李曉麗, 應(yīng)天昊, 唐一迪, 祝璇, 孫萌萌, 余濤, 趙佳寧, 張雷明

(煙臺大學(xué) 藥學(xué)院 分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜過度增殖和炎癥細(xì)胞浸潤為特征的慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，會導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)損傷，甚至殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1-2]。全球RA的平均患病率約為0.5%～1.0%[3-4]，可出現(xiàn)在任何年齡段，以老齡和女性居多。在我國，隨著人口老齡化加重，RA患者人數(shù)也在逐年增多[5]。然而，RA的發(fā)病機制復(fù)雜，治療通常是以緩解癥狀來提高患者生活質(zhì)量。

目前，臨床治療RA的藥物主要有非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情抗風(fēng)濕藥、免疫抑制劑和生物制劑，在一定程度上都可緩解病癥，但長期使用會產(chǎn)生不同程度的不良反應(yīng)，患者依從性低[6-7]。RA在中醫(yī)中屬于“痹癥”“尫痹”“歷節(jié)”范疇[8-9]。在《金匱要略·痙濕暍病脈證治第二》中，麻黃加術(shù)湯是主治“濕家身煩疼”的重要方劑，其由麻黃、桂枝、甘草、杏仁、白術(shù)五味中藥配伍而成[10]。麻黃辛溫散寒、利水消腫，甘草補中益氣，桂枝溫經(jīng)通脈，白術(shù)除濕，杏仁利氣祛濕[11-12]。張仲景在《金匱要略》中指出“麻黃加術(shù)，則雖發(fā)汗不至多汗，而術(shù)得麻黃，并可行表里之濕下趨水道，又兩相維持也”[13]。有研究表明，麻黃加術(shù)湯可能通過降低IL-1β、TNF-α水平，抑制炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生從而發(fā)揮治療作用[14]。同時，麻黃加術(shù)湯還可以降低RA患者體內(nèi)T細(xì)胞亞群平衡來調(diào)節(jié)患者的免疫功能[15]。然而，對于麻黃加術(shù)湯在RA治療中的主要藥效成分和作用機制尚不明確，而中藥中的化學(xué)成分可以通過作用于機體內(nèi)多個靶點來發(fā)揮治療作用，這也給中藥的研究帶來一定的挑戰(zhàn)。

近年來，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從整體上探索藥物與疾病的相關(guān)性，是從系統(tǒng)上揭示中藥分子機制的重要手段[16]。因此，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，對麻黃加術(shù)湯治療RA的有效成分、靶點和作用機制進(jìn)行預(yù)測和分析。

1 材料與方法

1.1 麻黃加術(shù)湯活性成分和靶點獲取

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，獲取麻黃加術(shù)湯中麻黃、桂枝、甘草、杏仁和白術(shù)5種中藥的化學(xué)成分，以藥動學(xué)(absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME)參數(shù)[17](口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18)為條件進(jìn)行篩選，共得到131個活性成分。通過Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載活性成分的SDF結(jié)構(gòu)文件，上傳至Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)中檢索靶點，按P>0.5篩選后即得到活性成分作用靶點。通過Uniport數(shù)據(jù)庫對靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.2 RA潛在靶點獲取

在GeneCards(https://www.genecards.org/)、Drugbank(https://go.drugbank.com/)和在線人類孟德爾遺傳(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(https://www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫中，以 “Rheumatoid Arthritis” 為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，去除重復(fù)值，整理疾病靶點并與活性成分靶點取交集，得到麻黃加術(shù)湯治療RA的潛在靶點。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將1.2項獲取的潛在靶點上傳至STRING(https://string-db.org/)平臺，限定物種為“人”，最低相互作用閾值設(shè)為“medium confidence”(0.7)，將結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)并對結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.4 活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

構(gòu)建活性成分-靶點-通路的Network和Type文件，并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件中，構(gòu)建麻黃加術(shù)湯活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體分析和京都基因與基因組百科全書通路富集分析

將潛在靶點導(dǎo)入Metascape(http://metascape.org/gp/)數(shù)據(jù)庫，Input as species和Analysis as species都設(shè)置為Homo sapiens，將閾值設(shè)定為P<0.05，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，并進(jìn)行可視化處理，分析麻黃加術(shù)湯治療RA的可能作用機制。

