廖 偉，付華霞,2，李祥玉,2，闞文濤，楊 夏，王 靜，趙 鵬，卓連剛，楊宇川，魏洪源

(1.中國工程物理研究院 核物理與化學研究所，四川 綿陽 621900；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 核醫(yī)學科，四川 瀘州 646000)

胃泌素釋放肽受體(GRPR)廣泛存在于多種腫瘤細胞中，在前列腺癌、肺癌、胃腸道癌中均顯著表達[1-2]。放射性核素標記的靶向多肽可以與GRPR陽性的腫瘤細胞特異性結合，用于腫瘤的診斷和治療[3-4]。近年來，一系列靶向GRPR的多肽用于顯像研究，取得了良好的效果，但是基于GRPR識別的放射性治療藥物的研究則相對滯后。這是因為放射性治療藥物需要更長的藥物滯留時間，更高的腫瘤組織比。藥物的內化，既可以提高藥物滯留時間，也可以使放射性核素更接近對放射性射線敏感的細胞核，從而提高細胞毒性，殺死癌細胞，因此內化對放射性治療藥物具有重要意義[5-8]。激動劑多肽可以完成細胞內化，但是激動劑存在副作用，限制了激動劑的使用[9-10]。雖然研究表明拮抗劑的特異性結合能力優(yōu)于激動劑，但是拮抗劑多肽不能完成細胞內化，很少用于放射性治療藥物的研究[11-12]。為了利用拮抗劑優(yōu)良的靶向特異性，同時提高細胞內化率，可以在拮抗劑上連接具有跨膜能力的基團，輔助完成藥物的內化?？缒ざ嚯?CPP)是常用的跨膜基團，但存在體內不穩(wěn)定、代謝快的缺點[13]?？缒ば》肿硬粌H可以完成跨膜作用，也具有更好的穩(wěn)定性。理論計算和實驗都表明，寡聚苯乙炔(OPE)是一類具有良好跨膜能力的小分子[14-17]，將OPE與拮抗劑通過化學鍵連接，同時連接配位基團，可以得到具有靶向、跨膜和放射性標記多功能一體的潛在放射性治療藥物前體。

RM26 (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2)是一種廣泛應用于顯像和治療研究的GRPR拮抗劑，能特異性靶向前列腺癌細胞[18-20]。將RM26和OPE結合，可以得到具有良好親和性和內化能力的藥物前體。人前列腺癌細胞(PC3)是一種GRPR陽性的細胞系，廣泛應用于GRPR陽性靶向研究，可以用于RM26及其衍生物的細胞內化研究[21-22]。

放射性核素的選擇對放射性治療藥物的療效和藥代動力學也有重要意義。177Lu具有合適的β發(fā)射和γ發(fā)射能量和合適的半衰期，廣泛應用于腫瘤的放射性診斷和治療[23-24]。2018年，177Lu-DOTATATE獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準，用于腸道神經內分泌瘤治療[25]，顯示了177Lu作為放射性治療核素的巨大價值。

因此，將具有跨膜能力的OPE和具有特異靶向性的RM26結合，并連接NOTA基團，可以得到放射性治療藥物前體NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26。選擇NOTA作為配體，可以用于177Lu、68Ga、Al18F等標記，以滿足不同需求[26]。本文對標記化合物的PC3細胞親和性、內化率和特異結合性進行研究，并討論引入跨膜基團OPE提高拮抗劑藥物細胞內化率的可行性。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

Agilent 1100高效液相色譜：美國安捷倫公司；CHA高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀：美國沃特世公司；PLC 2020液相色譜：美國吉爾森公司；Mini-Scan型TLC薄層放射性掃描儀：美國Bioscan公司；AE200電子天平：瑞士Ettler公司。

