韓聰，夏銘鴻，胡淵龍，張建偉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250011;2. 浙江大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310000; 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心，山東 濟(jì)南 250011)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)為育齡期女性常見內(nèi)分泌紊亂疾病，特征表現(xiàn)為高雄激素及排卵障礙，常伴發(fā)月經(jīng)失調(diào)、不孕、肥胖等多種臨床癥狀，對生育期女性健康影響主要表現(xiàn)在生育力的降低、妊娠期并發(fā)癥及新生兒不良結(jié)局等[1]。PCOS病因尚未明確，但癥狀和體征上的異質(zhì)性提示其非單一因素引起[2]。治療多采用個體化治療方案，西醫(yī)主要通過避孕藥、促排卵藥物等控制和緩解高雄激素血癥的臨床癥狀和預(yù)防不孕等，但用藥需謹(jǐn)慎，長期用藥或可導(dǎo)致不良疾病風(fēng)險(xiǎn)增加，如心血管疾病等[3]；中醫(yī)診療強(qiáng)調(diào)整體觀念，從整體調(diào)整氣血陰陽，在治療PCOS方面確有優(yōu)勢[4]。續(xù)斷-桑寄生藥對在臨床常用于治療PCOS，桑寄生功長補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕、安胎；續(xù)斷功善補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷；二者合用更增補(bǔ)益肝腎之功，且有調(diào)任固沖之效。中醫(yī)學(xué)者多主張PCOS病因病機(jī)為肝脾腎三臟功能失常，沖任不能相資，故治療多以補(bǔ)腎益陰，調(diào)沖任為主。曾蕾等[5]在分析、探討羅氏婦科治療PCOS的中藥周期序貫療法規(guī)律中發(fā)現(xiàn)，腎虛痰濕型PCOS患者基礎(chǔ)體溫雙相波動的聯(lián)合用藥中，續(xù)斷-桑寄生藥對使用頻率最高。肖承悰教授以續(xù)斷-桑寄生為核心藥對配伍治療PCOS，總治療有效率為95.31%[6]。但是，目前續(xù)斷-桑寄生藥對改善PCOS的作用機(jī)制尚不清晰。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種借助網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及計(jì)算機(jī)智能計(jì)算，建立藥物成分、靶點(diǎn)與疾病間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，探析藥物對疾病作用機(jī)制的新生物信息學(xué)方法[7]。中醫(yī)學(xué)以整體觀和辨證論治為基本特點(diǎn)的理論體系，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性和系統(tǒng)性的特色相契合。現(xiàn)已有研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，揭示了當(dāng)歸-菟絲子藥對[8]、半夏-蒼術(shù)-香附藥對[9]等治療多囊卵巢綜合征的作用機(jī)制，故本研究嘗試借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，系統(tǒng)地分析續(xù)斷-桑寄生藥對改善PCOS的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 續(xù)斷-桑寄生藥對活性成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測

登陸中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php，update by May 31th，2014，v2.3)，選擇 Herb name，依次輸入“Xuduan”“Sangjisheng”為關(guān)鍵詞搜索續(xù)斷、桑寄生的化學(xué)成分；選擇口服生物利用度(oral bioavailability，OB)及類藥性(drug-likeness，DL)為篩選條件，因桑寄生活性成分較少，DL≥0.05條件下生物利用度均良好，故篩選OB≥30%及DL≥0.05的藥對活性成分，去重后得到主要活性成分。同時(shí)，提取其蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，最終整理得到續(xù)斷與桑寄生的活性成分及其對應(yīng)靶標(biāo)。

1.2 多囊卵巢綜合征疾病靶點(diǎn)收集

選擇Disgenet數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org)以及OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)，對關(guān)鍵詞為“Polycystic ovaries”或“Polycystic Ovary Syndrome”疾病的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行檢索及篩選，并對所得結(jié)果進(jìn)行合并去重獲得PCOS疾病靶點(diǎn)信息。

1.3 中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

為探討續(xù)斷-桑寄生藥對活性成分靶點(diǎn)與PCOS疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系，利用在線作圖工具微生信平臺(http：//www.bioinformatics.com.cn/)繪制維恩圖，獲得續(xù)斷-桑寄生藥對活性成分靶點(diǎn)與PCOS疾病靶點(diǎn)的交集基因。運(yùn)用Cytoscape 3.7.0軟件繪制中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 交集基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用

采用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction， PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)定生物種類為“Homo sapiens”，最小相互作用閾值Highest confidence>0.9為篩選條件。