1.6 分子對接

通過Pubchem網(wǎng)站檢索獲取1.3項結(jié)果中排名前12名的關(guān)鍵化合物的SDF結(jié)構(gòu)文件，并通過Open Babel 2.3.2軟件將所選化合物的SDF結(jié)構(gòu)文件轉(zhuǎn)化為PDB文件，從Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)數(shù)據(jù)庫中檢索獲得靶點蛋白PDBID。用AutoDockTools軟件對受體蛋白進(jìn)行修飾并轉(zhuǎn)化為pdbqt格式。以麻黃加術(shù)湯中關(guān)鍵化合物為配體，RA和麻黃加術(shù)湯共同作用靶點為受體，利用AutoDock Vina 1.1.2進(jìn)行分子對接，得到結(jié)合能打分，作為評價指標(biāo)對結(jié)果進(jìn)行分析，這種結(jié)合能是衡量配體是否能與受體分子有效結(jié)合的重要指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻黃加術(shù)湯活性成分獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B≥30% 和 DL≥0.18 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，得到麻黃加術(shù)湯中的活性成分共131個，其中麻黃23個、桂枝8個、甘草92個、杏仁19個、白術(shù)7個，麻黃與桂枝共有成分2個，麻黃與甘草共有成分3個，麻黃與杏仁共有成分1個，甘草與杏仁共有成分6個，麻黃、桂枝與杏仁共有成分1個，桂枝、甘草與杏仁共有成分1個。根據(jù)OB值排序，列舉出排名前20的成分，如表1所示。

表1 麻黃加術(shù)湯中OB值排名前20的活性成分Table 1 Active ingredients of Mahuangjiazhu Decoction by OB value (top 20)

表1(續(xù))

2.2 RA潛在靶點獲取

將2.1項中獲取的活性成分導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫并對結(jié)果進(jìn)行處理后，得到342個成分相關(guān)靶點。通過GeneCards、OMIM和Drugbank數(shù)據(jù)庫共得到RA靶點1 165個。兩者取交集后獲得麻黃加術(shù)湯治療RA的潛在靶點133個。

2.3 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

潛在靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中包括126個節(jié)點、1 956條邊，見圖1。節(jié)點大小和顏色表示該節(jié)點度值的大小，節(jié)點越大、橙色越深，對應(yīng)的度值越大。邊的不同顏色和粗細(xì)代表不同的結(jié)合分?jǐn)?shù)，邊越粗、顏色越藍(lán)，結(jié)合分?jǐn)?shù)越大。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，以度值≥35為條件進(jìn)行篩選，共得到22個核心靶點IL-6、TNF、TP53、STAT3、AKT1、VEGFA、CXCL8、JUN、MAPK8、MAPK1、IL-1β、MMP9、EGF、EGFR、PTGS2、CCL2、RELA、APP、ICAM1、MYC、IL-10、SRC，見表2，提示這些靶點蛋白可能在麻黃加術(shù)湯抗RA中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖1 潛在靶點PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.1 PPI network of potential targets

表2 核心靶點信息

2.4 GO富集分析和KEGG通路分析

將麻黃加術(shù)湯治療RA的潛在靶點進(jìn)行GO富集分析，得到GO條目2 283個，其中生物過程(biological process，BP)2 250條、細(xì)胞成分(cellular component，CC)89條和分子功能(molecular function，MF)152條。與BP相關(guān)的主要有對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)等；與CC相關(guān)的主要有膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；與MF相關(guān)的主要有細(xì)胞因子受體結(jié)合、受體調(diào)節(jié)活性、細(xì)胞因子活性等。根據(jù)P<0.05選擇 BP、CC和MF富集較高的前10個進(jìn)行可視化并生成柱狀圖，見圖2。

圖2 麻黃加術(shù)湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點的GO富集分析(排名前10)Fig.2 GO enrichment analysis of Mahuangjiazhu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis (top 10)

