郭玲玲，何蕾，段鳳英

（1.南昌大學(xué)附屬人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科；2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌330006）

2018 年有報(bào)告[1]顯示肺癌是中國以及全世界發(fā)病率和死亡率最高的癌種。非小細(xì)胞肺癌占肺癌85%左右。多數(shù)非小細(xì)胞肺癌在確診時(shí)已經(jīng)喪失手術(shù)機(jī)會，目前的放化療效果有限，且不良反應(yīng)較大[2]。隨著越來越多的肺癌驅(qū)動基因被發(fā)現(xiàn)，精準(zhǔn)治療是目前及未來肺癌治療的方向。以吉非替尼、厄洛替尼為代表的表皮生長因子酪氨酸激酶抑制劑（Epidermal Growth Factor Receptor-tyrosine Kinase Inhibitors,EGFR-TKIs）是目前成功運(yùn)用于非小細(xì)胞肺癌的分子靶向藥物[3]。已被指南推薦應(yīng)用于存在EGFR敏感突變的非小細(xì)胞肺癌的一線治療，但隨后發(fā)現(xiàn)的繼發(fā)性和原發(fā)性耐藥降低了其臨床療效[4]。

目前臨床上多采用檢測EGFR的突變來預(yù)測肺癌對EGFR-TKIs的敏感性。存在EGFR基因敏感突變的非小細(xì)胞肺癌對TKIs的敏感性達(dá)75%（多為19外顯子的缺失及21外顯子的L858R點(diǎn)突變），但在治療的過程中或者治療后大多數(shù)會發(fā)生繼發(fā)性耐藥。而大多數(shù)EGFR野生型非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKIs原發(fā)性耐藥，但臨床上仍發(fā)現(xiàn)大約10%的EGFR野生型的非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKIs敏感，另外有小部分存在EGFR敏感突變的非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKIs耐藥[5-6]。這表明EGFR突變狀態(tài)不是評價(jià)非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKIs是否耐藥的唯一指標(biāo)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)的甲基化參與了TKIs的耐藥。本課題擬探討EGFR基因啟動子甲基化在肺腺癌細(xì)胞對吉非替尼原發(fā)及繼發(fā)性耐藥中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料試劑 肺腺癌細(xì)胞株購自上海肺癌研究所：H1299(對吉非替尼原發(fā)耐藥)，H1975(T790M突變，對吉非替尼繼發(fā)耐藥)，HCC827（19外顯子敏感突變，對吉非替尼敏感）；RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，10%胎牛血清購自美國Gibco公司；5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-CdR)購自美國sigma公司；吉非替尼粉劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，溶解于DMSO，制成實(shí)驗(yàn)相應(yīng)濃度1000倍的溶液，分裝保存于-20℃冰箱中備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋至目標(biāo)濃度，使終溶液中DMSO體積分?jǐn)?shù)低于0.1%。CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自Biosharp公司；重亞硫酸鹽DNA甲基化試劑盒購自Qiagen公司；DNA提取試劑盒購自上海天根化工有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌細(xì)胞株H1299、H1975、HCC827采用含有10%胎牛血清RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，繼續(xù)培養(yǎng)，每兩天換液1次，待長滿培養(yǎng)瓶后消化傳代，待傳到第3代，對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 甲基化檢測 肺腺癌細(xì)胞株H1299、H1975、HCC827培養(yǎng)至對數(shù)生長期后隨機(jī)分為兩組：A組：對照組（不加5-aza-CdR），B組：試驗(yàn)組（加入1μmol/L 5-aza-CdR處理），在第24 h、48 h、72 h 0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞，提區(qū)細(xì)胞DNA，進(jìn)行甲基化修飾，之后根據(jù)MSP試劑盒的流程進(jìn)行各組細(xì)胞EGFR甲基化的檢測。EGFR甲基化引物:正義鏈TGTTTTTTCGCGTTTCGGTTCGCGC；反義鏈：CGTCTAAACGACGACGACCGCCG；產(chǎn)物150 bp；EGFR非甲基化引物：正義鏈：TGTTTTGTTTTT TTGTGTTTTGGTTTGTGT；反義鏈：CATCCAATCTA AACAACAACAACCACCA；產(chǎn)物150 bp。將PCR產(chǎn)物電泳，根據(jù)條帶亮度，判斷3組細(xì)胞5-aza-CdR的最佳去甲基化時(shí)間。

