葛君 任德超 孟自力 李愛霞 陳杰

摘要：為了解多酚氧化酶活性基因在河南新育小麥品種中的分布情況，選用123份河南新育小麥品種為試驗(yàn)材料，利用功能標(biāo)記PPO18、PPO16和PPO29對(duì)供試材料的Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)等位基因進(jìn)行分子檢測。結(jié)果表明，在Ppo-A1位點(diǎn)上共檢測到2種等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b，分布頻率分別為63.4%和36.6%，以與高多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-A1a分布為主;在Ppo-D1位點(diǎn)上共檢測到2種等位基因Ppo-D1a和Ppo-D1b，分布頻率分別為78.9%和21.1%，以與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-D1a分布為主。在Ppo-A1和Ppo-D1這2個(gè)位點(diǎn)上，共檢測到4種等位基因組合Ppo-A1a/Ppo-D1a、Ppo-A1a/Ppo-D1b、Ppo-A1b/Ppo-D1a和 Ppo-A1b/Ppo-D1b，分布頻率分別為52.8%、10.6%、26.0%和10.6%，以與中等多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1a/Ppo-D1a分布為主。此外，本研究篩選出的偃高161、商麥188和厚德麥971等32份攜帶等位基因組合Ppo-A1b/Ppo-D1a（與低多酚氧化酶活性相關(guān)）的小麥材料，可以為一線育種人員進(jìn)行小麥品質(zhì)色澤改良提供參考信息。

關(guān)鍵詞：小麥;多酚氧化酶;分子檢測;功能標(biāo)記;等位基因

中圖分類號(hào)：S512.103 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）11-0037-06

收稿日期：2022-03-07

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-03-31）。

作者簡介：葛 君（1981—），女，河南商丘人，助理研究員，主要從事小麥遺傳育種與栽培研究。E-mail：y2013g2015@163.com。

通信作者：李愛霞，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事小麥遺傳育種與栽培研究。E-mail：spsnlkxymzl@163.com。

小麥面粉在加工過程中容易產(chǎn)生褐變，這不僅影響面制食品的外觀品相，而且還會(huì)對(duì)其營養(yǎng)價(jià)值造成一定影響。小麥籽粒中的多酚氧化酶是引起小麥面粉褐變的主要因素^[1-3]。調(diào)控多酚氧化酶活性的基因主要位于小麥第2同源染色體上^[4-7]，Raman等在小麥2AL染色體上檢測到的主效QTL基因位點(diǎn)可以解釋82%～84%的表型變異^[6];張立平等在小麥2DL染色體上檢測到的主效QTL基因位點(diǎn)可以解釋25.1%～29.1%的表型變異^[7]。隨后，Sun等克隆出位于2AL染色體上的Ppo-A1基因，并開發(fā)設(shè)計(jì)了分子功能標(biāo)記PPO18用于檢測等位基因Ppo-A1a和Ppo-A1b，其中等位基因Ppo-A1a與高多酚氧化酶活性相關(guān)，等位基因Ppo-A1b與低多酚氧化酶活性相關(guān)^[8]。He等克隆出位于2DL染色體上的Ppo-D1基因，并開發(fā)設(shè)計(jì)了分子功能標(biāo)記PPO16和PPO29用于檢測等位基因 Ppo-D1a和Ppo-D1b，其中等位基因Ppo-D1a與低多酚氧化酶活性相關(guān)，等位基因Ppo-D1b與高多酚氧化酶活性相關(guān)^[9]。標(biāo)記PPO18、PPO16和PPO29的準(zhǔn)確性和可靠性又先后在我國不同麥區(qū)的材料中得到了驗(yàn)證^[10-12]，隨后國內(nèi)學(xué)者利用上述標(biāo)記又在新疆、陜西、甘肅、黑龍江、四川和貴州小麥材料中進(jìn)行了檢測應(yīng)用^[13-18]。

