李 雪，張慧敏，許 謙 *，張 鑫，孫宜秀，尹明靜，張海麗，王宜磊，周廣燦，郭燕風(fēng)，唐 欣，李秉恩，丁紅振，賈世杰，王瑩菲，劉 進(jìn)

（1.菏澤學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，山東 菏澤 274015；2.青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266071；3.菏澤學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，山東 菏澤 274015）

桑黃（Phellinus igniarius）作為一種珍貴的藥用真菌，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗肺炎、抗氧化和抑菌消炎等醫(yī)用價(jià)值[1-5]。桑黃在藥理作用及化學(xué)成分等方面研究的非常多，但在桑黃營養(yǎng)保健價(jià)值方面還有很大的開發(fā)空間。作為藥食兩用的中藥，幾乎無毒副作用且富含多種次級(jí)代謝產(chǎn)物和抗氧化性物質(zhì)的桑黃，是保健食品加工的良好原料，有著巨大的市場(chǎng)需求。

與普通牛奶相比，酸奶風(fēng)味獨(dú)特、口感好，能夠減弱人體乳糖不耐受癥，改善胃腸功能[6-12]。隨著人們對(duì)健康飲品的關(guān)注，保健型酸奶產(chǎn)品逐漸受到大眾歡迎。

我國目前報(bào)道的保健酸奶品種有草莓酸奶、靈芝酸奶、紅棗酸奶等[13]，鮮見桑黃酸奶的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)將桑黃發(fā)酵液和酸奶制作相結(jié)合，通過研究為制作桑黃風(fēng)味酸奶提供科學(xué)依據(jù)，以期開發(fā)出新的酸奶產(chǎn)品，充分挖掘桑黃的食用價(jià)值，豐富酸奶產(chǎn)品類型，對(duì)桑黃深加工產(chǎn)品的開發(fā)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高蛋白脫脂高鈣奶粉：杜爾伯特伊利乳業(yè)有限責(zé)任公司；白砂糖（食品級(jí)）：北京古松經(jīng)貿(mào)有限公司；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、乳雙歧桿菌（Bifidobacterium）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）：西安綠騰生物科技有限公司；桑黃發(fā)酵液[14-16]：菏澤學(xué)院E208實(shí)驗(yàn)室提供。

葡萄糖、硫酸鎂、硫酸錳、無水乙醇（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏（生化試劑），蛋白胨、瓊脂粉（均為分析純）：北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司；磷酸氫二鉀（分析純）：西隴化工股份有限公司；檸檬酸三銨、氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；石油醚（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙醚（分析純）：萊陽經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；吐溫-80（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；伊紅美蘭瓊脂（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠。

1.2 儀器與設(shè)備

mLS-3780高壓蒸汽滅菌器：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；GL224l-1SCN電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YJ-VS-2雙人垂直超凈工作臺(tái)：無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；HH-W-420數(shù)顯恒溫水箱、HT113ATC糖度計(jì)：金壇市江南儀器廠；MJ-250-1恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HR/T20M臺(tái)式高速冰凍離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；C*21FS1顯微鏡：日本東京奧林巴斯公司；ZQZY-C8紫外分光光度計(jì)：上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合發(fā)酵菌劑的制備

（1）乳酸菌的活化：首先梯度稀釋保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和乳雙歧桿菌的菌種，在37 ℃條件下培養(yǎng)，進(jìn)行3次接種純化，并觀察3種乳酸菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)[17]。

（2）發(fā)酵菌劑制備：將純化的菌種分別接入12mL/100mL的滅菌乳液中，于42 ℃條件下擴(kuò)大培養(yǎng)3次至奶液凝固，在4 ℃冰箱中保存，3種乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合（8.4×108CFU/mL）使用[18]。

1.3.2 桑黃風(fēng)味酸奶制作工藝流程

桑黃發(fā)酵液、白砂糖、脫脂奶粉混合均勻→加水→攪拌溶解→滅菌（100 ℃、20 min）→冷卻（42 ℃）→接種發(fā)酵菌劑→發(fā)酵→冷卻→冷藏（4 ℃、18 h）→成品

1.3.3 桑黃風(fēng)味酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)[19]

（1）桑黃發(fā)酵液添加量的影響：固定白砂糖添加量6 g/100 mL、奶粉添加量16 g/100 mL、發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL，在42 ℃條件下發(fā)酵4 h，考察桑黃發(fā)酵液添加量（0、5 mL/100 mL、10 mL/100 mL、15 mL/100 mL、20 mL/100 mL、25 mL/100 mL、30 mL/100 mL）對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響。

（2）奶粉的添加量的影響：固定白砂糖添加量6g/100mL、桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL、發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL，在42 ℃條件下發(fā)酵4 h，考察奶粉添加量（14 g/100 mL、15 g/100 mL、16 g/100 mL、17 g/100 mL、18 g/100 mL）對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響。

（3）白砂糖添加量的影響：固定奶粉添加量16g/100mL、桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL、發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL，在42 ℃條件下發(fā)酵4 h，考察白砂糖添加量（2g/100mL、4g/100mL、6g/100mL、8g/100mL、10g/100mL）對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶感觀評(píng)價(jià)和酸度的影響。

