王茜月 管飄萍 陳詩涵 黃紫貝 郭鑫 趙以恒 羅健雅 王欣宇 崔顥月 劉金彪 王海燕 劉文博

摘要：從池塘中分離、純化了1株具有極強溶血活性的革蘭氏陰性桿菌BB2，在TSA培養(yǎng)基上菌落呈灰色、半透明圓形，經(jīng)16S rRNA基因序列分析確定為色桿菌屬，但無法確定到種;進一步全基因組測序結(jié)果表明，該菌株與GenBank中唯一的1株稻根色桿菌基因組同源性最高，但生物學(xué)特性又不一致。文獻逆索發(fā)現(xiàn)其命名為稻根色桿菌主要是由于其分離于水稻根部，這對分類造成了困惑。最終依據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和全基因組序列分析及文獻分析等綜合信息，確定分離菌BB2為溶血色桿菌，這提醒研究者們在細(xì)菌鑒定時應(yīng)謹(jǐn)慎使用GenBank數(shù)據(jù)序列數(shù)據(jù)，一定要對相關(guān)參考文獻進行全面認(rèn)真研讀，獲取必要的證據(jù)，為最終分類提供科學(xué)依據(jù)。本研究也為進一步研究該分離株的生物學(xué)特性和應(yīng)用提供了參考和基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：池塘;溶血色桿菌;全基因組序列;比較基因組分析

中圖分類號：S182 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）12-0042-09

收稿日期：2021-08-16

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程（2018）。

作者簡介：王茜月（1999—），碩士，江蘇泰州人，主要從事傳染病流行病學(xué)研究。E-mail：Bioyusy@outlook.com。

通信作者：劉文博（1975—），男，博士，副教授，主要從事傳染病防控。E-mail：lwb@yzu.edu.cn。

溶血色桿菌，屬于色桿菌屬（Chromobacterium），革蘭氏染色陰性，可以在多種類型的瓊脂平板上生長（羊血瓊脂、巧克力平板培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、木炭酵母提取物培養(yǎng)基），菌落呈灰色、圓形。在血瓊脂平板上呈現(xiàn)出大約5 mm的明顯溶血區(qū)[1-3]。目前，色桿菌屬共有14個成員，分別是稻根色桿菌[4]、鏈烷烴色桿菌[5]、亞馬遜色桿菌 [6]、水生色桿菌 [7]、氟色桿菌[8]、紫色色桿菌 [9]、魚腥草色桿菌 [9]、偽紫色色桿菌[9]、溶血色桿菌 [1]、沼澤色桿菌 [10]、瞼炎色桿菌 [10]、痘苗色桿菌 [11]、球形色桿菌 [11]和枯草色桿菌 [12]。其中，紫色色桿菌和溶血色桿菌因可以引起哺乳動物感染而受到重視[ 13-14]。由于溶血色桿菌的一些分離株能夠感染人類，引起壞死性筋膜炎[1]、直腸結(jié)腸炎[15]和肺炎[3]，故有必要對該菌進行更深入的研究。溶血色桿菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素有較大的耐藥性[ 15]。有報道稱，溫帶地區(qū)的河水是人感染溶血色桿菌的主要來源[2]。

16S rRNA基因因其保守性和穩(wěn)定性，成為微生物分類鑒定中的重要分子標(biāo)記[16]，但這種方法在區(qū)分相似性很高的菌種時有局限性，全基因組分析的方法或許可以克服這一缺點[17-18]，高通量測序技術(shù)的發(fā)展為微生物分類提供了新的方法和思路。平均核苷酸同源性方法具有方便、錯誤率低、分辨率高的特點，該方法通過計算2個基因組之間同源基因的相似性，認(rèn)為ANI值接近或高于95%屬于同一菌種[19]。同時，有研究表明，ANI與DDH（一般認(rèn)為DDH值接近或高于70%屬于同一菌種）具有較好的一致性。然而，由于成本等問題基因序列庫中全基因組數(shù)據(jù)比較少，可能會由于比對時數(shù)據(jù)缺少而造成分類錯誤。

