劉永飛，蘇偉，梁琪琪，李青云，2，劉幽燕，2，唐愛星，2

（1 廣西大學化學化工學院，廣西 南寧 530004；2 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530007）

-蒎烯（-pinene，CH）是我國的優(yōu)勢資源松節(jié)油的主要成分，是自然界中存在量最多的單萜烯烴之一。-蒎烯可以通過化學法、生物法和化學酶法等方法合成-蒎烯環(huán)氧化物（也叫2,3-環(huán)氧蒎烷），這是一種具有清涼氣息的重要香料中間體，可進一步合成兩百多種香料或有生理活性的精細化學品。當前工業(yè)化的-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)用強酸作為催化劑，反應(yīng)速度快，但常伴隨著許多副反應(yīng)的發(fā)生，而且酸易造成設(shè)備腐蝕。酶催化具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高的特點，但直接使用酶催化烯烴環(huán)氧化往往需要使用相對昂貴的單加氧酶類，如細胞色素P450、葡萄糖單加氧酶等。而化學酶法環(huán)氧化使用相對廉價的脂肪酶做催化劑，反應(yīng)一共分為兩步：首先?；w（脂肪酸或脂肪酸酯）和過氧化氫在脂肪酶的催化下生成過氧羧酸，然后依據(jù)Prileshajev 反應(yīng)原理，過氧羧酸自催化烯烴生成環(huán)氧化物（如圖1）。由于化學酶法環(huán)氧化結(jié)合了化學法和生物法的優(yōu)點，得到了研究者的廣泛關(guān)注。

圖1 脂肪酶催化α-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)的機理

目前，化學酶法蒎烯環(huán)氧化的研究基本都是在兩相體系中進行的，-蒎烯、酰基供體等疏水性底物溶解在有機溶劑（例如甲苯）中，與氧化劑過氧化氫水溶液構(gòu)成有機-水“雙相”反應(yīng)體系。但雙相反應(yīng)體系受制于兩相間的傳質(zhì)速率影響，導致環(huán)氧化反應(yīng)速率低，而且還存在著酶與高濃度的水相過氧化氫直接接觸易失活的問題。一些研究者通過改變反應(yīng)物濃度、?；w類型等因素，可以部分優(yōu)化環(huán)氧化反應(yīng)性能；而Bhalerao 等在研究脂肪酶催化大豆油環(huán)氧化反應(yīng)時，為了加快環(huán)氧化反應(yīng)速度，運用超聲輔助的方法來強化界面處過氧化氫的物質(zhì)傳輸。然而，由于水相高濃度過氧化氫的存在，雙相體系中固定化脂肪酶的穩(wěn)定性仍然面臨挑戰(zhàn)。有研究人員采用尿素-過氧化氫（UHP）取代含水的過氧化氫水溶液，通過過氧化氫的緩慢釋放降低對酶的毒害作用，提高了脂肪酶的穩(wěn)定性。此外，Meyer 等還設(shè)計了一種蒎烯環(huán)氧化的連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器，以預(yù)飽和過氧化氫的乙酸乙酯作為反應(yīng)器的流動相。由于沒有水性過氧化氫，反應(yīng)器可以穩(wěn)定運行17 天，轉(zhuǎn)化率約為60%。這些實驗成功地提高了固定化脂肪酶的穩(wěn)定性，但犧牲了環(huán)氧化反應(yīng)效率。周鵬飛等報道了一種天然低共熔溶劑（DES）體系，可以將烯烴、?；w和過氧化氫融在一起形成單相體系，以Novozym435催化環(huán)氧化時轉(zhuǎn)化率最高為72.4%。雖然DES 體系中也存在著脂肪酶易失活和流動性低的問題，但是構(gòu)建單相體系的方法提供了一個解決問題的思路。

