唐冬蘭 唐泉 蔣立奔 宋芹芹 曹榮祥

摘要：從江蘇省南京地區(qū)草莓病株上分離的2株炭疽病致病菌，經(jīng)多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，確定為膠孢炭疽復合種中的暹羅炭疽菌和果生刺盤孢。為篩選有效防治草莓炭疽病藥劑，測定了6種殺菌劑對這2個菌株菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的抑制活性。結果表明，不同殺菌劑對2種炭疽病菌的抑制效果不同，各殺菌劑在試驗濃度下對2種菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)均有不同程度地抑制作用，相對抑制率與藥劑濃度呈正相關。根據(jù)對病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)抑制效果的綜合表現(xiàn)，75%肟菌·戊唑醇和10%苯醚甲環(huán)唑的EC50值在供試藥劑中是相對較小的，在推薦使用濃度下對2種病菌相對抑制率均可達80%以上，可作為南京地區(qū)草莓炭疽病防治候選藥劑。

關鍵詞：草莓;炭疽病;多基因序列分析;殺菌劑;室內(nèi)毒力測定;抑制作用

中圖分類號：S436.68+4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0106-08

收稿日期：2021-08-10

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（20）3017];亞夫科技服務項目[編號：KF（20）1021];江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目（編號：JATS[2021]008）。

作者簡介：唐冬蘭（1983—），女，江蘇淮安人，博士，助理研究員，主要從事果樹病理學及生物技術研究。E-mail：dofthmlhm@163.com。

通信作者：曹榮祥，副研究員，主要從事草莓栽培與生理研究。E-mail：3060601887@qq.com。

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物。因其獨特的風味深受消費者歡迎。近年來，我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，為主產(chǎn)區(qū)帶來巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。但由于品種單一、連作及病菌抗藥性等，病害問題日益突出。

炭疽病是草莓生產(chǎn)中最具威脅性的病害之一。草莓整個生長期均可受此病危害，尤以育苗期和促成栽培前期發(fā)病最重，最嚴重時，病菌直接侵染根頸，可導致整個植株萎蔫死亡[1]。目前藥劑防治仍是生產(chǎn)上該病最常用且最有效的方法。但國內(nèi)外研究表明，不同地區(qū)發(fā)生為害的炭疽病菌種類不盡相同[2-3]。常見的有膠孢炭疽菌[Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Penz. et Sacc.]、尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmonds）、草莓炭疽菌（C. fragariae Brooks.）和束狀炭疽菌[C. dematium （Pers.） Vuill]，其中膠孢炭疽菌被鑒定為多地草莓炭疽病的優(yōu)勢種群[4-5]。事實上，膠孢炭疽菌是包含多個隱存種的復合種[6]，但不同隱存種對不同藥劑的敏感性差異目前尚未見報道。另一方面，隨著殺菌劑使用頻率與劑量的不斷增加，草莓炭疽病病原菌已對多種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性。有研究表明，杭州市草莓炭疽病致病菌已存在高比例的多菌靈和乙霉威雙抗菌系[7];林婷對浙江省不同地區(qū)的草莓炭疽病菌菌株進行室內(nèi)毒力測定發(fā)現(xiàn)，供試68個菌株中有67個對甲基硫菌靈表現(xiàn)出高水平抗藥性[8]。

本研究對從南京地區(qū)草莓炭疽病病株上分離的2株致病菌，采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析進行分子物種鑒定，并選擇6種生產(chǎn)上常用且相對低毒低殘留的殺菌劑，比較其對2種草莓炭疽病菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的室內(nèi)抑菌活性，以期篩選出適用于南京地區(qū)草莓炭疽病防治的藥劑，從而延緩抗藥性的產(chǎn)生，提高藥劑使用的針對性，為生產(chǎn)上有效防治草莓炭疽病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究所用2株草莓炭疽病菌（BT-3-2和BH-3-1），于2020年7月從江蘇省南京市設施栽培的草莓炭疽病發(fā)病植株上采用組織分離法獲得。按照科赫氏法則驗證致病性后，菌株于4 ℃下保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基斜面上備用。