1.5 富集分析

為進(jìn)一步探索續(xù)斷-桑寄生藥對治療PCOS潛在靶點(diǎn)在信號通路中的作用，將交集基因?qū)隡etascape(https://metascape.org/)進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and gnomes， KEGG)通路及基因本體(gene ontology，GO)富集分析，依據(jù)所得結(jié)果分析預(yù)測續(xù)斷-桑寄生藥對治療PCOS的可能機(jī)制。將通路P值由小到大排序，并進(jìn)行可視化展示。

1.6 成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為進(jìn)一步呈現(xiàn)續(xù)斷-桑寄生藥對與PCOS作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以count值為篩選條件，得到前10條關(guān)鍵通路，與續(xù)斷-桑寄生藥對的活性成分及潛在靶點(diǎn)相映射，并利用Cytoscape軟件繪制活性成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)，探究該藥對改善PCOS的潛在作用機(jī)制。

1.7 主要活性成分與靶點(diǎn)的分子對接驗(yàn)證

在PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)檢索并下載核心靶點(diǎn)的3D蛋白結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行預(yù)處理，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫下載主要活性成分的結(jié)構(gòu)，將處理后的蛋白與分子輸入AutoDock Vina進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，借助Pymol進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及靶點(diǎn)篩選

篩選出續(xù)斷-桑寄生藥對的活性化合物共13個(續(xù)斷8個，桑寄生6個，桑寄生和續(xù)斷共有1個)，并對篩選得到潛在靶點(diǎn)的活性化合物進(jìn)行編號，見表1。對 TCMSP 所得的252個潛在靶點(diǎn)(其中有4個化合物未查詢到潛在靶點(diǎn)信息)進(jìn)行去重后整理獲得174個靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

對所得結(jié)果合并及去重后共獲得1 606個PCOS相關(guān)疾病靶點(diǎn)。

2.3 中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與結(jié)果分析

共獲得交集基因80個，維恩圖見圖1。通過Cytoscape 軟件得到中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)見圖2。分析圖2可得，186個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中藥物節(jié)點(diǎn)2個，活性成分節(jié)點(diǎn)10個，靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)174個，成分與靶點(diǎn)之間邊239條；靶點(diǎn)數(shù)前7位的成分為槲皮素(quercetin，桑寄生)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，續(xù)斷)、龍膽黃素(gentisin，續(xù)斷)、(z)-石竹烯((z)-caryophyllene，桑寄生)、谷甾醇(sitosterol，續(xù)斷)、林生續(xù)斷苷Ⅲ(sylvestroside III，續(xù)斷)、當(dāng)藥糖苷(sweroside aglycone,續(xù)斷)、威巖仙皂苷A(cauloside A，續(xù)斷)，這些成分可能為續(xù)斷-桑寄生藥對治療PCOS的關(guān)鍵成分。

圖1 活性成分與疾病靶點(diǎn)的維恩圖Fig.1 Venn diagram of active ingredients and disease targets

注：XD為續(xù)斷，SJS為桑寄生。圖2 中藥-活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 TCM-active ingredient-disease target network

2.4 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)分析

續(xù)斷-桑寄生藥對活性成分靶點(diǎn)與PCOS靶點(diǎn)交集的PPI網(wǎng)絡(luò)圖見圖3。分析圖3可知，該網(wǎng)絡(luò)含有80個節(jié)點(diǎn)與233條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值是5.83，平均介數(shù)值是0.469。續(xù)斷-桑寄生藥對可能通過相關(guān)靶點(diǎn)AKT1、CASP3、MAPK1、FOS等發(fā)揮治療PCOS的作用。

圖3 活性成分與疾病靶點(diǎn)交集的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Protein-protein interaction network of the active ingredients and disease targets

2.5 KEGG與GO富集分析

導(dǎo)入交集基因至Metascape數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行KEGG分析，獲得KEGG條目168個(P<0.001)，主要涉及癌癥信號通路、切變應(yīng)激和血管粥樣硬化信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、丙型肝炎信號通路以及胰島素抵抗信號通路等，詳見圖4。GO分析共得到生物學(xué)功能94個、生物過程1 722個、細(xì)胞組分53個，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白酶結(jié)合泛素樣、蛋白連接酶結(jié)合等生物學(xué)功能,與凋亡信號通路、對損傷活性氧代謝過程、血管發(fā)育反應(yīng)過程、對脂多糖的反應(yīng)、對有毒物質(zhì)的反應(yīng)等生物學(xué)過程密切相關(guān)，過程涉及膜筏、細(xì)胞外間質(zhì)、核被膜等細(xì)胞組分。其中生物學(xué)功能、生物過程、細(xì)胞組分富集基因數(shù)排序前10位的GO分析結(jié)果見表2～4。