水互溶性有機溶劑，如醇類、乙腈、丙酮等，既可以與水互溶，也能溶解疏水性有機物，可以使烯烴環(huán)氧化反應(yīng)的疏水性底物與水性過氧化氫較好地融為一體，構(gòu)建單相反應(yīng)體系。雖然過去通常認為親水性有機溶劑易于奪取酶的結(jié)合水從而使酶失活，但是近年來的研究表明，帶羥基官能團的溶劑可以導致酶的活化，而且酶的穩(wěn)定性與羥基的數(shù)量和位置有關(guān)。Zhao等觀察到南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）在叔丁醇溶液中高效的催化活性，而且叔丁醇對酶的抑制性較小，作為酯化反應(yīng)底物的反應(yīng)性也較低。分子動力學模擬表明，CALB在叔丁醇中的高相容性是由幾個原因造成的，例如叔丁醇中蛋白質(zhì)的高彈性、維持良好的底物入口大小和酶的結(jié)合口袋大小，以及酶活性中心Ser105的氫鍵保護。本文嘗試采用叔丁醇為溶劑，構(gòu)建蒎烯環(huán)氧化的單相體系，以期消除界面影響，降低水性過氧化氫對酶的失活，提高蒎烯環(huán)氧化的效率，再根據(jù)單相體系脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的特性，設(shè)計適用于單相體系的-蒎烯環(huán)氧化的反應(yīng)器，探索其工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

1 實驗

1.1 實驗材料

-蒎烯和十二烷，分析純，阿拉?。籒ovozym435 購自諾維信生物技術(shù)有限公司；-蒎烯環(huán)氧化物，GC 標準品，Extrasynthese（法國）；過氧化氫（30%），分析試劑級，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯，分析純，中國大茂化學試劑廠；檸檬酸三鈉二水合物（NaCHO），分析純，西隴科學股份有限公司；碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 叔丁醇體系脂肪酶催化α-蒎烯環(huán)氧化的條件優(yōu)化

配制含-蒎烯0.3mol/L、乙酸乙酯3.5mol/L 和0.5mol/L 過氧化氫（30%）的2mL 叔丁醇溶液，再在溶液中加入0.6mmol 束酸劑（檸檬酸三鈉）和40mg Novozym435，置于平行合成儀中，40℃、150r/min 下反應(yīng)90min 后取樣，同時設(shè)置不含酶的空白組。將樣品在14000下離心5min，加入內(nèi)標液進行氣相分析測定轉(zhuǎn)化率和收率。

（1）乙酸乙酯濃度的影響 調(diào)整乙酸乙酯濃度分別為1～4mol/L，其余條件不變，考察?；w乙酸乙酯對蒎烯環(huán)氧化的影響。

（2）過氧化氫濃度的影響 調(diào)整過氧化氫濃度分別為0.2～1mol/L，其余條件不變，考察氧化劑過氧化氫對蒎烯環(huán)氧化的影響。

（3）束酸劑種類的影響 調(diào)整束酸劑種類分別為碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉和磷酸二氫鈉，其余條件不變，考察束酸劑對蒎烯環(huán)氧化的影響。

1.3 單相和雙相體系的環(huán)氧化反應(yīng)比較

單相體系：9mL 叔丁醇中含有-蒎烯（0.3mol/L）、乙酸乙酯（3.5mol/L），然后添加0.49mL 過 氧 化 氫（30%）， 隨 后 加 入180mg Novozym435和0.6mmol 檸檬酸三鈉，40℃置于平行合成儀中催化反應(yīng)，間隔取樣，氣相分析測定轉(zhuǎn)化率和收率。

甲苯-水雙相體系：9mL 甲苯中含有-蒎烯（0.3mol/L）、乙酸乙酯（3.5mol/L），然后添加0.49mL 過氧化氫（質(zhì)量分數(shù)30%），隨后加入180mg Novozym435 和0.6mmol 檸檬酸三鈉，40℃置于平行合成儀中催化反應(yīng)，間隔取樣，氣相分析測定轉(zhuǎn)化率和收率。