（4）發(fā)酵菌劑接種量的影響：固定白砂糖添加量6 g/100 mL、奶粉添加劑量16 g/100 mL、桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL，在42 ℃條件下發(fā)酵4 h，考察發(fā)酵菌劑接種量（1 mL/100 mL、3 mL/100 mL、5 mL/100 mL、7 mL/100 mL、9 mL/100 mL）對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響。

（5）發(fā)酵時(shí)間的影響：固定奶粉添加量16 g/100 mL、白砂糖添加量6 g/100 mL、發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL、桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL，在42 ℃條件下分別發(fā)酵4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響。

（6）發(fā)酵溫度的影響：固定奶粉添加量16 g/100 mL、白砂糖添加量6 g/100 mL、發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL、桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL，分別在38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃條件下發(fā)酵4 h，考察發(fā)酵溫度對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)和酸度的影響。

1.3.4 桑黃風(fēng)味酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)6因素3水平正交試驗(yàn)，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)優(yōu)化桑黃風(fēng)味酸奶的發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 桑黃風(fēng)味酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization of Phellinus igniarius flavor yogurt

1.3.5 測(cè)定方法

感官評(píng)價(jià)：選取10位具有感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)組成評(píng)價(jià)小組，根據(jù)感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[19-21]分別從組織形態(tài)、口感、色澤風(fēng)味3個(gè)方面對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶進(jìn)行評(píng)分，滿分為100分，取10人的平均分。桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 桑黃風(fēng)味酸奶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of Phellinus igniarius flavor yogurt

酸度：參照文獻(xiàn)[20]的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定法測(cè)定；糖度：使用HT113ATC糖度計(jì)測(cè)定[21]；持水力：參照文獻(xiàn)[22]的離心稱質(zhì)量法測(cè)定；總固形物：參照文獻(xiàn)[23]的質(zhì)量法測(cè)定；蛋白質(zhì)：參照文獻(xiàn)[24]的考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；脂肪：參照文獻(xiàn)[25]的堿水解法測(cè)定。

乳酸菌數(shù)：參照文獻(xiàn)[26]的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測(cè)定；大腸桿菌：參照文獻(xiàn)[27]的伊紅美蘭平板計(jì)數(shù)法測(cè)定；金黃色葡萄球菌：參照文獻(xiàn)[28]的BP平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率：參照文獻(xiàn)[29]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑黃風(fēng)味酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 桑黃發(fā)酵液添加量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響

由圖1可知，隨著桑黃發(fā)酵液添加量的增加，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，酸度呈上升的趨勢(shì)。桑黃發(fā)酵液添加量＜20 mL/100 mL時(shí)桑黃風(fēng)味不明顯；桑黃發(fā)酵液添加量為20 mL/100 mL時(shí)，酸奶既有獨(dú)特的桑黃香味又具有濃郁的酸奶風(fēng)味，感官評(píng)分最高為83.2分，酸度為86°T；此后感官評(píng)分下降，桑黃發(fā)酵液添加量＞30 mL/100mL時(shí)酸奶較粗糙，過于黏稠，且桑黃味過重，影響口感。因此，選擇桑黃發(fā)酵液添加量為20 mL/100 mL比較適宜。

圖1 桑黃發(fā)酵液添加量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響Fig. 1 Effects of Phellinus igniarius fermentation broth on Phellinus igniarius flavor yogurt

2.1.2 奶粉添加量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶的影響

由圖2可知，隨奶粉添加量的增加，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，酸度則呈上升趨勢(shì)。奶粉添加量＜17 g/100 mL時(shí)凝乳不均勻，有氣泡，有乳清析出，口感較差；奶粉添加量為17 g/100 mL時(shí)，酸奶風(fēng)味濃郁，質(zhì)地均勻，口感好，感官評(píng)分最高為86.5分，酸度為85°T；奶粉添加量＞17 g/100 mL時(shí)，酸奶口感粗糙，色澤不均勻，無桑黃味道。因此，選擇奶粉添加量為17 g/100 mL比較適宜。

圖2 奶粉添加量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響Fig. 2 Effects of milk powder addition on Phellinus igniarius flavor yogurt

2.1.3 白砂糖添加量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶的影響

由圖3可知，隨白砂糖添加量的增加，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，酸度則呈緩慢上升趨勢(shì)。白砂糖添加量＜6 g/100 mL時(shí)，酸奶口感過酸，桑黃味道過重，有少量乳清析出；白砂糖添加量為6 g/100 mL時(shí)，酸奶風(fēng)味口感適中，色澤鮮亮，有良好的桑黃及酸奶的香氣，無乳清析出，感官評(píng)分最高為82.6分，酸度為84°T；白砂糖添加量＞6 g/100 mL時(shí)，酸奶口感過甜且粗糙，無桑黃味道，凝乳差，有大量乳清析出。因此，選擇白砂糖添加量為6 g/100 mL比較適宜。

圖3 白砂糖添加量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響Fig. 3 Effects of sugar content on Phellinus igniarius flavor yogurt