1.2 菌株分子物種鑒定

挑取適量保存的菌種接入PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min條件下，振蕩培養(yǎng)5～7 d，經(jīng)無菌紗布過濾去除液體培養(yǎng)基，再用無菌水清洗2～3次，將得到的菌絲用無菌濾紙吸干水分，取適量菌絲，加液氮研磨成粉末，用基因組提取試劑盒[DP320，天根生化科技（北京）有限公司]提取基因組總DNA。利用文獻中報道的引物擴增各菌株的ITS區(qū)、肌動蛋白（actin gene，ACT）、鈣調(diào)蛋白（calmodulin gene，CAL）和β-微管蛋白（β-tublin gene，TUB2）片段[9]。PCR反應總體積25 μL，內(nèi)含12.5 μL ×PCR Master Mix（康為世紀生物科技有限公司），引物各0.4 μmol/L，模板DNA 40～50 ng。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性30 s，退火30 s（不同引物退火溫度見表1），72 ℃延伸 90 s，30次循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后，取5 μL擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。對確定有目的條帶的PCR產(chǎn)物送樣測序，測序工作交由南京擎科生物科技有限公司完成。

使用DNAStar軟件包中的SeqMan序列拼接軟件進行序列拼接。從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載相關序列（表2），主要是炭疽菌屬的序列，將各菌株的DNA片段按ITS-ACT-CAL-TUB2的順序首尾相連，在MEGA 6.0軟件中，對序列進行Clustal W比對，然后進行Model test分析選出最優(yōu)堿基替換模型，再用最大似然法構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行重復1 000次的自展分析[15]。

1.3 供試藥劑

共6種供試藥劑，分別為250 g/L吡唑醚菌酯乳油[巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司]、450 g/L咪鮮胺水乳劑（蘇州富美實植物保護劑有限公司）、75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑（德國拜耳股份公司）、10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（先正達南通作物保護有限公司）、80%代森錳鋅可濕性粉劑[陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技（中國）有限公司]、70%丙森鋅可濕性粉劑（德國拜耳股份公司）。各藥劑均用無菌水配制成10 000 μg/mL母液。根據(jù)供試藥劑的使用說明，以推薦的最高使用濃度為初始濃度，逐步稀釋成5個濃度梯度開展試驗（表3）。

1.4 不同藥劑對病菌菌絲生長的影響

不同藥劑對2個菌株菌絲生長的影響采用菌絲生長速率法[16]進行測定。方法為將保存的菌種在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d（25 ℃），待菌落長到合適大小時，用無菌打孔器在菌落邊緣切出直徑8 cm的菌塊，然后將菌塊轉入含不同濃度藥劑的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，每個處理重復3次。含藥培養(yǎng)基的制作為將上述6種藥劑的母液依次稀釋成一系列濃度，使稀釋后的濃度為試驗濃度的10倍，再將5 mL藥液與45 mL熔化的PDA培養(yǎng)基混勻，分裝到3～4個無菌培養(yǎng)皿中，以無菌水作空白對照（CK）。待對照菌落快長滿培養(yǎng)皿時，進行統(tǒng)計，采用十字交叉法測量各藥劑不同濃度下的菌落直徑，取平均值。菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.5 不同藥劑對病菌分生孢子萌發(fā)的影響