1.4 單相體系中脂肪酶的可重用性

按照1.2 節(jié)的反應(yīng)條件進行蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，在14000下離心5min，取100μL 溶液進行氣相分析，并分離固定化酶。在下一批次反應(yīng)之前，固定化脂肪酶按水-水-叔丁醇的順序洗滌。相對活力被定義為每批次使用的環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率與第一次轉(zhuǎn)化率的比率。

1.5 CSTR反應(yīng)器工藝條件優(yōu)化

在釜式反應(yīng)器中配制含0.3mol/L-蒎烯、適量過氧化氫（0.1～1.5mol/L）、適量乙酸乙酯（2～4mol/L）的叔丁醇溶液，加入適量固定化酶（0.5～3g）和1g 檸檬酸三鈉，水浴40℃，開攪拌運行反應(yīng)器，每隔半小時取反應(yīng)器內(nèi)的溶液200μL 待測，3h 后，泵運行，開始補充與初始相同濃度的底物溶液，產(chǎn)物從上口流出，保持進料和出料速度一致，繼續(xù)每隔0.5h取出口物料200μL待測。以反應(yīng)器達到穩(wěn)定狀態(tài)時的轉(zhuǎn)化率和收率數(shù)據(jù)作為該實驗條件下的實驗結(jié)果。

空白組對照：不加酶，其他條件不變，每隔0.5h測定進料和出料的-蒎烯濃度。

1.6 CSTR反應(yīng)器的長期運行性能

配制含0.3mol/L-蒎烯、0.5mol/L 過氧化氫、3.5mol/L 乙酸乙酯的叔丁醇溶液作為反應(yīng)器流動相，在釜式反應(yīng)器中加入2.0g 固定化酶和1g 檸檬酸三鈉，設(shè)定物料流率為0.27mL/min（即物料平均停留時間3h），水浴40℃，啟動反應(yīng)器運行，間隔取出口物料200μL 待測，直至轉(zhuǎn)化率和收率開始下降。

1.7 氣相檢測方法

使用氣相色譜（GC-FID）進行分析。毛細管柱 的 型 號 為 HP-1 （Αgilent， 30m×0.25mm×0.25μm），注射室和檢測器的溫度分別為220℃和230℃，分流比為1∶20。升溫程序為100℃時保持3min，然后以20℃/min 到160℃，然后保持1min。產(chǎn)物通過與標準品對比進行鑒定。十二烷作為內(nèi)標物，以內(nèi)標法來測定-蒎烯和-蒎烯環(huán)氧化物的含量。首先制備了含有十二烷的參考溶液（RS），取100μL 待測樣品與100μL RS 充分混合，然后取1μL注入氣相色譜。

1.8 實驗裝置

該裝置包括一個帶磁力攪拌子的連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器（運行體積=50mL）、磁力攪拌恒溫水浴鍋、恒流泵和兩個密封的溶液罐，反應(yīng)器的進出口由軟管連接，反應(yīng)器與原料罐和產(chǎn)品罐之間各裝有一個恒流泵。反應(yīng)器的進出口處，各有一個不銹鋼網(wǎng)篩，以防止酶顆粒進入軟管。CSTR 反應(yīng)器裝置如圖2所示。

圖2 CSTR裝置示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酸乙酯濃度的影響

在不同乙酸乙酯濃度下，叔丁醇單相體系環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率和收率如圖3。隨著乙酸乙酯濃度的增大，轉(zhuǎn)化率和收率都在逐漸提高，當濃度為3.5mol/L時，環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率和收率達到最高，分別為93%和86%。脂肪酶催化的過酸生成反應(yīng)的機理已經(jīng)被研究和報道，?；w是化學-酶法環(huán)氧化的重要媒介，貫穿于兩步反應(yīng)當中，其不僅影響著過酸的生成同時影響著催化烯烴環(huán)氧化的效率。如Xu 等發(fā)現(xiàn)使用內(nèi)酯作為酰基供體可能有助于維持酶的活力和穩(wěn)定性，而且通過調(diào)節(jié)?；w的量，可以促進過酸的形成，從而提高環(huán)氧化的性能。乙酸乙酯作為?；w，其濃度越高，催化產(chǎn)生的過氧乙酸越多，環(huán)氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率就越高；而當?；w達到一定量時，酶催化也達到飽和，其環(huán)氧化轉(zhuǎn)化率和收率都不再提高，基于資源合理化利用考慮，在單相體系脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化中選擇乙酸乙酯的最適濃度為3.5mol/L。