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對麻黃加術(shù)湯治療RA的潛在靶點進(jìn)行 KEGG 通路富集分析(P<0.05)，選取前20條通路，見圖3。如圖所示，這些潛在靶點主要富集在糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、癌癥信號通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17 信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、TNF信號通路、乙型肝炎、恰加斯病(美洲錐蟲病)、C型肝炎、麻疹等信號通路。

圖3 麻黃加術(shù)湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的KEGG通路分析(排名前20)Fig.3 KEGG enrichment analysis of Mahuangjiazhu Decoction in the treatment of rheumatoid arthritis (top 20)

2.5 藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

由于潛在靶點較多，所以將篩選出的核心靶點構(gòu)建麻黃加術(shù)湯活性成分-類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點-作用通路網(wǎng)絡(luò)，見圖4。其中，度值較大的成分有槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、甘草查爾酮A、刺芒柄花素等，均與多個靶點連接。度值較大的靶點包括PTGS2、MAPK1、JUN、RELA、MAPK8等。度值較大的通路涉及了糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE、癌癥信號通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、卡波西氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染等信號通路。

注：圖中紅色代表復(fù)方名，綠色代表中藥名(以拼音首字母代表)，紫色代表核心靶點，黃色代表麻黃加術(shù)湯活性成分，藍(lán)色代表作用通路。圖4 藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network of drug ingredients-targets-pathways

2.6 分子對接

選取PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的10個疾病相關(guān)靶點蛋白(AKT1、PTGS2、MAPK1、MAPK8、RELA、STAT3、CXCL8、IL-1β、IL-6、TNF)，分別與藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中排名前12的活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)果見表3。配體與受體結(jié)合性越好，結(jié)合能越低，一般結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 表明有較好的結(jié)合活性[18]。麻黃加術(shù)湯中的藥物活性成分與RA關(guān)鍵核心靶點對接分?jǐn)?shù)均小于-5.0 kJ/mol，表明麻黃加術(shù)湯中的活性成分能較好地與RA相關(guān)靶點結(jié)合，潛在生物活性高。其中AKT1與PTGS2靶點與12種活性成分結(jié)合能力較好，表明二者具有較好的結(jié)合能力，潛在生物活性高。

表3 活性成分與PPI網(wǎng)絡(luò)排名前10靶點的對接結(jié)果Table 3 Docking results of compounds in Mahuangjiazhu Decoction with top 10 targets sequencing in protein-protein interaction network

以對接結(jié)果最好的AKT1與Phaseol為例，采用分子對接的方法研究受體蛋白AKT1與Phaseol配體小分子之間的結(jié)合模式。圖5為受體蛋白AKT1與Phaseol配體小分子之間的結(jié)合模式，氨基酸殘基Ile290、Thr211與Phaseol配體小分子形成氫鍵相互作用，氨基酸殘基Gln79、Trp80、Asp292、Thr291、Leu210、Tyr272、Leu264、Val270、Lys268與Phaseol配體小分子形成疏水相互作用。

圖5 AKT1和Phaseol的分子對接圖Fig.5 Molecular docking diagram of Phaseol and AKT1

3 討論

近年來，中醫(yī)治療RA受到越來越多人的關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為，正氣不足、氣血兩虛是RA的發(fā)病基礎(chǔ)[19]。麻黃加術(shù)湯是濕法治療RA的重要方劑，麻黃配伍白術(shù)，不僅能達(dá)到微微發(fā)汗的最佳程度，還能適當(dāng)通利小便，達(dá)到內(nèi)外除濕的功效[13]。在RA的臨床治療中，麻黃加術(shù)湯也可顯著改善患者的關(guān)節(jié)功能，患者關(guān)節(jié)腫痛、麻木、腫脹等癥狀得到明顯緩解，并且降低了不良反應(yīng)和疾病復(fù)發(fā)率[20-21]。本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討麻黃加術(shù)湯治療RA的潛在分子機制。