采用凹玻片法測定不同藥劑對2種病菌分生孢子萌發(fā)的影響[17]。將保存的菌種，挑取適量接入100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)5～7 d，經(jīng)無菌紗布過濾去除菌絲，將得到的孢子液在4 000 r/min下離心10 min，去除上清液后用無菌水重懸浮，再離心，重復1～2次，進行鏡檢、計數(shù)、稀釋，將孢子懸浮液的濃度調(diào)整至1×106個孢子/mL，再用無菌水清洗2～3次;將上述6種藥劑的母液依次稀釋成一系列濃度，使稀釋后的濃度為試驗濃度的3倍;配制1.5%葡萄糖溶液，滅菌;將1.5%葡萄糖溶液、菌懸液和藥液按體積比1 ∶1 ∶1混勻，以無菌水作空白對照（CK），滴在雙孔凹玻片上，置于25 ℃保濕培養(yǎng)，當對照孢子萌發(fā)率達到90%以上時（判斷孢子萌發(fā)標準為芽冠長度超過孢子最大直徑長度1/2），對各處理進行拍照，統(tǒng)計不同濃度下的孢子萌發(fā)率，并計算孢子萌發(fā)抑制率。孢子萌發(fā)抑制率=（對照孢子萌發(fā)數(shù)-處理孢子萌發(fā)數(shù)）/對照孢子萌發(fā)數(shù)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.5軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，求出毒力回歸方程，計算各供試藥劑的相關系數(shù)（r）和抑制中濃度EC50值，分析比較不同殺菌劑對2種草莓炭疽病菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的抑制作用。

2 結果與分析

2.1 病原菌的多基因分子分析與鑒定

對分離純化后，經(jīng)致病性鑒定確定為草莓炭疽病致病菌的2個菌株的ITS、TUB2、CAL和ACT序列進行測序，菌株BT-3-2得到的4個片段長度分別為242、732、535、732 bp，菌株BH-3-1的4個片段長度分別為249、732、536、731 bp。通過MEGA 6.0構建的ITS-TUB2-CAL-ACT多基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）可以看出，BT-3-2和BH-3-1分別與已登錄的暹羅炭疽菌（C. siamense，ICMP17795）和果生刺盤孢（C. fructicola，ICMP18613）聚在一起，支持率分別為72%、98%。結合形態(tài)特征，將供試菌株分別鑒定為膠孢炭疽復合種中的暹羅炭疽菌和果生刺盤孢。

2.2 不同藥劑對暹羅炭疽菌菌絲生長的抑制作用

由表3可以看出，在各供試藥劑所設定的濃度范圍內(nèi)，暹羅炭疽菌的菌絲生長均受到不同程度的抑制，與藥劑濃度呈正相關，相對抑制率在1.24%（62.500 μg/mL 80%代森錳鋅）～84.54%（66.667 μg/mL 10%苯醚甲環(huán)唑）之間。不同殺菌劑在推薦使用濃度下，66.667 μg/mL 10%苯醚甲環(huán)唑的相對抑制率最高（84.54%），250 μg/mL 75%肟菌·戊唑醇表現(xiàn)次之（83.22%），1 000.000 μg/mL 80%代森錳鋅相對抑制率最低（27.74%）。毒力分析結果（表4）表明，6種殺菌劑對暹羅炭疽菌的EC50值從低到高依次為0.028 ?μg/mL（75%肟菌·戊唑醇）、1.718 ?μg/mL（450 g/L咪鮮胺）、2.650 0 μg/mL（10%苯醚甲環(huán)唑）、108.672 8 μg/mL（250 g/L吡唑醚菌酯）、1 102.274 1 μg/mL（70%丙森鋅）和2 514.316 5 μg/mL（80%代森錳鋅）。

