曹廣文，張燕偉，陶夢(mèng)超，魏鵬晟，郎文萱，李興怡，金 戈，朱啟文

0 引言

焦慮癥是最常見的精神疾病，其發(fā)病率逐年上升[1]。焦慮癥的發(fā)病年齡通常在兒童或青少年時(shí)期，病程通常是慢性復(fù)發(fā)[2]。動(dòng)物研究表明，暴露于母嬰分離(Maternal separation，MS)的后代大腦和行為發(fā)生了改變，包括引起焦慮癥、抑郁癥、社交攻擊性增加[3-5]等。在斷奶后和青春期前后的社會(huì)隔離會(huì)引發(fā)動(dòng)物的行為改變和情感障礙，導(dǎo)致成年后動(dòng)物出現(xiàn)焦慮樣行為、攻擊性增加和認(rèn)知缺陷[6]。因此，研究治療焦慮癥的藥物具有重要意義，盡管藥物研發(fā)取得了顯著進(jìn)展，但許多焦慮癥患者仍無法對(duì)現(xiàn)有的藥物治療產(chǎn)生足夠的反應(yīng)[7]。

一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)是一類含血紅素的同工酶，在體內(nèi)有3種類型的NOS同工酶，即神經(jīng)元型一氧化氮合酶(Nerve nitric oxide synthase，nNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和內(nèi)皮型一氧化氮合酶。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，nNOS位于突觸后細(xì)胞膜內(nèi)，并通過突觸后密度95蛋白(Postsynaptic density-95，PSD-95)與N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR)物理連接。在生理?xiàng)l件下，“突觸” NMDAR的輕度激活使Ca2+大量涌入，Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，導(dǎo)致nNOS催化激活，產(chǎn)生的一氧化氮發(fā)揮不同的細(xì)胞作用。NMDAR的過度激活可能導(dǎo)致異常的Ca2+流入突觸后神經(jīng)元，并通過三元NMDAR/PSD-95/nNOS復(fù)合物的形成而導(dǎo)致nNOS的過度激活，nNOS過量是誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要因素[8]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用選擇性nNOS抑制劑7-硝基吲哚(7-Nitroindazole，7-NI)干預(yù)青春期大鼠類焦慮樣行為，并通過地佐環(huán)平(Dizocilpine，MK801)阻滯NMDARs，探討7-NI治療青春期大鼠類焦慮樣行為的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用SPF級(jí)成年Sprague-Dawley大鼠雌雄各10只，體重(250±20)g，購自遼寧省沈陽市長生生物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，按照中華動(dòng)物倫理學(xué)要求飼養(yǎng)和處理動(dòng)物，購買后雌雄分籠飼養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境，之后按照隨機(jī)原則一雌一雄合籠飼養(yǎng)，動(dòng)物房溫度：18～22 ℃，濕度：50%～60%，燈光照射時(shí)間為8∶00～20∶00，自由進(jìn)食飲水，每日檢查雌鼠情況，孕鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2 試劑 PSD-95抗體(Cell Signaling Technology公司，編號(hào)：sc32290)；nNOS抗體(Affinity Biosciences公司，批號(hào)：1560366)；一抗稀釋液(上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：20201115)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：010719190418)

