔板中(0.1 mL/孔)，培養(yǎng)4 h待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，每孔中加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，以酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度值，以吸光度值代表細(xì)胞增殖能力。

1.6 小鼠腫瘤模型的建立

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞2次后計(jì)數(shù)，于每只小鼠右側(cè)脅部皮下注射0.1 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量為1×106或5×105個(gè)，按照注入腫瘤細(xì)胞的不同對(duì)小鼠進(jìn)行分組，Hepa1-6組8只，Hepa1-6-A組10只，Hepa1-6-B組13只，建模后定期觀察各組小鼠的狀態(tài)。

1.7 腫瘤體積及質(zhì)量測(cè)定

建模當(dāng)天為第0天，從第4天開(kāi)始，每隔2天用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮下種植腫瘤的長(zhǎng)徑(a)及與之垂直的短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=a×b2/2 mm3，測(cè)量至第16天，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。建模第16天，小鼠脫頸處死，剖離腫瘤組織，剔除周圍脂肪和結(jié)締組織后進(jìn)行稱量，記錄腫瘤質(zhì)量。

1.8 腫瘤組織流式檢測(cè)樣本的制備

將1.7中剖離的腫瘤組織放至1 mL含1 g/L膠原酶和100 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)基之中[5]，將腫瘤組織剪碎，并置于37 ℃溫箱中進(jìn)行消化。20 min后吹散組織，吸取少量上清液至培養(yǎng)皿中，置于顯微鏡下觀察消化情況，當(dāng)鏡下出現(xiàn)大量大小不一的細(xì)胞時(shí)，則加入1 mL含有100 g/L FBS的 DMEM培養(yǎng)基終止消化。吹散組織，濾網(wǎng)過(guò)濾，在4 ℃下1 526 r/min離心5 min以后棄上清液，加入適量1×紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，1 min以后用等體積含100 g/L FBS的DMEM培養(yǎng)基終止紅細(xì)胞裂解，再經(jīng)1 526 r/min離心3 min后，用 PBS洗滌細(xì)胞2次后，棄上清液進(jìn)行后續(xù)流式抗體標(biāo)記。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織免疫細(xì)胞亞群

用Fc-Shield封閉細(xì)胞上的Fc受體，防止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與細(xì)胞的非特異性結(jié)合。細(xì)胞與表面標(biāo)記抗體在4 ℃下孵育30 min，按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)記死活染料，排除死細(xì)胞。對(duì)于需要進(jìn)行胞內(nèi)抗體標(biāo)記的標(biāo)志物叉頭框蛋白P3(Foxp3)、Ⅱ型干擾素(IFNγ)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)和顆粒酶B(Granzyme B)，先固定破膜后再加入抗體避光孵育30 min，孵育后用固定破膜Buffer洗滌細(xì)胞，1 526 r/min離心3 min后加0.2 mL Buffer重懸沉淀并轉(zhuǎn)移至流式上樣管。使用BD Fortessa流式細(xì)胞儀對(duì)1.2中所列流式抗體對(duì)應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，用FlowJo軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7和SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析(任意兩組間比較采用q檢驗(yàn))，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組不同時(shí)間比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩變量之間的關(guān)系采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組細(xì)胞系中各基因表達(dá)水平比較

qPCR結(jié)果顯示,各組間HK2、BCL-2 mRNA表達(dá)水平比較差異具有顯著性(F=22.557、34.604，P<0.05)，與Hepa1-6細(xì)胞相比較，Hepa1-6-A和Hepa1-6-B細(xì)胞中以上基因表達(dá)水平顯著增高(q=6.658～12.327，P<0.05)。此外，各組間的VIM、Twist1、CCNB1和M-CSFmRNA表達(dá)水平比較差異具有顯著性(F=10.897～195.234，P<0.05)，與Hepa1-6和Hepa1-6-A細(xì)胞相比，Hepa1-6-B細(xì)胞中以上基因表達(dá)水平均呈顯著增高(q=4.692～22.190，P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組細(xì)胞系中各基因表達(dá)水平比較Tab.2 Comparison of gene expression levels between the three groups of cells