2.3 不同藥劑對果生刺盤孢菌絲生長的抑制作用

由表5可以看出，6種殺菌劑在供試濃度范圍內(nèi)，對果生刺盤孢的相對抑制率在3.38%（62.500 μg/mL 80%代森錳鋅）～100.00%（300 μg/mL 450 g/L咪鮮胺）之間。在推薦使用濃度下，300 μg/mL 450 g/L咪鮮胺相對抑制率最高（100.00%），66.667 μg/mL10%苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)次之（92.57%），875.000 μg/mL 70%丙森鋅相對抑制率最低（53.00%）。毒力分析結果（表6）表明，6種殺菌劑對果生刺盤孢的EC50值從低到高依次為0.025 6 μg/mL（75%肟菌·戊唑醇）、1.649 9 μg/mL（10%苯醚甲環(huán)唑）、22.424 1 μg/mL（450 g/L咪鮮胺）、45.091 9 μg/mL（250 g/L吡唑醚菌酯）、315.770 1 μg/mL（80%代森錳鋅）和618.082 6 μg/mL（70%丙森鋅）。除450 g/L咪鮮胺，其他5種殺菌劑對果生刺盤孢的EC50值均低于暹羅炭疽菌。

2.4 不同藥劑對暹羅炭疽菌分生孢子萌發(fā)的影響

由表7可以看出，暹羅炭疽菌分生孢子在6種殺菌劑供試濃度范圍內(nèi)其萌發(fā)均受到不同程度的抑制，相對抑制率在55.07%（54.688 μg/mL 70%丙森鋅）～100.00%（1 000.000 μg/mL 80%代森錳鋅）之間。各種殺菌劑在推薦使用濃度下均表現(xiàn)出較高的抑制效果，相對抑制率從高到低依次為100.00%（1 000.000 μg/mL 80%代森錳鋅）、99.36%（300 μg/mL咪鮮胺）、98.91%（875.000 μg/mL 70% 丙森鋅）、85.95%（66.667 μg/mL 10%苯醚甲環(huán)唑）、84.23%（125.000 μg/mL 50 g/L吡唑醚菌酯）和84.02%（250.000 μg/mL 75%肟菌·戊唑醇）。毒力分析結果（表8）表明，6種殺菌劑的EC50值從低到高依次為0.336 9 μg/mL（250 g/L吡唑醚菌酯）、0.754 7 μg/mL（75%肟菌·戊唑醇）、2.129 3 μg/mL（10%苯醚甲環(huán)唑）、14.929 5 μg/mL（450 g/L咪鮮胺）、51.763 1 μg/mL（70%丙森鋅）、77.662 4 μg/mL（80%代森錳鋅）。

2.5 不同藥劑對果生刺盤孢分生孢子萌發(fā)的影響

由表9可以看出，6種殺菌劑在供試濃度范圍內(nèi)對果生刺盤孢分生孢子萌發(fā)的相對抑制率在4.33%（54.688 μg/mL 70%丙森鋅）～100.00%（1 000.000 μg/mL 80%代森錳鋅）之間。各種殺菌劑在推薦使用濃度下均表現(xiàn)出較高的抑制效果，對果生刺盤孢菌的抑制效果排名與在暹羅炭疽菌上基本一致，除75%肟菌·戊唑醇的效果稍好于 50 g/L 吡唑醚菌酯。毒力分析結果（表10）表明，6種殺菌劑的EC50值從低到高依次為0.316 6 μg/mL（75%肟菌·戊唑醇）、13.409 8 μg/mL（10%苯醚甲環(huán)唑）、23.669 8 μg/mL（250 g/L吡唑醚菌酯）、39.447 ?μg/mL（450 g/L咪鮮胺）、46.980 ?μg/mL（80%代森錳鋅）和199.617 1 μg/mL（70%丙森鋅）。