河南是我國小麥重要的生產(chǎn)省份之一，選育低多酚氧化酶活性的小麥品種有利于小麥面粉品質(zhì)的色澤改良。本研究選用123份河南新育小麥品種為試驗(yàn)材料，利用功能標(biāo)記PPO18、PPO16和PPO29對(duì)供試材料的Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)等位基因進(jìn)行分子檢測，以了解多酚氧化酶活性基因在河南新育成小麥品種中的分布情況，進(jìn)而篩選出攜帶低多酚氧化酶活性基因的小麥資源材料，從而為河南省一線育種人員進(jìn)行小麥品質(zhì)色澤改良提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為參加2020—2021年度河南省區(qū)域試驗(yàn)的小麥品種，共計(jì)123份（表1）。這些材料經(jīng)過2年品種比較試驗(yàn)晉級(jí)而來，可以很客觀地反映河南當(dāng)前的小麥育種情況。

1.2 基因組DNA提取

提取基因組DNA所用試劑的配制以及提取均參考袁謙等^[19]和陳杰等^[20]的方法進(jìn)行。

1.3 分子標(biāo)記檢測

選用標(biāo)記PPO18對(duì)供試材料Ppo-A1位點(diǎn)的等位基因檢測，擴(kuò)增出685 bp條帶的材料記為Ppo-A1a類型等位基因，擴(kuò)增出876 bp條帶的材料記為Ppo-A1b類型等位基因;選用標(biāo)記PPO16和PPO29對(duì)供試材料Ppo-D1位點(diǎn)的等位基因檢測，擴(kuò)增出713 bp條帶的材料記為Ppo-D1a類型等位基因，擴(kuò)增出490 bp條帶的材料記為Ppo-D1b類型等位基因。所選用標(biāo)記的引物信息見表2。

利用ABI 9700型PCR儀器（美國伯樂公司生產(chǎn)）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，用0.6%的溴化乙錠染色，最后用AlphaImager HP型凝膠成像系統(tǒng)（美國Protein Simple公司生產(chǎn)）掃描成像保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理和表格制作。208899EF-BB0E-4B04-BFD8-DA6257A58E44

2 結(jié)果與分析

2.1 Ppo-A1位點(diǎn)等位變異的分子檢測

針對(duì)Ppo-A1位點(diǎn)，利用標(biāo)記PPO18對(duì)123份供試材料進(jìn)行分子檢測。檢測結(jié)果（圖1）顯示，中農(nóng)867、輪選128和苑豐16等78份材料可以擴(kuò)增出685 bp的條帶，記為Ppo-A1a類型等位基因，分布頻率為63.4%;百農(nóng)227、豫農(nóng)526和鄭麥189等45份材料可以擴(kuò)增出876 bp的條帶，記為Ppo-A1b類型等位基因，分布頻率為36.6%。從檢測結(jié)果分析可知：在123份供試材料的Ppo-A1位點(diǎn)上，以與高多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-A1a分布為主。

2.2 Ppo-D1位點(diǎn)等位變異的分子檢測

針對(duì)Ppo-D1位點(diǎn)，利用標(biāo)記PPO16和PPO29對(duì)123份供試材料進(jìn)行分子檢測（圖2、圖3）。檢測結(jié)果顯示，育麥6號(hào)、育麥699和中農(nóng)539等97份材料可以擴(kuò)增出713 bp的條帶，記為Ppo-D1a類型等位基因，分布頻率為78.9%;偃高167、溫育919和天民188等26份材料可以擴(kuò)增出490 bp的條帶，記為Ppo-D1b類型等位基因，分布頻率為21.1%。從檢測結(jié)果分析可知，在123份供試材料的Ppo-D1位點(diǎn)上，以與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-D1a分布為主。

2.3 多酚氧化酶活性基因在河南小麥材料中的分布

在123份供試材料Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)上共檢測到4種類型的等位基因組合（表1），與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1b/Ppo-D1a共檢測到32份，分布頻率為26%;與高多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1a/Ppo-D1b共檢測到13份，分布頻率為10.6%;與中等多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1a/Ppo-D1a和Ppo-A1b/Ppo-D1b分別檢測到65份和13份，分布頻率分別為52.8%和10.6%。從以上內(nèi)容分析可知，在123份供試材料的Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)上，以與中等多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1a/Ppo-D1a分布為主。

