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        青稞麩皮油提取工藝優(yōu)化及其抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

        2022-06-23 07:25:54羅龍龍任衛(wèi)合王麗萍高彩雯楊許花丁功濤NurulIzzaNordin陳士恩
        中國(guó)糧油學(xué)報(bào) 2022年5期
        關(guān)鍵詞:波糖麩皮阿卡

        羅龍龍, 任衛(wèi)合, 王麗萍, 高彩雯, 楊許花,丁功濤 , Nurul Izza Nordin, 陳士恩

        (西北民族大學(xué),生命科學(xué)與工程學(xué)院1,蘭州 730124) (西北民族大學(xué),生物醫(yī)學(xué)研究中心,中國(guó)-馬來(lái)西亞國(guó)家聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室2,蘭州 730124) (SIRIM有限公司工業(yè)生物技術(shù)研究中心3,莎阿南 40700)

        青稞是禾本科大麥屬的一種禾谷類(lèi)作物,在青藏高原等高海拔地區(qū)廣泛種植,青稞因其內(nèi)外穎殼分離,籽粒裸露,故又被稱(chēng)為裸大麥、元麥、米大麥。青稞具有降血糖、降血脂、改善代謝綜合征等潛力[1]。其活性成分豐富,對(duì)改善糖尿病有明顯的效果。而青稞麩皮屬于青稞加工副產(chǎn)物,其利用率低,所以人們常常忽略了青稞麩皮的價(jià)值。青稞中脂肪含量較低,但又含有人體必需的脂肪酸、亞油酸等,因此在降低血糖、血脂和預(yù)防動(dòng)脈硬化方面有良好的功效。青稞米粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為1.19%,而麩皮中粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.04%~7.45%[2]。有研究表明其脂肪酸的主要成分為C18∶1(9)、C18∶2(9,12)和C16∶0,在這些成分中C18∶2(9,12)含量為最高,麩皮油中的亞油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到了75. 1%[3]。通過(guò)對(duì)青稞麩皮油的研究發(fā)現(xiàn),青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶具有很強(qiáng)的抑制能力[4],與糖尿病治療藥物阿卡波糖相比,其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制能力明顯優(yōu)于阿卡波糖。因此其對(duì)II型糖尿病的治療有積極的作用。

        α-葡萄糖苷酶是一組在碳水化合物代謝和糖蛋白加工中起關(guān)鍵作用的酶,廣泛分布在小腸各段上,主要位于小腸黏膜細(xì)胞刷狀緣上[5]??蛇x擇性水解末端(1→4)連接的α-葡萄糖殘基(淀粉或二糖)以釋放單個(gè)α-葡萄糖分子。α-葡萄糖苷酶的功能包括糖原降解、糖蛋白折疊和成熟的N-連接加工以及負(fù)責(zé)飲食中的碳水化合物在腸道消化。所以抑制α-葡萄糖苷酶是改善糖尿病并發(fā)癥的治療途徑之一。而目前的抑制物副作用明顯,因此從天然產(chǎn)物中尋找一種新的抑酶物質(zhì)尤為重要。

        本實(shí)驗(yàn)以青稞麩皮為原料,利用超聲浸提法提取青稞麩皮油的同時(shí)使用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,研究料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率以及浸提時(shí)間對(duì)青稞麩皮油脂得率的影響。隨后對(duì)青稞麩皮油抑制α-葡萄糖苷酶的能力進(jìn)行研究,并對(duì)不同提取溶劑的抑酶能力分別進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程分析其抑制機(jī)制,為青稞麩皮油脂開(kāi)發(fā)為α-葡萄糖苷酶抑制劑提供了參考,并為青稞麩皮開(kāi)發(fā)利用提供了新的思路。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        青稞麩皮,西藏拉薩;α-葡萄糖苷酶(G5003,100UN,來(lái)源于酵母);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG);阿卡波糖;正己烷、乙酸乙酯、乙醇均為分析純;蒸餾水。

        1.2 儀器與設(shè)備

        AR224CN電子天平,Thermo 1510酶標(biāo)儀,Heraeus Multifuge×1R離心機(jī),J-HH-4A恒溫水浴鍋,RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,QE-200高速萬(wàn)能粉碎器,KQ-250B型超聲波清洗器。