本研究從池塘水樣中分離出1株溶血活性很強的細(xì)菌，確定為色桿菌屬，但在確定其種時卻因為數(shù)據(jù)、文獻問題造成了困惑，最終綜合其16S rRNA序列、全基因組序列、生物學(xué)特性和文獻綜合分析，確定為溶血色桿菌，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 生物安全柜購自Thermo公司;電子天平購自上海精密儀器儀表有限公司;奧林巴斯顯微鏡購自日本奧林巴斯公司;高壓滅菌鍋購自Tomy公司;PCR儀2720購自美國ABI公司;電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司。

1.1.2 主要試劑 血平板購自江門市凱林貿(mào)易有限公司;TSA瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司;16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 細(xì)菌分離、純化、16S rRNA 基因擴增

2019年8月，采集揚州大學(xué)文匯路校區(qū)農(nóng)學(xué)大樓和獸醫(yī)學(xué)院大樓中間池塘內(nèi)的水樣，4 000 r/min離心后取上清液，接種于含有10%血清的血平板中，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。挑取單個菌落，接種血平板、TSA等進行菌落特性研究，連續(xù)純化3代，對單個菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，擴增16S rRNA基因，送往擎科生物技術(shù)公司測序。

1.3 16S rRNA 基因序列比對

基于EZBioCloud 16S數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/），對細(xì)菌進行 16S rRNA基因比對，使用MEGA-X軟件，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進化樹進行遺傳進化分析。

1.4 基因組DNA的提取

挑取單個菌落，提取高質(zhì)量基因組DNA，利用Nanodrop、Quibit和 0.35% 瓊脂糖凝膠電泳驗證后，送武漢貝納科技服務(wù)公司測序。

1.5 基因組測序和組裝

對Nanopore測序儀測得的原始數(shù)據(jù)進行過濾，去除接頭、短片段及低質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用unicycler （0.4.8）[20]軟件對過濾后的reads進行組裝。使用bwa[21]軟件將二代測序illumina短序列比對到拼接完成的基因組上，使用minimap2將3代測序的長序列比對到拼接完成的基因組上，使用samtools depth工具，以2 000 bp為一滑窗在基因組上滑動，統(tǒng)計平均測序深度。通過Prokka軟件對組裝后的基因組進行編碼基因預(yù)測。利用預(yù)測得到的基因組信息，如基因組測序深度、GC分布及基因組結(jié)構(gòu)注釋進行整合，用R包circlize繪制基因組圈圖。將全基因組序列信息上傳NCBI數(shù)據(jù)庫，GenBank登錄號為CP061849。

1.6 基因組成分初步分析

通過PHAST軟件來預(yù)測前噬菌體基因[22];通過RepeatMasker軟件對基因組進行重復(fù)序列預(yù)測[23];通過IslandView4網(wǎng)站預(yù)測基因組中存在的基因島[24]。

1.7 抗性基因預(yù)測

通過Comprehensive Antibiotic Resistance Database（CARD）[25]數(shù)據(jù)庫對細(xì)菌的抗性基因進行篩查，獲得基因的抗性類型、抗性譜等詳細(xì)信息，預(yù)測細(xì)菌的耐藥基因。

1.8 比較基因組分析

1.8.1 全基因組序列比較及共線性分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫中查找色桿菌屬可獲得全基因組序列的菌株，包括稻根色桿菌（C. rhizoryzae JP2-74）、溶血色桿菌（C. haemolyticum CH06-BL）、紫色色桿菌（C. violaceum ATCC 12472）、痘苗色桿菌（C. vaccinia 1-1）的基因組信息，與分離菌的基因組序列直接進行比較分析，統(tǒng)計基因組基本特征，計算平均核苷酸同源性（ANI）及DNA-DNA雜交值（DDH）。采用Mauve軟件，構(gòu)建參考菌株和分離菌的全基因組序列共線性比對[26]。

1.8.2 基因家族比較分析 利用OrthoVenn2在線工具[27]（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/）對分離菌和“1.8.1”節(jié)所選參考菌株的蛋白序列進行直系同源聚類分析（參數(shù)：e-value≤1×10-5，Inflation value≤1.5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離、純化和16S rRNA 基因擴增