1.3 儀器及裝置 多功能閉合式迷宮裝置(沈陽醫(yī)學(xué)院)；曠場(chǎng)箱；懸尾架；酶標(biāo)定量測(cè)試儀；-80 ℃低溫冰箱；低溫超速離心機(jī)(美國BECKMAN 公司)；高通量勻漿機(jī)；垂直電泳儀(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物建模 將10只母鼠在同一時(shí)期產(chǎn)下的90只仔鼠按照雌雄各半、同窩對(duì)照的原則隨機(jī)分為MS組和對(duì)照組，分娩當(dāng)天命名為PND0(Postnatal day 0)，MS組：從PND1至PND21，每天與母鼠連續(xù)分離6 h，分離前更換分離組子代大鼠籠墊料，檢查子代大鼠身體狀況[9-10]。PND21仔鼠斷奶后，MS組大鼠在PND21～PND39[11]期間單獨(dú)一個(gè)籠子孤養(yǎng)，對(duì)照組：正常飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)前。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)前將造模后健存的(因母鼠棄養(yǎng)而死亡4只)子代MS組大鼠進(jìn)行再次篩選分組，共分為5組，每組12只：分別為模型組、7-NI 25 mg組、7-NI 50 mg組，MK801+7-NI 25 mg/kg組。同樣，對(duì)照組仔鼠按照相同原則只保留12只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。剩余仔鼠不參與本次實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組和模型組均腹腔注射溶劑即1%的DMSO 25 mg/kg；7-NI 25 mg組和7-NI 50 mg組分別按照25 mg/kg和50 mg/kg注射7-NI；MK801+7-NI 25 mg/kg組先按照0.075 mg/kg注射MK801，15 min后注射25 mg的7-NI。注射時(shí)間均為每天行為學(xué)進(jìn)行前1 h[12-14]，實(shí)驗(yàn)流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 將單只大鼠放入自發(fā)活動(dòng)觀察箱內(nèi)(長50 cm，寬50 cm，高40 cm)，箱體底部被分割成中央?yún)^(qū)和外周區(qū)。箱體正中央上方配備一個(gè)白熾燈。將單只大鼠從固定的一角面壁放入箱內(nèi)，由兩名觀察者同時(shí)觀察并記錄大鼠在5 min內(nèi)中央?yún)^(qū)所待的累計(jì)時(shí)間以及在中央?yún)^(qū)累計(jì)站立次數(shù)，評(píng)價(jià)大鼠的焦慮樣行為[15]。

2.3.2 社會(huì)交往實(shí)驗(yàn) 社會(huì)交往場(chǎng)實(shí)驗(yàn)裝置(長90 cm，寬90 cm，高50 cm)，房間燈光設(shè)置為昏暗。每只大鼠前2天適應(yīng)環(huán)境，第3天測(cè)試開始前，按性別分別將大鼠與另一陌生的伙伴隨機(jī)配對(duì)。每對(duì)互不熟悉的大鼠被同時(shí)放入該實(shí)驗(yàn)裝置內(nèi)，連續(xù)5 min記錄該測(cè)試大鼠在主動(dòng)社會(huì)交往行為中所花費(fèi)的總時(shí)間。

2.3.3 多功能閉合式迷宮實(shí)驗(yàn) 多功能閉合式迷宮(Multi-function closed maze,MCM)由直徑200 cm、高80 cm的圓柱體和一個(gè)同等直徑的圓形底盤組成。圓柱體被6個(gè)扇臂分為6個(gè)扇區(qū)，每個(gè)扇臂下方分別等間距分布1～4號(hào)4個(gè)門洞(高9 cm，寬11 cm，洞間距為10 cm)，正上方安裝有攝像裝置記錄數(shù)據(jù)[16-17]。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖2，路徑設(shè)計(jì)為A4-B1-C4-D1-E4(A4表示A臂的4號(hào)門)，F(xiàn)臂所有門均為關(guān)閉狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠面壁放入底盤，每只大鼠在迷宮內(nèi)自由探索10 min；軟件定義起始扇區(qū)的中央?yún)^(qū)并分析大鼠在該中央?yún)^(qū)累計(jì)停留時(shí)間、探索頻率，分析大鼠類焦慮樣行為。Noldus EthoVision11.5X軟件記錄數(shù)據(jù)。

圖2 MCM路徑起始扇區(qū)的中央?yún)^(qū)

2.3.4 取材 給藥1 h后按照30 mg/kg的劑量對(duì)大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉后冰上取腦。

2.3.5 Western blot檢測(cè)nNOS、PSD-95表達(dá) 海馬組織經(jīng)蛋白裂解液處理，取上清液，BSA法測(cè)定蛋白濃度。選用10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜及封閉后加入nNOS (1∶500)、PSD-95 (1∶500)、β-actin (1∶1 000) 4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h。加入ECL超敏發(fā)光液顯色，以β-actin作為內(nèi)參，用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖3A可見，與對(duì)照組相比，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)探索累計(jì)時(shí)間顯著減少(P<0.05，P<0.01)。與模型組相比，7-NI 25 mg和7-NI 50 mg組探索累計(jì)時(shí)間顯著增加(P<0.05)。

3.2 社會(huì)交往實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由圖3B可見，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組大鼠社交攻擊性顯著增加(P<0.001)，與模型組相比，7-NI 25 mg和7-NI 50 mg組大鼠社交攻擊性顯著減少(P<0.001)。