圖3 不同乙酸乙酯濃度對α-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)的影響

2.2 過氧化氫濃度的影響

過氧化氫由于價格相對便宜，副產(chǎn)物是水從而具有無污染、原子經(jīng)濟性高的優(yōu)點，是蒎烯環(huán)氧化中使用最普遍的一種氧化劑，但過氧化氫即作為底物又作為酶失活劑，其濃度對環(huán)氧化反應(yīng)的最終轉(zhuǎn)化率和收率都有重要的影響。在叔丁醇體系中，不同濃度過氧化氫中進行脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的結(jié)果如圖4所示。在低濃度下，隨著過氧化氫濃度的升高，環(huán)氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和收率迅速升高，直至0.5mol/L時，轉(zhuǎn)化率和收率達到最大，分別為92%和88%。繼續(xù)升高過氧化氫濃度，轉(zhuǎn)化率和收率不再增加并開始緩慢減弱。通常過氧化氫濃度決定脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的反應(yīng)速率，但是高濃度的過氧化氫會使酶失活，從而會限制酶促反應(yīng)。Skouridou等研究了過氧化氫的濃度對蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著過氧化氫加入量的增加，脂肪酶的穩(wěn)定性變差。Aouf等報道了一項過氧化氫失活青梅脂肪酶的機理研究，結(jié)論表明過氧化氫與脂肪酶中心之間通過氫鍵的結(jié)合是限制脂肪酶過水解能力，從而導致了脂肪酶失活的原因。因此，適合叔丁醇單相體系脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化的過氧化氫濃度為0.5mol/L。

圖4 不同過氧化氫濃度對α-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)的影響

2.3 束酸劑種類的影響

化學酶法催化蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)產(chǎn)生的酸性副產(chǎn)物會導致環(huán)氧蒎烷發(fā)生水解或者異構(gòu)等現(xiàn)象，從而降低反應(yīng)的收率，通常加入束酸劑來降低酸性副產(chǎn)物的影響。本實驗考察了碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉和磷酸二氫鈉等五種無機鹽作為束酸劑的影響，結(jié)果如圖5所示。與無束酸劑體系相比，添加束酸劑后環(huán)氧化反應(yīng)的收率明顯更高，表明束酸劑可抑制產(chǎn)物分解，從而可提高蒎烯環(huán)氧化的收率。其中，當添加碳酸氫鈉和碳酸鈉時，環(huán)氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有明顯降低，其原因可能與碳酸鈉為高堿性（高p）的鹽，易使酶失活，不利于環(huán)氧化反應(yīng)有關(guān)。而添加磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉和磷酸二氫鈉作為束酸劑時，轉(zhuǎn)化率基本維持不變，收率都有明顯提升，其中檸檬酸三鈉的收率最高，可達88%，所以后續(xù)實驗選用檸檬酸三鈉作為束酸劑。