1.2.3 CCK-8測增殖抑制率 培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞株H1299、H1975、HCC827，至對數(shù)生長期后隨機(jī)分為兩組。A組：對照組（不加任何藥物）；B組:5-aza-CdR組（加入1μmol/L 5-aza-CdR，處理時(shí)間為最佳的去甲基化時(shí)間72 h）；C組：吉非替尼組（加入1μmol/L的吉非替尼，作用時(shí)間同72 h）；D組：聯(lián)合處理組（1μmol/L 5-aza-CdR加1μmol/L的吉非替尼）；采用CCK-8方法測各組細(xì)胞的增殖抑制率。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)測細(xì)胞凋亡率 分別取處于對數(shù)生長期，生長狀態(tài)良好的H1299，H1975和HCC827細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度到3×105/mL，接入6孔板，每孔1 mL細(xì)胞懸液，37℃培養(yǎng)過夜；對細(xì)胞進(jìn)行分組，A組：正常對照組；B組：吉非替尼處理組（加入的1μmol/L的吉非替尼）；C組：5-aza-CdR處理組（加入1μmol/L的5-aza-CdR）；D組：吉非替尼+5-aza-CdR聯(lián)合處理組（加入1μmol/L吉非替尼和1μmol/L 5-aza-CdR）作用時(shí)間：72 h，收集細(xì)胞，1200 rpm，5 min離心，去上清，加PBS重懸細(xì)胞，按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行檢測四組細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 甲基化特異性PCR檢測 H1299細(xì)胞（EGFR野生型，對吉非替尼原發(fā)耐藥）EGFR啟動子是高甲基化，給予5-aza-CdR處理的最佳去甲基化時(shí)間為72 h（見圖1）；H1975細(xì)胞（T790M突變，對吉非替尼獲得性耐藥）EGFR啟動子為部分甲基化，甲基化程度低于原發(fā)耐藥的H1299細(xì)胞，給予5-aza-CdR處理的最佳去甲基化時(shí)間為72 h（見圖2）；HCC827細(xì)胞（19外顯子缺失突變，對吉非替尼敏感）EGFR啟動子為非甲基化的，給予5-aza-CdR處理其啟動子仍為非甲基化（見圖3）。

圖1 為H1299EGFR啟動子MSP結(jié)果：1.A組24 h M；2.A組24 h U；3.B組24 h M；4.B組24 h U；5.A組48 h M；6.A組48 h U；7.B組48 h M；8.B組48 h U；9.A組72 h M；10.A組72 h U；11.B組72 h M；12.B組72 h U；M：DL2000Ma rk（A組為對照組：不加任何藥物；B組為5-a za-Cd R組：加入1μmol/L 5-a za-Cd R；M代表甲基化；U代表非甲基化）。

圖2 為H1975EGFR啟動子MSP結(jié)果：1.A組24 h M；2.A組24 h U；3.B組24 h M；4.B組24 h U；5.A組48 h M；6.A組48 h U；7.B組48 h M；8.B組48 h U；9.A組72 h M；10.A組72 h U；11.B組72 h M；12.B組72 h U；M：DL2000Ma rk（A組為對照組：不加任何藥物；B組為5-a za-CdR組：加入1μmol/L 5-a za-Cd R；M代表甲基化；U代表非甲基化）。