3.3 多功能閉合式迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果 由圖4可見，與對(duì)照組相比，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組大鼠在MCM中起始扇區(qū)自定義的曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)顯著減少(P<0.05)、訪問累計(jì)時(shí)間顯著減少(P<0.05)。與模型組相比，7-NI 25 mg組和7-NI 50 mg組曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)顯著增加(P<0.05)、訪問累計(jì)時(shí)間顯著增加(P<0.05)。

圖3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、社交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 多功能閉合式迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果

3.4 Western blot結(jié)果 由圖5可見，與對(duì)照組相比，模型組和MK801+7-NI 25 mg/kg組的PSD-95(P<0.01)及nNOS(P<0.05，P<0.01)表達(dá)均明顯升高，與模型組相比，7-NI 25 mg組、7-NI 50 mg組大鼠海馬區(qū)PSD-95(P<0.05)及nNOS蛋白(P<0.01，P<0.001)明顯表達(dá)減少。

圖5 Western blot結(jié)果

4 討論

在兒童社會(huì)-情感成長理論中，父母教養(yǎng)行為被認(rèn)為是兒童社會(huì)、情感、行為和認(rèn)知發(fā)展的關(guān)鍵因素[18]。嚙齒動(dòng)物MS被普遍用來研究生命早期應(yīng)激對(duì)個(gè)體發(fā)育過程中身心健康及學(xué)習(xí)記憶能力的影響[19]。斷奶后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的社會(huì)隔離會(huì)誘發(fā)許多行為和神經(jīng)化學(xué)異常，例如抑郁和焦慮。因此，母嬰分離和社會(huì)隔離動(dòng)物模型適合研究神經(jīng)精神癥狀的病理生理、探索治療神經(jīng)精神疾病的潛在藥物[20]。

nNOS廣泛表達(dá)于神經(jīng)元，當(dāng)機(jī)體面對(duì)壓力時(shí)，nNOS與PSD-95結(jié)合形成nNOS-PSD-95復(fù)合蛋白。PSD-95是一種介導(dǎo)谷氨酸能突觸可塑性、調(diào)解突觸穩(wěn)定性和樹突棘發(fā)生的突觸蛋白，參與調(diào)控多種神經(jīng)精神類疾病，介導(dǎo)興奮性毒性[21]。PSD-95與NMDAR相結(jié)合形成NAMDA-PSD-95-nNOS通路，研究表明，該通路功能障礙與多種神經(jīng)精神疾病有關(guān)[22]。MK801是選擇性最強(qiáng)的非競(jìng)爭(zhēng)性NMDAR阻滯劑之一[23]，可作為一種開放通道的阻滯劑，作用于NMDA受體操縱的離子通道。本研究結(jié)果表明，MS合并社會(huì)隔離導(dǎo)致青春期大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)訪問時(shí)間減少，并增加了社交攻擊性，其在多功能閉合式迷宮中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)和訪問累計(jì)時(shí)間均減少，7-NI治療增加了曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)訪問累計(jì)時(shí)間，顯著降低了社交攻擊性，增加了大鼠在迷宮中央?yún)^(qū)訪問頻數(shù)和訪問累計(jì)時(shí)間，表明25 mg/kg 和50 mg/kg的7-NI均可改善青春期大鼠焦慮樣行為，行為改變沒有隨著劑量增加而改變，這與已有報(bào)道一致：重復(fù)給予7-NI 大鼠不會(huì)導(dǎo)致腦 NOS 的累積抑制[24]。Western blot結(jié)果顯示，模型組的PSD-95、nNOS表達(dá)較對(duì)照組增多，經(jīng)過7-NI治療降低了模型組nNOS蛋白和PSD-95蛋白的表達(dá)，表明大鼠先后經(jīng)歷了母嬰分離合并社會(huì)隔離后大腦神經(jīng)產(chǎn)生興奮性毒性損傷，而7-NI可以通過降低神經(jīng)興奮性中毒改善焦慮樣行為。同時(shí)，為了研究7-NI對(duì)神經(jīng)突觸的影響是否具有NMDAR依賴性，在MK-801+7-NI處理組中，用MK801預(yù)處理后再給予7-NI(25 mg/kg)沒有改善焦慮樣行為，這表明7-NI治療焦慮樣行為作用是依賴NMDAR的。

綜上所述，7-NI改善了青春期大鼠焦慮樣行為，該治療作用可能與PSD-95/nNOS耦聯(lián)降低神經(jīng)興奮性中毒有關(guān)。