從池塘水樣中劃線分離培養(yǎng)出不同菌落形態(tài)的多種細(xì)菌，其中有1種細(xì)菌在TSA培養(yǎng)基上呈灰色、半透明的圓形菌落（圖1），多次純化后，該菌可以在血瓊脂平板上產(chǎn)生非常明顯的溶血環(huán)（圖2），符合溶血色桿菌的形態(tài)學(xué)特點和溶血特性。16S rRNA 基因擴增成功。

2.2 16S rRNA 基因序列比對結(jié)果

通過擴增細(xì)菌的16S rRNA基因并測序得到其序列，進行BLAST比對，結(jié)果表明為色桿菌屬，下載相關(guān)的16S rRNA基因進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的16S rRNA基因序列與Chromobacterium haemolyticum MDA0585、Chromobacterium rhizoryzae LAM1188、Chromobacterium alkanivorans IITR-71、Chromobacterium aquaticum CC-SEYA-1較為接近，相似度分別為99.38%、99.30%、99.09%、98.56%。將分離到的細(xì)菌命名為BB2，遺傳進化樹見圖3。

2.3 測序結(jié)果統(tǒng)計并繪制基因組圈圖

高通量測序儀測序得到5 635 123條序列，過濾后得到5 625 367條序列，二代測序平均測序深度為321.35 X，三代測序平均測序深度約為154.41 X。過濾后細(xì)菌基因組總長度為5 30 650，GC含量為63.09%，基因組中重復(fù)序列含量極少，總長為 59 951 bp，占基因組序列全長的1.15%。經(jīng)預(yù)測，細(xì)菌基因組含有4 859個編碼基因，4 690個CDS，87個tRNA，25個rRNA，1個tmRNA，繪制基因組圈如圖4所示。

2.4 基因組成分初步分析

2.4.1 前噬菌體分析 PHASTER預(yù)測結(jié)果顯示，分離菌中含有5個完整的前噬菌體，分離菌作為溶源性細(xì)菌，與病原菌共同培養(yǎng)時，前噬菌體可能會從宿主染色體上切割下來，大量復(fù)制，成為成熟的噬菌體，通過噬菌體的傳染，導(dǎo)致病原菌裂解、死亡。分離菌還含有4個非完整的前噬菌體，分別含有19、12、20、14個CDS，可能是在此發(fā)生了基因突變，導(dǎo)致產(chǎn)生了非完整的前噬菌體。此外，分離菌還存在1個有爭議的前噬菌體，含有21個CDS。具體情況見表1。

2.4.2 基因島預(yù)測 基因島通常被認(rèn)為通過水平轉(zhuǎn)移獲得，這些區(qū)域常包含抗生素抗性及毒力相關(guān)基因?；驆u預(yù)測對細(xì)菌的進化分析，以及在進化過程中可能獲得的特異功能的研究有重要意義。分離菌的全基因組中共預(yù)測到了37個基因島，其中，IslandPath-DIMOD方法預(yù)測到15個基因島，SIGI-HMM方法預(yù)測到16個基因島，IslandPick方法預(yù)測到6個基因島，這些基因島可能對細(xì)菌適應(yīng)不同的環(huán)境和抗生素耐藥性有重要作用。預(yù)測結(jié)果見圖5。

2.5 抗性基因預(yù)測結(jié)果

根據(jù)CARD抗性基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測結(jié)果，該菌株含有adeF外排泵和抗生素靶點改變機制（抗磺胺類藥物）。

2.6 比較基因組分析

2.6.1 全基因組序列比較分析 由表2可見，分離菌的基因組大小和GC含量與C.rhizoryzae JP2-74和C.haemolyticum CH06-B較為接近，C. violaceum ATCC 12472與其他菌株基因組基本特征差異較大。一般認(rèn)為ANI值接近或高于95%劃分為同一菌種[16]，令人驚訝的是，按照此標(biāo)準(zhǔn)，分離菌和C. rhizoryzae JP2-74及C.haemolyticum CH06-BL均屬于同一菌種，而和C. violaceum ATCC 12472及C. vaccinia 1-1顯然不屬于同一菌種。DDH預(yù)測值認(rèn)為物種邊界的閾值為70%左右，高于70%被認(rèn)為屬于同一菌種[19]，DDH值預(yù)測結(jié)果與ANI值的結(jié)果具有一致性。