        1.3 方法

        1.3.1 青稞麩皮油提取工藝流程

        青稞麩皮→粉碎→過(guò)篩(40目)→超聲浸提→分離→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→青稞麩皮油

        1.3.2 青稞油脂提取率計(jì)算[6]

        1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        稱(chēng)取青稞麩皮30 g,以正己烷為提取溶劑。選擇料液比、超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、浸提時(shí)間5個(gè)因素為變量,以青稞麩皮油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。通過(guò)改變其中一種因素,其他因素不變對(duì)青稞麩皮油提取工藝進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。其中各因素變量為:料液比(1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6 g/mL)、超聲時(shí)間分別為(20、25、30、35、40 min)、超聲功率為(150、175、200、225、250 W)、超聲溫度分別為(25、30、35、40、45 ℃)、浸提時(shí)間分別為(4、8、12、16、20 h),每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)提取3次。

        1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

        通過(guò)分析單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇超聲時(shí)間(A)、超聲功率(B)、超聲溫度(C)、浸提時(shí)間(D)為考查因素,以青稞麩皮油提取率為響應(yīng)值,使用Box-Behnken進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組合設(shè)計(jì),采用Design Expert 8.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,優(yōu)化出青稞麩皮油最佳提取工藝。

        1.3.5 青稞麩皮油抑制α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

        青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[7]中的方法并作修改。

        1.3.6 青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的動(dòng)力學(xué)分析

        實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)中的方法[8],配制不同質(zhì)量濃度的青稞麩皮油實(shí)驗(yàn)組(100、50、25、10 mg/mL)與酶濃度實(shí)驗(yàn)組(4.0、2.0、1.0、0.5 U/mL)以測(cè)定不同酶濃度的反應(yīng)速度,底物濃度設(shè)置為0.5 mmol/L,每組實(shí)驗(yàn)做3次平行,以酶濃度 [E]為橫坐標(biāo),反應(yīng)初速度 ν為縱坐標(biāo)作圖,通過(guò)圖的特征分析與酶的結(jié)合方式。青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型由Linewaver-Burk方法確認(rèn)[9]。用不同濃度的青稞麩皮提取物,與濃度分別為(0.125、0.25、0.5、1.0、2.5 mmol/L)的底物溶液,混勻,加入1 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液,測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制的反應(yīng)速率V。按 Lineweave-Burk 方程,以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標(biāo),1/V為縱坐標(biāo)繪制抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線,從而確定抑制類(lèi)型。

        1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

        數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件處理和繪圖,所有實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3次重復(fù),以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

        如圖1所示,隨著料液比的增加,青稞麩皮油提取率增加,并在料液比為1∶5時(shí)達(dá)到最大值,但是因其增加幅度較小,因此選擇料液比為1∶4較為合適,并且不列入響應(yīng)面優(yōu)化中。在超聲時(shí)間為30 min時(shí),青稞麩皮油提取率有明顯的增加并達(dá)到最大值。隨著超聲時(shí)間的增加,青稞麩皮油提取率出現(xiàn)降低。因此,選擇25、30、35 min為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。在超聲功率為225 W時(shí),青稞麩皮油提取率有明顯的增加并達(dá)到最大值。隨著超聲功率的增加,青稞麩皮油提取率出現(xiàn)降低。因此,選擇200、225、250 W為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。在超聲溫度為30 ℃時(shí),青稞麩皮油提取率有明顯增加并達(dá)到最大值。隨著超聲溫度的增加,青稞麩皮油提取率出現(xiàn)明顯降低。參考其他研究中的原因,發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)高會(huì)明顯影響提取率,可能的原因?yàn)闇囟冗^(guò)高導(dǎo)致溶劑揮發(fā),并且高溫會(huì)導(dǎo)致油脂酸敗現(xiàn)象的發(fā)生[10],而青稞麩皮中的油含量較低,影響較為明顯。因此,選擇25、30、35 ℃為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。在浸提時(shí)間為12 h時(shí),青稞麩皮油提取率有明顯增加并達(dá)到最大值。隨著浸提時(shí)間的增加,青稞麩皮油提取率出現(xiàn)降低。因此,選擇8、12、16 h為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的3個(gè)水平。