圖5 束酸劑種類對α-蒎烯環(huán)氧化的影響

2.4 雙相體系和單相體系蒎烯環(huán)氧化的比較

圖6為甲苯-水雙相體系的脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)進程，在甲苯-水雙相體系中，隨著反應(yīng)時間的增加，環(huán)氧化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率、收率先是快速升高，90min時分別達到65%和62%，然后轉(zhuǎn)化率基本保持穩(wěn)定而收率開始下降，表明隨著反應(yīng)的進行，副產(chǎn)物有機酸積累導致產(chǎn)物部分分解。另外，有機相中的過氧化氫濃度隨反應(yīng)時間緩慢增加，到60min 后，增加至0.27mol/L 并保持不變，這是由于相界面的傳質(zhì)阻力使得過氧化氫從水相擴散到有機相需要一定時間，同時由于過氧化氫在甲苯中的溶解度不高，使得參與環(huán)氧化反應(yīng)的過氧化氫濃度低，這也是導致雙相體系環(huán)氧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和收率較低的原因。圖7展示了叔丁醇單相體系中脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)進程，隨著反應(yīng)時間增加，轉(zhuǎn)化率和收率也逐漸增大，90min時轉(zhuǎn)化率和收率分別可達到93%和88%，環(huán)氧化效果明顯高于雙相（甲苯-水）體系。另外，過氧化氫濃度從開始的0.5mol/L 降為最后的0.2mol/L，表明反應(yīng)始終在較高的過氧化氫濃度下進行，這可能是單相體系轉(zhuǎn)化率和收率更高的原因。而且在叔丁醇單相體系中環(huán)氧化產(chǎn)物沒有明顯的分解現(xiàn)象，表明叔丁醇體系對抑制酸分解作用也是有利的。

圖6 甲苯-水相中α-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)

圖7 叔丁醇中α-蒎烯環(huán)氧化反應(yīng)

2.5 叔丁醇體系中脂肪酶的可重用性

可重用性也是評價固定化脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化體系優(yōu)越性的一項重要指標。由圖8 可知，當過氧化氫濃度為0.5mol/L 時，Novozym435 經(jīng)過6批次重用，其相對活力仍有64%，這個結(jié)果要明顯高于文獻報道的雙相反應(yīng)體系，如Ankudey 等以乙酸乙酯為溶劑，過氧化氫水溶液為氧化劑構(gòu)建雙相反應(yīng)體系，以Novozym435 催化蒎烯環(huán)氧化時，固定化酶的活性在第二次使用后就完全消失。Skouridou 等在 甲 苯- 水 兩 相 體 系 中 以Novozym435 催化-蒎烯環(huán)氧化，產(chǎn)率最高僅為65%，且固定化酶重復(fù)使用5 批次后活力僅剩40%?？梢姡陔p相體系中，脂肪酶由于接觸水相中高濃度的過氧化氫從而極易失活。而在叔丁醇單相體系中，過氧化氫分散在醇溶劑中，降低了初始濃度，減弱了對酶的失活作用。因此，在叔丁醇體系中，固定化脂肪酶Novozym435 具有良好的穩(wěn)定性，從而具有進一步工業(yè)開發(fā)利用的潛力。