通過共線性分析可以進一步識別菌種全基因組的一致性和變異性，體現(xiàn)基因組的共同起源。分離菌與4株參考菌株的共線性分析結(jié)果見圖6。由圖6可見，分離菌與C. rhizoryzae JP2-74、C. haemolyticum CH06-BL存在大量同源性區(qū)域，但也存在缺失、插入和重排區(qū)域，與C. violaceum ATCC 12472、C. vaccinia 1-1差異較大。

2.6.2 直系同源聚類分析 OrthoVenn2 直系同源聚類分析結(jié)果顯示，共得到5 324個基因簇，2 462個同源基因簇（至少包含2個物種）以及2 862個單拷貝基因簇。由圖7可以看出，5株菌的共有基因簇（核心基因簇）有2 898個，分離菌和C. rhizoryzae JP2-74及C. haemolyticum CH06-BL的共有基因簇較多，和C. vaccinia 1-1的共有基因簇較少。相似矩陣熱圖（圖8）也顯示，分離菌和C. rhizoryzae JP2-74及C. haemolyticum CH06-BL具有較高的聚類。

以上結(jié)果均表明全基因組分類方法可以區(qū)分溶血色桿菌、紫色色桿菌和痘苗色桿菌。雖然溶血色桿菌和稻根色桿菌在基因組的組成上極為相似，單靠全基因組測序分析方法仍無法做出判斷，但是由于稻根色桿菌目前僅有從水稻根部分離出的報道[4]，且基因庫中相關(guān)的全基因組序列很少，進一步進行文獻綜合分析，結(jié)合分離菌的細(xì)菌生物學(xué)特征和極強的溶血特性，認(rèn)為BB2應(yīng)該屬于溶血色桿菌。

3 討論

通過16S rRNA基因序列和遺傳關(guān)系鑒定細(xì)菌、確定菌種已成為常用的細(xì)菌分類手段，但其分類僅僅能夠到屬，無法確定到種，現(xiàn)在很多研究者對該方法的原理并不清楚，在GenBank進行BLAST，同源性最高的就確認(rèn)到種，這種文章現(xiàn)在越來越多，但并未深究其因。然而，GenBank中的數(shù)據(jù)均為測定者上傳，全面性和準(zhǔn)確性值得商榷，且其分類依據(jù)也是依賴于以往的基因庫，這就造成了以訛傳訛的后果。16S rRNA序列作為細(xì)菌分類的依據(jù)，一般分別以97%和95%作為劃分一種新種和新屬的依據(jù)[28]，2006年劃分新種的標(biāo)準(zhǔn)被提高到了98.7%[29]，這一標(biāo)準(zhǔn)和DDH結(jié)果有較好的一致性[30]。但是僅僅依賴于16S rRNA基因序列不能夠確定到種，只能作為參考。本研究中細(xì)菌純化后測定的序列表明分離株BB2為色桿菌屬?；贓ZBioCloud 16S 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ezbiocloud.net/）對該分離株的16S rRNA基因進行比對以鑒定菌種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌的16S rRNA基因序列與Chromobacterium haemolyticum MDA0585、Chromobacterium rhizoryzae LAM1188、Chromobacterium alkanivorans IITR-71、Chromobacterium aquaticum CC-SEYA-1較為接近，相似度分別為99.38%、99.30%、99.09%、98.56%。確定分離菌屬于色桿菌屬，但無法確定菌種，這也體現(xiàn)出了16S rRNA序列比對在區(qū)分同屬不同種細(xì)菌之間的局限性。