        圖1 料液比、超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度、浸提時(shí)間對(duì)青稞麩皮油提取率的影響

        2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

        通國(guó)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼見(jiàn)表1,以青稞麩皮油提取率為響應(yīng)值(Y),響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

        表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

        表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

        續(xù)表2

        2.2.1 回歸方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

        用Design Expert 12.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及表2進(jìn)行多元回歸擬合,得到青稞麩皮油提取率(Y)對(duì)提取時(shí)間A、提取功率B、提取溫度C、浸提時(shí)間D的二次多項(xiàng)回歸方程為:Y=3.42+0.49A+0.058B+0.42C+0.057D-0.077AB-0.33AC-0.032AD-0.12BC-0.15BD-0.080CD-0.40A2-0.38B2-0.37C2-0.44D2。

        對(duì)回歸方程的準(zhǔn)確性進(jìn)行方差分析,并確定各因素對(duì)青稞麩皮提取率的具體影響程度見(jiàn)表 3。通過(guò)分析表3數(shù)據(jù)可知,回歸方程P值小于0.01,可知回歸方程模型高度顯著,而失擬項(xiàng)P值為0.121 5,說(shuō)明該回歸方程與實(shí)際擬合度較好,可用于青稞麩皮油提取實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)中顯著的影響因素為超聲時(shí)間(A)和超聲溫度(C),而對(duì)提取率的影響大小依次為超聲時(shí)間(A)>超聲溫度(C)>超聲功率(B)>浸提時(shí)間(D)。二次項(xiàng)中A2、B2、C2和D2皆表現(xiàn)為極顯著。3個(gè)影響因素之間的互交作用影響中AC影響極顯著,而AB、AD、BC、BD、CD之間的互交作用影響不顯著。

        表3 響應(yīng)面方差分析

        2.2.2 提取工藝條件的確定及檢驗(yàn)

        使用Design Expert 12.0 軟件設(shè)計(jì)優(yōu)化得出的最佳提取條件為:超聲時(shí)間30 min,超聲功率225 W,超聲溫度30 ℃,浸提時(shí)間12 h。在此條件下進(jìn)行青稞麩皮油提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值為3.62%,與理論預(yù)測(cè)值基本相符,說(shuō)明該模型準(zhǔn)確,且優(yōu)化的條件正確。

        2.3 青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

        使用正己烷提取青稞麩皮工藝優(yōu)化后的青稞麩皮油與其他不同溶劑提取的提取物分別進(jìn)行體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)并以阿卡波糖作為對(duì)照。結(jié)果如圖2所示,以正己烷作為提取溶劑的青稞麩皮油抑酶作用顯著強(qiáng)于阿卡波糖。而乙酸乙酯及乙醇提取物與阿卡波糖效果相近。其中阿卡波糖IC50值為0.867 mg/mL,正己烷提取物的IC50值為0.736 mg/mL,乙酸乙酯提取物的IC50值為0.953 mg/mL,而乙醇提取物的IC50值為1.304 mg/mL。因此正己烷提取的青稞麩皮油比其他溶劑提取的青稞麩皮提取物抑酶效果更好。

        圖2 不同提取溶劑對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

        2.4 青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)制分析

        使用工藝優(yōu)化后的青稞麩皮油對(duì)不同濃度下的α-葡萄糖苷酶抑制作用的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。結(jié)果表明不同濃度的青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用具有線性關(guān)系,并且經(jīng)過(guò)原點(diǎn),隨著提取物濃度的不斷增加,斜率減小。由此說(shuō)明提取物并沒(méi)有改變酶的數(shù)量,而是降低了酶的活性。青稞麩皮油的抑制作用類(lèi)型屬于可逆的。

        圖3 青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制動(dòng)力學(xué)曲線

        青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒曲線如圖4所示。通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒曲線可以確定抑制類(lèi)型和抑制常數(shù),結(jié)果表明青稞麩皮油濃度增加,直線斜率越大。而所有擬合直線相交于第一象限,說(shuō)明青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于混合競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