本研究通過對麻黃加術(shù)湯的初步篩選得到131個活性成分和1 165個RA治療靶點，通過Venn圖和PPI網(wǎng)絡(luò)圖得到交集靶點133個和藥物活性成分與交集靶點結(jié)合的度值排名，得到與RA關(guān)系密切的核心蛋白，包括AKT1、IL-6、TNF、STAT3、VEGFA、MAPK8等。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過多種機制調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，影響關(guān)節(jié)炎病情的發(fā)展[22-25]。有研究證明，AKT1可以通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol-3-kinases/ protein kinase B/ mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR)信號通路抑制RA大鼠的軟骨細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡和自噬[26]。IL-6是主要的炎性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)大鼠滑膜成纖維細(xì)胞(FLS)中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-9的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，造成機體內(nèi)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞紊亂失衡，影響RA炎癥反應(yīng)進(jìn)展[27-28]。TNF可以刺激滑膜內(nèi)破骨細(xì)胞產(chǎn)生，加劇骨損傷[29]。此外，TNF還可以誘導(dǎo)FLS增殖，刺激FLS中IL-1β、MMP-3的表達(dá)，進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)軟骨，導(dǎo)致RA炎癥反應(yīng)進(jìn)展[30-31]。綜上所述，麻黃加術(shù)湯的有效成分可能通過調(diào)控AKT1、IL-6、TNF、STAT3、VEGFA、MAPK8等靶點來發(fā)揮治療RA的作用。

通過GO富集分析得到了麻黃加術(shù)湯影響的生物過程包括對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌起源分子的反應(yīng)、對無機物的反應(yīng)等多個生物學(xué)過程，并通過 KEGG 對藥物影響的疾病通路進(jìn)行富集，結(jié)果顯示其對AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、 TNF信號通路和Toll 樣受體信號通路等有調(diào)控作用。有研究表明，AGE-RAGE可以刺激促炎因子的產(chǎn)生，同時，還可以充當(dāng)炎癥因子來激活先天免疫細(xì)胞，進(jìn)一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[32-33]。IL-17信號通路和TNF信號通路可以介導(dǎo)RA炎癥反應(yīng)，參與RA相關(guān)的破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞等的功能調(diào)節(jié)，刺激炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致滑膜增殖、血管增生[34]。Toll 樣受體信號通路的激活也可以誘導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生、FLS增殖以及中性粒細(xì)胞募集進(jìn)而導(dǎo)致軟骨破壞和關(guān)節(jié)損傷[35-36]。由此可推測，麻黃加術(shù)湯可能通過調(diào)節(jié)多種信號通路進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡、增殖和炎癥反應(yīng)來發(fā)揮治療RA的作用。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法對麻黃加術(shù)湯治療RA的機制進(jìn)行探討，在藥物成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖中對麻黃加術(shù)湯治療RA的關(guān)鍵活性成分進(jìn)行篩選。分子對接結(jié)果顯示，核心有效成分與核心靶點的結(jié)合能均≤-5 kJ/mol，說明成分與靶點的結(jié)合能力較好，其中槲皮素、木犀草素、山奈酚的度值排名靠前，提示其在麻黃加術(shù)湯治療RA中發(fā)揮的作用最大。有研究表明，槲皮素可以抑制RA小鼠體內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤，降低細(xì)胞中炎癥因子水平，同時還能促進(jìn)活化的中性粒細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮治療RA的作用[37]。木犀草素可以抑制RA大鼠FLS增殖，同時也能降低MMP-1和MMP-3的分泌，通過抑制絲裂原活化蛋白激酶 (Mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路和PI3K/Akt信號通路來達(dá)到治療RA的目的[38]。山奈酚可以通過抑制MAPK通路來減少FLS遷移、肌動蛋白細(xì)胞骨架重組以及MMP的表達(dá)而發(fā)揮治療RA作用[39]。槲皮素、木犀草素、山奈酚等成分能與RA的核心靶點結(jié)合較好，說明其可能是麻黃加術(shù)湯治療RA的關(guān)鍵成分。

綜上所述，麻黃加術(shù)湯可能是通過槲皮素、木犀草素、山奈酚等關(guān)鍵成分調(diào)節(jié)AKT1、IL-6、TNF等靶點以及AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路進(jìn)而抑制機體炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療RA的作用。本研究初步預(yù)測了麻黃加術(shù)湯治療RA可能的作用機制，對于研究結(jié)果仍需要后續(xù)的實驗予以驗證。