隨后的全基因組序列測定結(jié)果與GenBank中可獲得的色桿菌屬成員進行基因組比較分析，結(jié)果顯示，分離菌和唯一的1株稻根色桿菌Chromobacterium rhizoryzae LAM1188基因組特征最相似，遺傳關(guān)系很近。但是很多參考菌株并沒有測定全基因組序列，缺少大量的序列證據(jù)，無法對其進行種的確定，進一步回顧將稻根色桿菌確定為新種的報道[4]，發(fā)現(xiàn)其依據(jù)主要是表型、DNA-DNA雜交值和16S rRNA序列比對，其中，報道中用來比較的2株模式菌株稻根色桿菌C. rhizoryzae LAM1188和溶血色桿菌C. haemolyticum MDA0585 16S rRNA序列相似度為98.7%，這個值恰好是確定細(xì)菌為新種的邊界值，這說明16S rRNA序列比對在本研究中確實不能作為鑒定菌種的證據(jù)。該報道最終是以表型和DNA-DNA雜交試驗來確定菌種的，稻根色桿菌在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黃褐色，但溶血色桿菌在TSA培養(yǎng)基上呈現(xiàn)灰色。本研究中分離菌BB2在TSA培養(yǎng)基上也呈現(xiàn)灰色，故最終確定BB2為溶血色桿菌。

在平常的菌種鑒定過程中，依據(jù)GenBank中的序列進行細(xì)菌分類，主要包括16S rRNA序列比對和基因組分析方法。但在本研究中，如果僅僅依據(jù)16S rRNA序列比對和基因組分析方法，很有可能會得出分離菌BB2屬于稻根色桿菌的錯誤結(jié)論。造成這種情況的原因可能有2點，一是稻根色桿菌和溶血色桿菌基因組組成極其相近;二是數(shù)據(jù)庫中登記信息有誤，實際上這株稻根色桿菌應(yīng)是1株溶血色桿菌。因為稻根色桿菌的模式菌株基因組序列未見上傳，且由于生物材料缺乏，也無法進行 DNA-DNA 雜交試驗驗證，故具體原因仍待進一步探究。這提醒研究者們?nèi)绻耆罁?jù)GenBank上的序列數(shù)據(jù)進行分類，不去考慮表型和生理生化特性，會造成偏差和錯誤，應(yīng)依據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特性、16S rRNA和全基因組等綜合分類，有困惑時一定要對相關(guān)參考文獻進行全面認(rèn)真研讀，獲取必要的證據(jù)，做出準(zhǔn)確判斷。已知溶血色桿菌能夠感染人類，稻根色桿菌僅有1篇報道，未有感染性報道。本研究為謹(jǐn)慎使用GenBank數(shù)據(jù)和文獻提供了一些證據(jù)，也為進一步研究該溶血色桿菌分離株提供了參考和基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]Han X Y，Han F S，Segal J. Chromobacterium haemolyticum sp. nov.，a strongly haemolytic species[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58（6）：1398-1403.

[2]Kanamori H，Aoyagi T，Kuroda M，et al. Chromobacterium haemolyticum pneumonia associated with near-drowning and river water，Japan[J]. Emerging Infectious Diseases，2020，26（9）：2186-2189.

[3]Takenaka R，Nureki S I，Ueno T，et al. Chromobacterium haemolyticum pneumonia possibly due to the aspiration of runoff water[J]. Japanese Journal of Infectious Diseases，2015，68（6）：526-529.

[4]Zhou S，Guo X，Wang H M，et al. Chromobacterium rhizoryzae sp. nov.，isolated from rice roots[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2016，66（10）：3890-3896.

[5]Bajaj A，Kumar A，Yadav S，et al. Isolation and characterization of a novel Gram-negative bacterium Chromobacterium alkanivorans sp. nov.，strain IITR-71T degrading halogenated alkanes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2016，66（12）：5228-5235.

[6]Menezes C B A，Tonin M F，Corrêa D B A，et al. Chromobacterium amazonense sp. nov. isolated from water samples from the Rio Negro，Amazon，Brazil[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，2015，107（4）：1057-1063.

[7]Young C C，Arun A B，Lai W A，et al. Chromobacterium aquaticum sp. nov.，isolated from spring water samples[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2008，58（4）：877-880.

[8]Moss M O，Ryall C，Logan N A. The classification and characterization of chromobacteria from a lowland river[J]. Journal of General Microbiology，1978，105（1）：11-21.

[9]Kmpfer P，Glaeser S P，Soby S D. Chromobacterium pseudoviolaceum is a later heterotypic synonym of Chromobacterium violaceum Bergonzini 1880[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2018，68（9）：2967-2968.