        圖4 青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的 Lineweaver-Burk曲線

        3 討論

        目前應(yīng)用于臨床的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要為米格列醇(Miglitol)、阿卡波糖(Acarbose)和伏格列波糖(Voglibose)等,這些抑制劑具有明顯的副作用,例如患者服用后導(dǎo)致腫脹、脹氣、腹瀉和繼發(fā)性衰竭、治療效果不理想等[11]?,F(xiàn)在對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究主要集中于從天然產(chǎn)物中篩選或者是通過(guò)化學(xué)方法合成[12]。由于青稞含有多種活性物質(zhì),具有降血糖、降血脂、改善代謝綜合征等潛力[13]。李?lèi)偟萚14]研究發(fā)現(xiàn)青稞麩皮油能夠緩解動(dòng)脈硬化的小鼠癥狀,龔凌霄等[4]發(fā)現(xiàn)青稞麩皮油的α-葡萄糖苷酶抑制能力強(qiáng)于阿卡波糖,因此青稞麩皮油可作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑,但目前關(guān)于青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶作用方式和作用類(lèi)型尚不明確。本文以正己烷為溶劑,對(duì)超聲波輔助提取青稞麩皮油的工藝進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)單因素與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),優(yōu)化出的最終結(jié)果為:超聲時(shí)間30 min,超聲功率225 W,超聲溫度30 ℃,浸提時(shí)間12 h。隨后的體外α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)表明,正己烷作為溶劑提取的青稞麩皮油效果明顯強(qiáng)于阿卡波糖,其他溶劑提取物的效果明顯不如正己烷,乙醇、乙酸乙酯和正己烷這3種溶劑中,正己烷為非極性溶劑,而乙醇極性大于乙酸乙酯。不同溶劑的抑酶效果可能與不同溶劑的極性相關(guān),極性越小,抑酶效果越強(qiáng),并且不同極性的溶劑提取的物質(zhì)也有不同[15,16]。因此正己烷提取的阿卡波糖可作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

        通過(guò)抑制劑與酶不同的結(jié)合方式,抑制劑與酶的作用方式可分為不可逆抑制與可逆抑制[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型是可逆型抑制。這說(shuō)明酶與抑制物結(jié)合方式屬于非共價(jià)鍵結(jié)合,而可逆抑制類(lèi)型又可以分為反競(jìng)爭(zhēng)性抑制、競(jìng)爭(zhēng)性抑制和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)與非競(jìng)爭(zhēng)的混合型可逆抑制。橡子仁有機(jī)溶劑萃取[18]結(jié)果表明酶抑制類(lèi)型為混合型抑制,這與本研究結(jié)果類(lèi)似。

        本研究結(jié)果表明青稞麩皮油作為一種天然的α-葡萄糖苷酶抑制劑有很大的應(yīng)用潛力,對(duì)青稞麩皮油脂肪酸成分分析[19]表明,青稞麩皮油成分復(fù)雜,推測(cè)其對(duì)α-葡萄糖苷酶作用主要為混合型抑制[4],而這也與本研究結(jié)果相印證。但目前對(duì)青稞麩皮油的具體抑制機(jī)理研究較少,因此未來(lái)可以對(duì)此進(jìn)一步深入探索。

        4 結(jié)論

        通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化出青稞麩皮油最佳提取工藝為超聲時(shí)間30 min,超聲功率225 W,超聲溫度30 ℃,浸提時(shí)間12 h,優(yōu)化出最佳提取率為3.62%。使用該工藝處理過(guò)程簡(jiǎn)單,提取效率增加。而之后的α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)說(shuō)明青稞麩皮油的抑酶能力顯著強(qiáng)于市售阿卡波糖,并且正己烷作為溶劑提取的青稞麩皮油抑酶能力最佳,青稞麩皮油可作為一種潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑。抑制機(jī)制和酶動(dòng)力學(xué)研究表明青稞麩皮油對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型為可逆的混合型抑制,其在體內(nèi)具體作用方式仍需繼續(xù)探究。

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