進(jìn)一步分析不同類型河南小麥材料的多酚氧化酶基因的分布（表3）可知，與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-A1b在來源于冬水組、南部組、強(qiáng)筋組、旱地組小麥材料中的分布頻率分別為30.4%、43.7%、35.7 %和45.5%，均低于與高多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-A1a，而在抗赤組小麥材料中則反之。與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-D1a在來源于冬水組、春水組、南部組、強(qiáng)筋組、抗赤組小麥材料中的分布頻率分別為82.6%、87.5%、75.0%、78.6 %和100.0%，均高于與高多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-D1b，而在旱地組小麥材料中則反之。與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1b/Ppo-D1a在來源于不同類型河南小麥材料中的分布頻率的大小順序?yàn)榭钩嘟M（60.0%）>春水組（37.5%）>南部組（31.3%）>強(qiáng)筋組（28.6%）>冬水組（21.7%）>旱地組（18.1%）。從以上內(nèi)容分析可知：與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因組合Ppo-A1b/Ppo-D1a在不同類型河南小麥材料中（除抗赤組）的分布頻率仍然較低。

3 討論與結(jié)論

了解多酚氧化酶活性基因的分布情況，可以為多酚氧化酶活性的遺傳改良提供參考信息。諸位國內(nèi)學(xué)者研究表明，等位基因Ppo-A1a、Ppo-A1b、Ppo-D1a和Ppo-D1b在貴州小麥中的分布頻率分別為90.37%、9.63%、15.56%和84.44%，在四川小麥中的分布頻率分別為47.6%、52.4%、74.3%和25.7%，在黑龍江小麥中的分布頻率分別為60.8%、36.0%、48.0%和52.0%，在甘肅小麥中的分布頻率分別為49.04%、50.96%、50.96%和49.04%，在陜西小麥中的分布頻率分別為47.1%、52.9%、30.4%和69.6%，在新疆小麥中的分布頻率分別為69.0%、31.0%、13.1%和86.9%^[13-18]。本研究表明，等位基因Ppo-A1a、Ppo-A1b、Ppo-D1a和Ppo-D1b在123份河南新育小麥品種中的分布頻率分別為63.4%、36.6%、78.9%和21.1%。綜合以上數(shù)據(jù)分析可知，與低多酚氧化酶活性相關(guān)的等位基因Ppo-A1b和Ppo-D1a在我國不同省份之間的分布頻率差異很大，等位基因Ppo-A1b在四川、甘肅和陜西小麥中的分布頻率均高于50%，而在貴州、黑龍江、新疆和河南小麥中的分布頻率均低于50%;等位基因Ppo-D1a在四川、甘肅和河南小麥中的分布頻率均高于50%，而在貴州、黑龍江、陜西和新疆小麥中的分布頻率均低于50%。今后在育種過程中應(yīng)當(dāng)對(duì)等位基因Ppo-A1b和 Ppo-D1a施加選擇壓力，淘汰攜帶等位基因Ppo-A1a和Ppo-D1b且綜合農(nóng)藝性狀差的材料，選擇攜帶等位基因Ppo-A1b和Ppo-D1a且綜合農(nóng)藝性狀好的材料，以促進(jìn)低多酚氧化酶活性小麥新品種的選育。

分子功能標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用是小麥分子育種領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。分子功能標(biāo)記是根據(jù)不同位點(diǎn)等位基因內(nèi)部的功能區(qū)開發(fā)設(shè)計(jì)，該功能區(qū)之間序列多態(tài)性的差異直接與所控制的性狀表型相關(guān)。因此，利用此項(xiàng)技術(shù)可大大提高分子標(biāo)記輔助育種的準(zhǔn)確性和效率。本研究選用的3個(gè)功能標(biāo)記PPO18、PPO16和PPO29穩(wěn)定性好，擴(kuò)增條帶清晰，可以快速準(zhǔn)確地檢測出Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)的等位基因變異情況，可直接作為多酚氧化酶活性基因分子輔助選擇的有效工具。此外，本研究篩選出了偃高161、商麥188和厚德麥971等32份攜帶等位基因組合Ppo-A1b/Ppo-D1a的小麥材料，在綜合考慮抗病性和產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀的前提下，可作為選育低多酚氧化酶活性品種的重點(diǎn)資源，在配置育種組合中加以利用。208899EF-BB0E-4B04-BFD8-DA6257A58E44

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