2.2 3組細(xì)胞系增殖能力比較

CCK8檢測(cè)結(jié)果顯示，Hepa1-6、Hepa1-6-A和Hepa1-6-B細(xì)胞吸光度值分別為1.13±0.08、1.18±0.11、3.43±0.21，組間比較差異具有顯著意義(F=645.459，P<0.05)，與Hepa1-6、Hepa1-6-A細(xì)胞相比，Hepa1-6-B細(xì)胞體外增殖能力更強(qiáng)(q=37.585、40.357，P<0.05)，Hepa1-6和Hepa1-6-A細(xì)胞的增殖能力比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.3 3組細(xì)胞系構(gòu)建小鼠腫瘤模型后腫瘤生長(zhǎng)情況比較

以小劑量腫瘤細(xì)胞(5×105)構(gòu)建Hepa1-6腫瘤模型后，小鼠第6天荷瘤率為0，以大劑量腫瘤細(xì)胞(1×106)構(gòu)建Hepa1-6腫瘤模型后，小鼠第6天荷瘤率可達(dá)90%，而小劑量腫瘤細(xì)胞(5×105)構(gòu)建小鼠Hepa1-6-A、Hepa1-6-B腫瘤模型，小鼠第6天荷瘤率即達(dá)100%。重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果顯示，時(shí)間、組別及時(shí)間與組別交互作用對(duì)腫瘤體積具有明顯影響(F時(shí)間=26.977，F(xiàn)組別=127.599，F(xiàn)交互=4.613，P<0.05)，Hepa1-6-B組腫瘤生長(zhǎng)從第6天起明顯快于Hepa1-6-A組(F=8.033～43.418，P<0.05)。見(jiàn)表3。Hepa1-6、Hepa1-6-A和Hepa1-6-B組第16天腫瘤質(zhì)量分別為(0.29±0.12)、(0.36±0.20)、(0.72±0.19)g，組間腫瘤質(zhì)量比較差異具有顯著性(F=18.898，P<0.05)，Hepa1-6-B組腫瘤質(zhì)量明顯高于Hepa1-6和Hepa1-6-A組(q=6.379、8.099，P<0.05)。

表3 不同時(shí)間點(diǎn)3組細(xì)胞系皮下種植腫瘤體積比較Tab.3 Comparison of the volume of subcutaneously implanted tumor between the three groups of cells at different time points

2.4 3組細(xì)胞系皮下種植腫瘤浸潤(rùn)髓系細(xì)胞差異比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與Hepa1-6-A組腫瘤相比，Hepa1-6-B組腫瘤組織中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，單核細(xì)胞比例明顯降低(t=4.032,P<0.05)，巨噬細(xì)胞比例明顯升高(t=2.929,P<0.05)，發(fā)揮促腫瘤功能的M2型CD163+巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞比例明顯升高(t=2.619、2.870,P<0.05)，詳見(jiàn)表4；Pearson相關(guān)性分析顯示，CD163+巨噬細(xì)胞與CD206+巨噬細(xì)胞比例和腫瘤體積呈正相關(guān)(r=0.669、0.736，P<0.05)。

表4 3組細(xì)胞系皮下種植腫瘤浸潤(rùn)髓系細(xì)胞比例比較Tab.4 Comparison of the percentage of tumor-infiltrating myeloid cells in subcutaneously implanted tumor between the three groups of cells

2.5 3組細(xì)胞系皮下種植腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞差異比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與Hepa1-6-A組相比，Hepa1-6-B組腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞功能性標(biāo)志物IFNγ、Granzyme B的表達(dá)水平均顯著降低(t=2.358、3.076,P<0.05)，Treg細(xì)胞比例比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，但I(xiàn)FNγ+CD8+T/Treg明顯降低(t=2.430,P<0.05)。Hepa1-6-B組腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞抑制性標(biāo)志物CTLA-4表達(dá)水平與Hepa1-6-A組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)，但程序性死亡受體1(PD-1)表達(dá)水平呈顯著升高(t=3.693,P<0.05)。見(jiàn)表5。無(wú)論是Hepa1-6-A組腫瘤還是Hepa1-6-B組腫瘤，PD-1+CD8+T細(xì)胞比例與腫瘤體積均無(wú)明確相關(guān)性(P>0.05)。