2.1.4 發(fā)酵菌劑接種量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶的影響

由圖4可知，隨發(fā)酵菌劑添加量增加，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分呈先上升后下降的趨勢(shì)，酸度隨著發(fā)酵菌劑接種量的增加而上升。發(fā)酵菌劑添加量＜5 mL/100 mL時(shí)，酸奶凝乳差，不能成形，有大量乳清析出；發(fā)酵菌劑接種量在5 mL/100mL左右比較適宜，此時(shí)酸奶凝固較好，酸甜適宜，口感最好，感官評(píng)分最高為83分，酸度為84 °T；發(fā)酵菌劑接種量＞5 mL/100 mL時(shí)，酸奶口感過酸，無桑黃味道。因此，選擇發(fā)酵菌劑接種量為5 mL/100 mL比較適宜。

圖4 發(fā)酵菌劑接種量對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響Fig. 4 Effects of fermentation agent inoculum on Phellinus igniarius flavor yogurt

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶的影響

由圖5可知，隨發(fā)酵時(shí)間不斷延長，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分呈先上升后下降趨勢(shì)，而酸度則隨發(fā)酵時(shí)間增加而上升。發(fā)酵時(shí)間＜5 h時(shí)酸奶凝固較差，不成形，無色澤，口感較甜；發(fā)酵時(shí)間在5 h左右比較適宜，此條件下，酸奶凝固好，口感細(xì)膩，酸甜適中，有桑黃及酸奶的香氣，感官評(píng)分最高為86.4分，酸度為89°T；此后感官評(píng)分下降，發(fā)酵時(shí)間＞5 h時(shí)酸奶較粗糙，過于黏稠，有少量乳清析出，表面無光澤，酸奶過酸，影響口感。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為5 h比較適宜。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響Fig. 5 Effects of fermentation time on Phellinus igniarius flavor yogurt

2.1.6 發(fā)酵溫度對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶的影響

由圖6可知，隨發(fā)酵溫度升高，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分呈先上升后下降趨勢(shì)，而酸度則不斷上升。發(fā)酵溫度＜42 ℃時(shí)酸奶凝固較差，不成形，有大量乳清析出，口感較甜；發(fā)酵溫度在42 ℃左右比較適宜，此條件下，酸奶酸度、黏稠度適宜，口感好，有桑黃及酸奶的香氣，感官評(píng)分最高為82.4分，酸度為85°T；發(fā)酵溫度＞42 ℃時(shí)酸奶較粗糙，表面無光澤，有少量乳清析出，酸奶過酸，口感差。因此，選擇發(fā)酵溫度為42 ℃比較適宜。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的影響Fig. 6 Effects of fermentation temperature on Phellinus igniarius flavor yogurt

2.2 桑黃風(fēng)味酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由表3可知，影響桑黃風(fēng)味酸奶品質(zhì)的因素及其影響程度依次為發(fā)酵菌劑接種量＞發(fā)酵溫度＞白砂糖添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞桑黃發(fā)酵液添加量＞奶粉添加量。桑黃風(fēng)味酸奶的最佳發(fā)酵條件為A1B2C2D2E2F3，即桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL、白砂糖添加量7 g/100 mL、奶粉添加量17 g/100 mL、發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL，在42 ℃條件下培養(yǎng)5 h。在此條件下，桑黃風(fēng)味酸奶的感官評(píng)分為92.2分。

表3 桑黃風(fēng)味酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of Phellinus igniarius flavor yogurt

續(xù)表

2.3 桑黃風(fēng)味酸奶產(chǎn)品指標(biāo)

在最佳條件下發(fā)酵得到的桑黃風(fēng)味酸奶色澤鮮亮，凝固均勻無雜質(zhì)，沒有乳清析出；口感細(xì)膩爽口，兼有桑黃特有的甘味和牛乳特有的奶香味，酸甜適中，沒有異味；感官評(píng)分為92.2分，酸度為85°T，糖度為8.2%，持水力為79.54%，總固形物含量為20.65 g/100 g，蛋白質(zhì)含量為1.86 g/100 g，脂肪含量為0.6 g/100 g。

桑黃風(fēng)味酸奶乳酸菌數(shù)為2.2×109CFU/mL，未檢出大腸菌群、金黃色葡萄球菌；對(duì)DPPH自由基清除率為46%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)將桑黃發(fā)酵液加入奶粉中共同發(fā)酵，制成具有桑黃口感的桑黃風(fēng)味酸奶。通過單因素及正交試驗(yàn)得到桑黃風(fēng)味酸奶的最佳發(fā)酵工藝條件為奶粉添加量17 g/100 mL、桑黃發(fā)酵液添加量15 mL/100 mL、白砂糖添加量7g/100 mL、混合發(fā)酵菌劑接種量5 mL/100 mL，于42 ℃條件下發(fā)酵5 h，得到的桑黃風(fēng)味酸奶色澤鮮亮，凝固均勻無雜質(zhì)，沒有乳清析出；口感細(xì)膩爽口，兼有桑黃特有的甘味和牛乳特有的奶香味，酸甜適中，沒有異味。感官評(píng)分為92.2分，酸度為85°T。