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis

表2 續(xù)斷-桑寄生治療PCOS涉及的主要生物學(xué)功能

表3 續(xù)斷-桑寄生治療PCOS涉及的主要生物學(xué)過程Table 3 The main biological processes involved in the treatment of PCOS using Dipsaci Radix-Taxilli Herba

表4 續(xù)斷-桑寄生治療多囊卵巢綜合征涉及的主要細(xì)胞組分Table 4 The main cellular components involved in the treatment of PCOS using Dipsaci Radix-Taxilli Herba

2.6 成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果分析

繪制關(guān)鍵通路與續(xù)斷-桑寄生藥對的活性成分及交集潛在作用靶點(diǎn)的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，詳見圖5。分析圖5可知，續(xù)斷-桑寄生藥對可能通過多個活性成分、靶點(diǎn)及通路對PCOS發(fā)揮治療作用。其中，重要的成分有桑寄生中的槲皮素，續(xù)斷中的β-谷甾醇等，主要靶點(diǎn)有AKT1、MAPK1、TNF、IL-6、CASP3等，其中核心靶點(diǎn)為AKT1，通路主要涉及癌癥信號通路(pathways in cancer)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、丙型肝炎信號通路(Hepatitis C)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)以及胰島素抵抗信號通路(insulin resistance pathway)等。

圖5 成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Ingredient-target-key pathway network

2.7 分子對接驗(yàn)證

對 PPI所得預(yù)測結(jié)果中的核心靶點(diǎn)AKT1分別與續(xù)斷、桑寄生的主要活性成分槲皮素、林生續(xù)斷苷Ⅲ進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，見圖6。Autodock Vina分析其結(jié)合能分別為-13.81、-34.32 kJ/mol，認(rèn)為AKT1與槲皮素、林生續(xù)斷苷Ⅲ有效結(jié)合，預(yù)測結(jié)果可靠。

圖6 主要活性化合物與AKT1的分子對接圖Fig.6 Molecular docking diagram of active compounds and AKT1

3 討論

桑寄生-續(xù)斷是治療PCOS的常用藥對，具有補(bǔ)肝腎、益血安胎、調(diào)理沖任的功效，為壽胎丸、育陰湯、桑寄生散等方的重要藥對。同時(shí)，二者共用有補(bǔ)而不滯、 行而不泄的優(yōu)點(diǎn)[10]。多囊卵巢綜合征在中醫(yī)學(xué)中并無明確記載，古籍中記載的“惟彼肥碩者……痰涎壅滯……故有過期而經(jīng)始行，或數(shù)月經(jīng)一行，及為濁，為帶，為經(jīng)閉，為無子之病”[11]，據(jù)其臨床表現(xiàn)特點(diǎn)，應(yīng)隸屬于中醫(yī)學(xué)“月經(jīng)后期”“崩漏”“閉經(jīng)”“不孕”等疾病范疇。

目前，PCOS的病因并未明確，西醫(yī)認(rèn)為PCOS的發(fā)生與胰島素抵抗、高雄激素血癥密切相關(guān)，與慢性炎癥可能有關(guān)。治療可通過增加胰島素受體的敏感性、抗雄激素作用、下調(diào)亞臨床慢性炎癥因子等來延緩PCOS的發(fā)生與發(fā)展。有研究表明，PCOS患者血清中C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞介素-6( interleukin，IL-6)等炎癥因子水平與雄激素水平及胰島素抵抗呈正相關(guān)[12-13]，呈慢性低度亞臨床炎癥表現(xiàn)。PCOS患者體內(nèi)炎癥因子水平與腫瘤壞死因子-α( tumor necrosis factor-α，TNF-α) 等炎癥因子水平呈相關(guān)性[14]。