表5 3組細(xì)胞系皮下種植腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞比例比較Tab.5 Comparison of the percentage of tumor-infiltrating lymphocytes in subcutaneously implanted tumor between the three groups of cells

3 討 論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)可以對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮監(jiān)視作用，并對(duì)其進(jìn)行特異性清除，然而當(dāng)腫瘤細(xì)胞在各種因素的作用下逃脫機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視時(shí)，腫瘤的惡性化會(huì)進(jìn)一步加快，從而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[6,8]。目前關(guān)于機(jī)體自身因素介導(dǎo)的腫瘤惡性化與免疫抑制性形成的相關(guān)性報(bào)道尚少，同時(shí)，腫瘤細(xì)胞惡性化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的免疫細(xì)胞亞群也未見(jiàn)相關(guān)研究。

本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠腫瘤模型誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡性化，原始Hepa1-6腫瘤細(xì)胞經(jīng)一輪體內(nèi)建模獲得Hepa1-6-A細(xì)胞系，Hepa1-6-A細(xì)胞系經(jīng)二輪建模獲得Hepa1-6-B細(xì)胞系。糖酵解關(guān)鍵酶HK2的表達(dá)與活性可影響腫瘤細(xì)胞糖酵解，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞增殖[9-10]。BCL-2可抑制細(xì)胞凋亡，其過(guò)度表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)大多數(shù)細(xì)胞毒素的抵抗性[11-12]。本研究的結(jié)果顯示，與Hepa1-6細(xì)胞相比較，Hepa1-6-A和Hepa1-6-B細(xì)胞中HK2、BCL-2 mRNA表達(dá)水平均顯著增高，提示體內(nèi)成瘤提升腫瘤細(xì)胞的生存能力。EMT是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，Twist1通過(guò)調(diào)節(jié)間質(zhì)叉頭蛋白1促進(jìn)EMT的發(fā)生[13-14]，VIM表達(dá)上調(diào)并通過(guò)改變細(xì)胞形狀和運(yùn)動(dòng)促成EMT[15]；CCNB1是在有絲分裂過(guò)程中起調(diào)控作用的周期蛋白[16]，并且在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，其mRNA表達(dá)水平是影響肝癌患者總生存期和無(wú)病生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]。本研究表明，與Hepa1-6和Hepa1-6-A細(xì)胞相比，Hepa1-6-B細(xì)胞中VIM、Twist1、CCNB1 mRNA表達(dá)水平顯著增高。同時(shí)，Hepa1-6-B細(xì)胞體外增殖能力與體內(nèi)成瘤速度均顯著高于Hepa1-6及Hepa1-6-A細(xì)胞。以上數(shù)據(jù)表明，經(jīng)體內(nèi)二次成瘤后，Hepa1-6-B細(xì)胞的惡性程度顯著增強(qiáng)。上述體內(nèi)成瘤介導(dǎo)的腫瘤惡性化反映了相同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)由低惡性轉(zhuǎn)變?yōu)楦邜盒缘淖匀蛔兓^(guò)程，因此利用該模型有可能從機(jī)體自身角度探討腫瘤細(xì)胞惡性化的機(jī)制。

腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的表型和功能與腫瘤惡性程度直接相關(guān)。單核細(xì)胞可從脈管系統(tǒng)外滲到原發(fā)腫瘤部位，通過(guò)細(xì)胞因子介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和吞噬作用直接殺死腫瘤細(xì)胞從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。微環(huán)境因素同時(shí)促使單核細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)，繼而形成抗腫瘤型TAM以及促腫瘤型TAM[18]，后者通常以CD163或者CD206作為標(biāo)志物[19-21]。本研究結(jié)果顯示，Hepa1-6-B組腫瘤組織中單核細(xì)胞比例明顯降低，巨噬細(xì)胞特別是促腫瘤型CD163+巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞比例顯著增高。更為重要的是，在Hepa1-6-B細(xì)胞腫瘤模型中，CD163+巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞比例與腫瘤體積呈正相關(guān)，但在Hepa1-6-A細(xì)胞腫瘤模型中，兩者卻無(wú)明確相關(guān)性。此外，本研究結(jié)果顯示，與Hepa1-6和Hepa1-6-A細(xì)胞相比，Hepa1-6-B細(xì)胞中促進(jìn)巨噬細(xì)胞存活及分化的M-CSFmRNA表達(dá)水平顯著升高[22]，初步提示腫瘤細(xì)胞與巨噬細(xì)胞形成的細(xì)胞間動(dòng)態(tài)相互作用環(huán)路可能是影響腫瘤惡性程度的重要因素。

腫瘤抗原經(jīng)抗原提呈細(xì)胞呈遞后，T細(xì)胞成為腫瘤殺傷功能的主要執(zhí)行者[23-25]。本研究結(jié)果表明，Hepa1-6-B腫瘤組織中細(xì)胞毒性IFNγ+CD8+T細(xì)胞、Granzyme B+CD8+T細(xì)胞比例以及IFNγ+CD8+T/Treg均顯著降低，說(shuō)明腫瘤惡性進(jìn)展中CD8+T細(xì)胞逐步喪失活性。PD-1作為免疫檢查點(diǎn)與其配體結(jié)合后抑制CD8+T細(xì)胞增殖、活化和細(xì)胞毒性因子的分泌，促進(jìn)T細(xì)胞耗竭[26-27]，其表達(dá)水平是微環(huán)境免疫抑制性的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[28-30]。本研究結(jié)果顯示，與Hepa1-6-A組腫瘤組織相比，Hepa1-6-B組腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，但無(wú)論是Hepa1-6-A組腫瘤還是Hepa1-6-B組腫瘤，PD-1+CD8+T細(xì)胞比例與腫瘤體積均無(wú)明確相關(guān)性。PD-1表達(dá)的增高可能是腫瘤惡性進(jìn)展的結(jié)果而不是原因，但促腫瘤型CD163+巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞可能是機(jī)體自身因素導(dǎo)致腫瘤惡性化的原因之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，經(jīng)二次體內(nèi)成瘤后，Hepa1-6-B腫瘤細(xì)胞惡性相關(guān)基因表達(dá)水平顯著增高，體外增殖能力與體內(nèi)成瘤速度明顯提升，體現(xiàn)出機(jī)體自身因素導(dǎo)致的腫瘤惡性化過(guò)程，在腫瘤惡性化的同時(shí)可增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制性，其中促腫瘤型CD163+巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞與免疫抑制性的形成存在顯著相關(guān)性。后續(xù)還需對(duì)體內(nèi)成瘤介導(dǎo)的腫瘤惡性化的原因及其調(diào)控促腫瘤型CD163+巨噬細(xì)胞和CD206+巨噬細(xì)胞的具體機(jī)制進(jìn)行更深入探究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

ConflictsofInterest： All authors disclose no relevant conflicts of interest.

倫理批準(zhǔn)和動(dòng)物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(文件號(hào)IACUC202002-27-05M)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程均嚴(yán)格按照3R原則進(jìn)行。

EthicsApprovalandAnimalRight： All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by National Center for Protein Sciences·Beijing (Approval Letter No. IACUC-20200227-05M), and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines of 3R.

作者貢獻(xiàn)：徐夕冶、柳迪參與了研究設(shè)計(jì)；徐夕冶、柳迪和唐麗參與了論文的寫(xiě)作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。

Contributions： The study was designed byXUXiyeandLIUDi. The manuscript was drafted and revised byXUXiye,LIUDi, andTANGLi. All the authors have read the last version of the paper and consented submission.