[10]Blackburn M B，F(xiàn)arrar R R Jr，Sparks M E，et al. Chromobacterium paludis sp. nov.，a novel bacterium isolated from a Chesapeake Bay marsh[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2020，70（12）：6142-6146.

[11]Soby S D，Gadagkar S R，Contreras C，et al. Chromobacterium vaccinii sp. nov.，isolated from native and cultivated cranberry （Vaccinium macrocarpon Ait.） bogs and irrigation ponds[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2013，63（Pt 5）：1840-1846.

[12]Martin P A W，Gundersen-Rindal D，Blackburn M，et al. Chromobacterium subtsugae sp. nov.，a betaproteobacterium toxic to Colorado potato beetle and other insect pests[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2007，57（5）：993-999.

[13]修云芳，邵良平，李碧春，等. 紫色色桿菌感染小熊貓引起肺炎的臨床調(diào)查[J]. 獸類學(xué)報，201 31（1）：108-112.

[14]Okada M，Inokuchi R，Shinohara K，et al. Chromobacterium haemolyticum-induced bacteremia in a healthy young man[J]. BMC Infectious Diseases，2013，13：406.

[15]Tanpowpong P，Charoenmuang R，Apiwattanakul N. First pediatric case of Chromobacterium haemolyticum causing proctocolitis[J]. Pediatrics International，2014，56（4）：615-617.

[16]Ramasamy D，Mishra A K，Lagier J C，et al. A polyphasic strategy incorporating genomic data for the taxonomic description of novel bacterial species[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2014，64（Pt ）：384-391.

[17]Tindall B J，Rosselló-Móra R，Busse H J，et al. Notes on the characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2010，60（Pt 1）：249-266.

[18]Chun J，Oren A，Ventosa A，et al. Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2018，68（1）：461-466.

[19]Meier-Kolthoff J P，Auch A F，Klenk H P，et al. Genome sequence-based species delimitation with confidence intervals and improved distance functions[J]. BMC Bioinformatics，2013，14：60.

[20]Wick R R，Judd L M，Gorrie C L，et al. Unicycler：Resolving bacterial genome assemblies from short and long sequencing reads[J]. PLoS Computational Biology，2017，13（6）：e1005595.

[21]Li H，Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform[J]. Bioinformatics，2010，26（5）：589-595.

[22]Zhou Y，Liang Y J，Lynch K H，et al. PHAST：a fast phage search tool[J]. Nucleic Acids Research，201 39（Web Server issue）：347-352.

[23]Tarailo-Graovac M，Chen N S. Using repeatmasker to identify repetitive elements in genomic sequences[M]//Current protocols in bioinformatics. New York：John Wiley & Sons，2009.

[24]Bertelli C，Laird M R，Williams K P，et al. IslandViewer 4：expanded prediction of genomic Islands for larger-scale datasets[J]. Nucleic Acids Research，2017，45（W1）：30-35.

[25]Alcock B P，Raphenya A R，Lau T T Y，et al. CARD 020：antibiotic resistome surveillance with the comprehensive antibiotic resistance database[J]. Nucleic Acids Research，2019，48（D1）：517-525.

[26]Darling A C E，Mau B，Blattner F R，et al. Mauve：multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements[J]. Genome Research，2004，14（7）：1394-1403.

[27]Xu L，Dong Z B，F(xiàn)ang L，et al. OrthoVenn2：a web server for whole-genome comparison and annotation of orthologous clusters across multiple species[J]. Nucleic Acids Research，2019，47（W1）：52-58.

[28]Stackebrandt E，F(xiàn)rederiksen W，Garrity G M，et al. Report of the ad hoc committee for the re-evaluation of the species definition in bacteriology[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2002，52（Pt 3）：1043-1047.

[29]Stackebrandt E，Ebers J. Taxonomic parameters revisited：Tarnished gold standards[J]. Microbiology Today，2006，8（4）：6-9.

[30]Rosselló-Mora R. DNA-DNA reassociation methods applied to microbial taxonomy and their critical evaluation molecular identification，systematics，and population structure of prokaryotes[M]. Berlin：Springer，2006：23-50.