2.6 CSTR反應(yīng)器中α-蒎烯環(huán)氧化工藝條件優(yōu)化

連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器具有操作溫度和底物濃度易控制、反應(yīng)釜中物料濃度處處相等并且等于反應(yīng)器出口低濃度的特點，有利于降低反應(yīng)體系過氧化氫濃度，減少對酶的失活作用，有利于反應(yīng)器長期穩(wěn)定運行。本實驗在確定進料蒎烯濃度基礎(chǔ)上，對CSTR 反應(yīng)器的給酶量和停留時間以及進料的過氧化氫濃度進行了優(yōu)化，結(jié)果如圖8所示。反應(yīng)器的轉(zhuǎn)化率和收率先是隨酶量增大而提高[圖9(a)]，當酶量為2.5g，轉(zhuǎn)化率達到最高值，但此時選擇性低于2.0g；當酶量升至3.0g時，平衡轉(zhuǎn)化率并不能繼續(xù)提高，表明環(huán)氧化反應(yīng)能力已達到飽和，繼續(xù)增加酶量并不能提高環(huán)氧化能力；當酶量2.0g時收率為最高79%，其選擇性也達到最高為96%，所以選用2.0g酶量為最佳反應(yīng)酶量。由圖9(b)，叔丁醇單相體系中過氧化氫濃度小于1mol/L 時，反應(yīng)器的轉(zhuǎn)化率隨過氧化氫濃度上升而上升，而在過氧化氫為1.5mol/L時，轉(zhuǎn)化率和收率發(fā)生了急速下降，表明高濃度的過氧化氫已經(jīng)導致脂肪酶的失活。在過氧化氫為1mol/L時，轉(zhuǎn)化率達到最高95%，但其收率（70%）和選擇性（74%）不如過氧化氫濃度為0.5mol/L 時（收率78%、選擇性94%），而且考慮到過氧化氫對酶的失活作用影響反應(yīng)器長期運行的穩(wěn)定性，所以選用0.5mol/L 為最適過氧化氫濃度。圖9(c)展示了停留時間對CSTR 反應(yīng)器中叔丁醇單相體系-蒎烯環(huán)氧化的影響，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化率隨停留時間的增大而增大，但是收率和選擇性在停留時間小于3h 前是增大，但當停留時間超過3h 后，收率和選擇性出現(xiàn)了下降，因為過長的停留時間會導致環(huán)氧化產(chǎn)物環(huán)氧蒎烷在體系中分解，引起收率下降，所以釜式反應(yīng)器的停留時間不宜過長。因此釜式反應(yīng)器的最佳工藝條件為酶量為2.0g、最佳過氧化氫濃度為0.5mol/L、最佳停留時間為3h，此時反應(yīng)器的轉(zhuǎn)化率可達83%，收率可達79%。

圖8 Novozym435在異丙醇系統(tǒng)中脂肪酶介導的環(huán)氧化反應(yīng)中的重復(fù)使用穩(wěn)定性

圖9 CSTR反應(yīng)器中酶量、過氧化氫濃度及停留時間對叔丁醇單相體系α-蒎烯環(huán)氧化的影響

2.7 CSTR反應(yīng)器中α-蒎烯環(huán)氧化的長期運行

在最優(yōu)工藝條件下進行釜式反應(yīng)器的長期運行，結(jié)果如圖10所示。結(jié)果表明CSTR反應(yīng)器能夠穩(wěn)定運行10 天左右，在此期間轉(zhuǎn)化率可以保持70%以上，收率維持在55%以上，但在10 天后，轉(zhuǎn)化率和收率開始下降，15天后，收率僅有35%，表明此時酶開始失活。Meyer 等也設(shè)計一種-蒎烯環(huán)氧化CSTR 工藝，反應(yīng)條件為溫度30℃、CALB 酶濃度11g/L、停留時間1.5h、氧化氫濃度0.7mol/L，最高收率為62%，在運行4 天后，其收率已為0，通過間歇式補加酶的方式，反應(yīng)器可穩(wěn)定運行17天，收率穩(wěn)定在60%左右。

圖10 CSTR反應(yīng)器中單相體系脂肪酶催化α-蒎烯環(huán)氧化的長期運行

3 結(jié)論

以叔丁醇為溶劑進行化學酶法催化-蒎烯環(huán)氧化，最優(yōu)工藝條件為乙酸乙酯濃度3.5mol/L，過氧化氫濃度0.5mol/L，束酸劑為0.6mmol 檸檬酸三鈉，蒎烯環(huán)氧化最高轉(zhuǎn)化率為92%、最高收率為88%。在此單相體系中，Novozym435 重用6 次后，仍保持64%的相對活力，表明該體系有利于保護酶的活性。利用自主設(shè)計的連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器用于脂肪酶催化-蒎烯環(huán)氧化，反應(yīng)器運行體積為50mL，進料-蒎烯濃度為0.3mol/L 時，乙酸乙酯濃度為3.5mol/L 時，最優(yōu)工藝條件為酶量為2.0g、過氧化氫濃度為0.5mol/L、停留時間為3h。在此條件下反應(yīng)器連續(xù)穩(wěn)定運行10 天，轉(zhuǎn)化率可以保持70%以上，收率維持在55%以上。