3 討論

膠孢炭疽菌是國內(nèi)報道最多的引起草莓炭疽病的致病菌，雖然有很多研究表明它是一個復合種，但由于復合種內(nèi)各隱存種的形態(tài)非常相似、形態(tài)性狀受培養(yǎng)條件的影響很大，對真菌物種進行鑒定有很強的經(jīng)驗依賴性，以及常用作真菌分類鑒定的ITS片段多態(tài)性位點有限，國內(nèi)研究很少將草莓炭疽病鑒定到復合種內(nèi)的具體隱存種。目前，只有韓永超等曾報道膠孢炭疽復合種內(nèi)的暹羅炭疽菌可引起湖北省武漢市草莓根頸腐爛病[9]。近年來，學者多采用多基因系統(tǒng)分析進行分類鑒定[18-19]。Weir等結合形態(tài)學方法和多基因系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)膠孢炭疽菌復合種可分成22個種[12]。不同隱存種的致病性強弱、侵染部位、分布情況及對藥劑的敏感程度是否有差異尚未見報道。能對草莓炭疽病的病原進行準確鑒定，對草莓炭疽病的防治具有重要意義。前期，筆者所在課題組在草莓炭疽病發(fā)病組織中分離到2株形態(tài)有細微差異的菌株，經(jīng)致病性鑒定確定對草莓具有致病性，本研究通過構建多基因（ITS、CAL、ACT、TUB2）系統(tǒng)發(fā)育樹，將其分別鑒定為膠孢炭疽復合種中的暹羅炭疽菌和果生刺盤孢。

目前，已有很多關于草莓炭疽病防治藥劑篩選的報道，與過往研究相比本研究首次對膠孢炭疽復合種內(nèi)的暹羅炭疽菌和果生刺盤孢的室內(nèi)毒力進行了比較，結果表明在推薦濃度下，大部分藥劑對2種炭疽病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)均能起到較明顯的抑制效果，相對抑制率與藥劑濃度成正比。值得注意的是，有些藥劑對菌絲生長抑制效果不是太明顯，但對分生孢子萌發(fā)卻表現(xiàn)出明顯的抑制作用。在各藥劑推薦使用濃度下，對暹羅炭疽菌菌絲生長和孢子萌發(fā)相對抑制率最強的分別是10%苯醚甲環(huán)唑和80%代森錳鋅，對果生刺盤孢菌絲生長和孢子萌發(fā)相對抑制率最強的為450 g/L咪鮮胺和80%代森錳鋅。從EC50值比較結果來看，對暹羅炭疽菌菌絲生長毒力最強的3種藥劑依次為75%肟菌·戊唑醇、450 g/L咪鮮胺和10%苯醚甲環(huán)唑;對暹羅炭疽菌分生孢子萌發(fā)毒力最強的3種藥劑依次為250 g/L吡唑醚菌酯、75%肟菌·戊唑醇和10%苯醚甲環(huán)唑;對果生刺盤孢的菌絲生長毒力最強大3種藥劑依次為75%肟菌·戊唑醇、10%苯醚甲環(huán)唑和450 g/L咪鮮胺;對果生刺盤孢分生孢子萌發(fā)毒力最強的3種藥劑依次為75%肟菌·戊唑醇、10%苯醚甲環(huán)唑和250 g/L吡唑醚菌酯。從供試殺菌劑對病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)抑制效果及藥劑使用量的綜合表現(xiàn)來看，暹羅炭疽菌和果生刺盤孢均對75%肟菌·戊唑醇和10%苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)較為敏感。王國君等比較了5種殺菌劑對草莓炭疽病的田間防治效果，從防治效果、對草莓的安全性及抗藥性等方面綜合考慮，也認為75%肟菌·戊唑醇水分散粒劑是防治草莓病害較理想的藥劑[20]。

4 結論

6種殺菌劑在試驗濃度下對2種致病菌的菌絲生長和分生孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，相對抑制率與藥劑濃度呈正相關。根據(jù)供試殺菌劑對病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)抑制效果及藥劑使用量的綜合表現(xiàn)，暹羅炭疽菌和果生刺盤孢均對75%肟菌·戊唑醇和10%苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)較為敏感，可作為南京地區(qū)草莓炭疽病防治的候選藥劑。但本試驗的毒力測定是在室內(nèi)進行的，室內(nèi)環(huán)境與田間環(huán)境存在較大差異，在推廣應用前，還需進一步開展田間藥效試驗。

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