圖3 為HCC827細(xì)胞EGFR啟動子MSP結(jié)果標(biāo)注（A組為對照組：不加任何藥物；B組為5-a za-Cd R組：加入1μmol/L 5-a za-Cd R；M代表甲基化；U代表非甲基化）：1.A組24 h M；2.A組24 h U；3.B組24 h M；4.B組24 h U；5.A組48 h M；6.A組48 h U；7.B組48 h M；8.B組48 h U；9.A組72 h M；10.A組72 h U；11.B組72 h M；12.B組72 h U；M：DL2000Ma rk。

2.2 CCK-8測各組細(xì)胞的增殖抑制率 1μmol/L的5-aza-CdR和1μmol/L吉非替尼分別及聯(lián)合處理H1299、H1975、HCC827細(xì)胞，72 h后CCK方法測定各組細(xì)胞的增殖抑制率，見表1。

表1 CCK方法測各組細(xì)胞的增殖抑制率（%）

2.3 流式細(xì)胞技術(shù)測細(xì)胞凋亡率 按照AnnexinVFITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作說明進(jìn)行操作測各組細(xì)胞的凋亡率，見表2。

3 討論

甲基化是表觀遺傳學(xué)的常見形式。DNA甲基化是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltrans--ferase DNMTs)的催化下由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基將之轉(zhuǎn)移到DNA的5’-胞嘧啶使之轉(zhuǎn)變?yōu)?’-甲基胞嘧啶的過程[7]。越來越多的研究證實(shí)甲基化參與了許多基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄，與多種藥物的耐藥相

關(guān)[8-9]。

目前已經(jīng)證實(shí)部分肺腺癌患者的EGFR啟動子存在著不同程度的甲基化。且臨床發(fā)現(xiàn)單純依靠EGFR基因突變的檢測來預(yù)測肺腺癌患者是否對EGFR-TKIs敏感，存在一定的失敗率。那么EGFR甲基化是否與肺腺癌對EGFR-TKIs的耐藥相關(guān)，成為解決EGFR-TKIs耐藥問題的一個(gè)突破點(diǎn)。強(qiáng)少盈等[10]通過檢測肺癌術(shù)后病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)EGFR敏感突變的肺癌患者均未發(fā)現(xiàn)甲基化，相反，未檢測出敏感突變的肺癌標(biāo)本存在較高的甲基化率，EGFR啟動子的甲基化與EGFR突變之間存在明顯相關(guān)性。孫俊杰等[11]研究6個(gè)不同的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，研究結(jié)果顯示，同為19外顯子敏感性突變，HCC827細(xì)胞對吉非替尼敏感，H1650細(xì)胞對吉非替尼不敏感；同為EGFR野生型，H358細(xì)胞較H1299、A549細(xì)胞對吉非替尼更敏感，甚至其敏感性超過19外顯子突變的H1650細(xì)胞。隨后作者通過甲基化特異性PCR、RT-PCR及Westernbolt檢測發(fā)現(xiàn)EGFR基因啟動子區(qū)高甲基化可以下調(diào)EGFR基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平，從而有可能降低非小細(xì)胞肺癌對EGFR-TKIs（如吉非替尼）的敏感性，所以作者認(rèn)為EGFR基因啟動子甲基化可能參與了肺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs的耐藥。