3.1 續(xù)斷-桑寄生治療PCOS 的主要活性成分

本研究在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選及預(yù)測的基礎(chǔ)上，整理得到續(xù)斷-桑寄生174個活性成分，通過富集分析發(fā)現(xiàn)桑寄生中的槲皮素，共有成分β-谷甾醇及續(xù)斷中的威巖仙皂苷A、龍膽黃素、林生續(xù)斷苷Ⅲ在治療PCOS中占有重要地位。槲皮素為黃酮類化合物，為桑寄生主要化學(xué)成分，已有研究表明槲皮素是減輕PCOS并發(fā)癥的潛在藥物[15]。臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，槲皮素可通過降低PCOS婦女胰島素抵抗、雄激素及促黃體生成素水平,上調(diào)AMPK和脂聯(lián)素受體的表達(dá)[16-18]改善 PCOS患者的代謝紊亂狀態(tài)。形成高脂血癥的主要因素為低密度脂蛋白膽固醇[19]，已有臨床實(shí)驗(yàn)表明，β-谷甾醇可顯著降低血清總膽固醇及低密度脂蛋白水平[20]，其降低血脂的效果優(yōu)于安妥明[21]。并且β-谷甾醇可通過增加機(jī)體免疫力[22]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[23]以及遏制腫瘤細(xì)胞增殖[24]等途徑，發(fā)揮減輕患者炎癥反應(yīng)的作用。續(xù)斷主要包含三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類化合物，以及生物堿等其他成分。威巖仙皂苷A為三萜皂苷類活性成分，三萜皂苷類可通過激活孕激素受體，誘導(dǎo)蛻膜化，為受精卵提供良好的植入條件[25]。龍膽黃素屬生物堿成分，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)生物堿可抑制子宮平滑肌的收縮活動，降低催產(chǎn)素誘導(dǎo)的子宮收縮力與張力[26]，從而提高女性生育力。

3.2 續(xù)斷-桑寄生治療PCOS 的主要作用靶點(diǎn)

本研究篩選整理得到的主要作用靶點(diǎn)有AKT1、MAPK1、TNF-α和IL-6，在胰島素信號傳導(dǎo)中有重要影響。AKT可影響雄激素水平，從而可以提高胰島素敏感性[27]。有動物實(shí)驗(yàn)證明二甲雙胍通過調(diào)控AKT信號傳導(dǎo)途徑改善胰島素抵抗[28]，而槲皮素也可通過調(diào)控AKT來改善糖代謝[29]。炎癥信號的慢行激活被認(rèn)為是胰島素抵抗的原因之一[30]。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-1β、IL-6和TNF-α水平來改善炎癥微環(huán)境從而降低PCOS大鼠模型中的胰島素抵抗[31]。IL-6是免疫應(yīng)答反應(yīng)中重要細(xì)胞因子，可協(xié)同TNF-α，增加胰島素抵抗水平[32]，從而導(dǎo)致PCOS的進(jìn)一步加重[33]。動物實(shí)驗(yàn)表明，IL-6等炎癥細(xì)胞因子可能通過胰島素抵抗，引起高胰島素血癥的代償發(fā)生，從而導(dǎo)致PCOS[34]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)降低TNF-α、IL-6水平可減輕胰島素抵抗，通過調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及生殖軸，推動卵泡發(fā)育成熟及誘發(fā)排卵[35]。

3.3 續(xù)斷-桑寄生藥對治療PCOS 的可能作用機(jī)制

基于KEGG及PPI網(wǎng)絡(luò)分析，預(yù)測續(xù)斷-桑寄生治療PCOS 的作用機(jī)制可能主要涉及癌癥信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、丙型肝炎信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、胰島素抵抗信號通路等。PCOS患者子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌的發(fā)病率呈數(shù)倍增高，本研究預(yù)測的癌癥信號通路是否與之相關(guān)，還需進(jìn)一步挖掘。PCOS婦女體內(nèi)促黃體生成素水平升高，促卵泡生成素水平不變或降低，繼而引起雄激素分泌增高,誘發(fā)高雄激素血癥，從而抑制排卵的發(fā)生，導(dǎo)致不孕的伴發(fā)；TNF-α能抑制促卵泡生成素的分泌[36]，進(jìn)而加重PCOS。槲皮素降低促黃體生成素水平，抑制TNF-α的作用，推測可能與炎癥信號通路有關(guān)。HIF-1是細(xì)胞缺氧耐受相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，是排卵過程中的關(guān)鍵因子，研究表明，胰島素可誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞激活HIF-1信號通路，該通路對PCOS卵巢功能具有調(diào)控作用[37]。PCOS患者主要表現(xiàn)為內(nèi)分泌代謝紊亂，常伴發(fā)肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、脂代謝紊亂等多種代謝異常疾病。臨床治療中，胰島素增敏劑能有效減緩胰島素抵抗發(fā)生與發(fā)展，改善糖代謝，并且可防止多系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)生。由此推測，續(xù)斷-桑寄生藥對治療PCOS主要通過改善激素代謝、抗炎、抗癌等機(jī)制發(fā)揮作用。

4 結(jié)語

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了續(xù)斷-桑寄生藥對改善PCOS 的作用機(jī)制，推測續(xù)斷-桑寄生藥對可能通過調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境、改善激素代謝從而調(diào)理內(nèi)分泌代謝紊亂，進(jìn)而達(dá)到緩解PCOS發(fā)生發(fā)展的目的，可為后期進(jìn)一步探究續(xù)斷-桑寄生藥對治療PCOS 的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。