5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-CdR)是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，它能夠抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的活性從而使DNA甲基化水平降低，從而使轉(zhuǎn)錄失活的基因再表達(dá)。那么5-aza-CdR能否降低腫瘤細(xì)胞EGFR啟動子甲基化，從而提高EGFR基因的表達(dá)，改善腫瘤對EGFR-TKIs的耐藥。早在2006年Alerto J[12]曾在乳腺癌細(xì)胞株CAMA1和MB453中發(fā)現(xiàn)其EGFR啟動子區(qū)CpG甲基化分別為90%和30%～50%，作者采用RT-PCR及Western-blot分別檢測正常乳腺細(xì)胞株及EGFR啟動子非甲基化的和甲基化的細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)EGFR啟動子甲基化的細(xì)胞株存在EGFRmRNA及蛋白水平的低表達(dá)或者不表達(dá)。接著作者采用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱作用于兩個(gè)細(xì)胞株，72 h后，RT-PCR顯示EGFR的mRNA表達(dá)增加。乳腺癌細(xì)胞株CAMA1和MB453均對EGFR-TKI藥物吉非替尼相對耐藥，采用地西他濱及吉非替尼聯(lián)合處理后細(xì)胞凋亡增加，所以作者認(rèn)為甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和吉非替尼有協(xié)同作用。 遺憾的是國外沒有甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑和EGFR-TKIs聯(lián)合處理在肺癌中的研究，國內(nèi)僅有2013年Li XY等[13]研究分別及聯(lián)合采用吉非替尼及5-aza-CdR處理三個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1650、H1299、PC-9，并采用甲基化特異性PCR（MSP）檢測其EGFR啟動子甲基化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGFR啟動子為非甲基化的PC-9對吉非替尼敏感，EGFR啟動子高甲基化的H1650、H1299對吉非替尼耐藥，之后使用5-aza-CdR逆轉(zhuǎn)EGFR啟動子高甲基化后可以提高吉非替尼對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此作者認(rèn)為EGFR啟動子高甲基化可能與非小細(xì)胞肺癌對TKIs耐藥有關(guān)，降低EGFR甲基化也許可以逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對TKIs的耐藥。徐姝等[14]采用采用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜胞苷及吉非替尼分別及聯(lián)合處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H1650和H1299，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理組細(xì)胞的EGFR表達(dá)增加，細(xì)胞的凋亡增加。胡成平等[15]發(fā)現(xiàn)吉非替尼敏感細(xì)胞株P(guān)C9和耐藥細(xì)胞株P(guān)C9/GR的EGFR啟動子甲基化分別為59%和74%，但RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)PC9/GR的EGFRmRNA表達(dá)水平高于PC9細(xì)胞，這與之前的多數(shù)研究不相符，可能表明甲基化不是影響EGFRmRNA表達(dá)的唯一原因，但是具體機(jī)制不太清楚。

那么EGFR啟動子甲基化是否與肺腺癌細(xì)胞對吉非替尼原發(fā)性耐藥及繼發(fā)性耐藥均相關(guān)，在原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥中有無區(qū)別，以及EGFR啟動子去甲基化后是否可以逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥呢？本研究采用甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-CdR)及吉非替尼，分別及聯(lián)合處理肺腺癌細(xì)胞株H1299(原發(fā)耐藥),H1975(T790M突變，繼發(fā)耐藥),HCC827（19外顯子敏感突變）。通過甲基化特異性PCR檢測發(fā)現(xiàn)原發(fā)性耐藥的H1299細(xì)胞EGFR啟動子存在高甲基化，繼發(fā)性耐藥的H1975細(xì)胞EGFR啟動子為部分甲基化，甲基化程度低于原發(fā)耐藥的H1299細(xì)胞。存在敏感突變的HCC827細(xì)胞EGFR啟動子為非甲基化的，提示甲基化可能參與了肺腺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥，通過CCK-8法測定發(fā)現(xiàn)吉非替尼聯(lián)合5-aza-CdR可以明顯抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步分析吉非替尼聯(lián)合5-aza-CdR在改善肺腺癌細(xì)胞對EGFR-TKIs原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥中區(qū)別，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合可以更好的抑制原發(fā)性耐藥的H1299細(xì)胞的增殖，與繼發(fā)性耐藥相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組可以促進(jìn)H1299，H1975及HCC827三組細(xì)胞的凋亡，與單用吉非替尼組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但三組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

總之本研究證實(shí)EGFR啟動子區(qū)高甲基化可能參與了肺腺癌細(xì)胞對吉非替尼的原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥。對EGFR基因啟動子甲基化檢測可能對預(yù)測肺腺癌對吉非替尼的療效有一定的指導(dǎo)意義。5-aza-CdR聯(lián)合吉非替尼可以部分改善肺腺癌細(xì)胞對吉非替尼的耐藥，為未來解決肺腺癌對EGFR-TKIs耐藥提供新的研發(fā)思路。