1.2 主要試劑

多肽RM26：成都凱捷多肽科技有限公司，純度>95%；寡聚苯乙炔：根據(jù)文獻[27]合成，經過1H NMR和13C NMR表征；177LuCl3：中國工程物理研究院核物理與化學研究所制備，核純度>99.9%，放化純度>99%，放射性濃度0.5 Ci/mL；p-NCS-Bn-NOTA：Macrocyclics，純度>95%。其他試劑均為分析純，從百靈威、阿拉丁公司購買。人前列腺癌細胞(PC3)：ATCC提供。

2 實驗方法

2.1 制備RM26多肽衍生物

NOTA-OPEs-RM26的合成路線示于圖1?？傮w合成過程為，具有對稱二酸結構的化合物Fmoc-L-β-谷氨酸-5-叔丁基酯1作為合成起始物，在三氟乙酸的作用下脫去叔丁基保護基，得到化合物2，然后使用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化兩個羧基，得到化合物3，接著分步加入RM26，寡聚苯乙炔OPE-1或OPE-2，哌啶，得到化合物4，最后加入p-NCS-Bn-NOTA，得到化合物5(圖1)。產物NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26結構示于圖2。

a——TFA, rt, 30 min; b——DCC, NHS, DMF, rt, 2 h;c—— RM26, DIPEA, DMF, rt, 8 h;d——OPE-1 or OPE-2, DMF, rt, 8 h;e——哌啶, DMF, rt, 3 h;f——p-NCS-Bn-NOTA, NEt3, DMF, rt, 2 h圖1 NOTA-OPEs-RM26的合成Fig.1 Syntheses of NOTA-OPEs-RM26

圖2 NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26結構示意圖Fig.2 Structures of NOTA-OPE-1-RM26 and NOTA-OPE-2-RM26

2.1.1化合物2的合成 200 mg化合物1溶解在1 mL三氟乙酸中，室溫攪拌30 min，減壓旋蒸除去溶劑，得到化合物2。

2.1.2化合物3的合成 依次將化合物2(1 eq)，DCC(2.1 eq)，NHS(2.1 eq)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫攪拌2 h，然后使用高效液相色譜分離，分離條件為：流動相為含0.1%三氟乙酸純水和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液，乙腈濃度0～30 min，20%～90%，流速：9 mL/min，得到化合物3。

2.1.3化合物4的合成 將化合物3(1 eq)，RM26(0.9 eq)溶解在DMF中，加入二異丙基乙胺(DIPEA，10 eq)，室溫攪拌8 h；然后加入OPE-1或OPE-2(1 eq)，室溫攪拌8 h；最后加入哌啶(100 eq)，繼續(xù)室溫攪拌3 h。反應結束后用HPLC分離樣品，分離條件為：流動相為含0.1%三氟乙酸純水和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液，乙腈濃度為0～30 min，20%～50%，流速：1 mL/min，得到化合物4。

2.1.4化合物5的合成 將化合物4(1 eq)，p-NCS-Bn-NOTA (1 eq)和三乙胺(10 eq)溶解在DMF中，室溫攪拌2 h。反應結束后使用HPLC分離樣品，分離條件為：流動相為含0.1%三氟乙酸純水和含0.1%三氟乙酸乙腈溶液，乙腈濃度：0～30 min，25%～50%，流速：1 mL/min，得到化合物5。

2.2 細胞培養(yǎng)

前列腺癌細胞(PC3)在含10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1% 青鏈霉素混合液雙抗(penicillin-streptomycin solution, PS)的高糖培養(yǎng)液(dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)F12培養(yǎng)基(Ham’s F 12 nutrient medium) (1∶1)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度37 ℃，CO2含量5%。

2.3 NOTA-OPEs-RM26的177Lu標記

將5 μL NOTA-RM26, NOTA-OPE-1-RM26或NOTA-OPE-2-RM26溶液(1 mmol/L)加入25 μL pH=5.5的醋酸鈉緩沖溶液中，加入0.8 μL177LuCl3(24 MBq)溶液，金屬浴80 ℃加熱反應1 h。點板，以pH=5.5的檸檬酸溶液為展開體系，使用iTLC檢測，并計算標記率。

2.4 177Lu-NOTA-OPEs-RM26體外穩(wěn)定性

取5 μL標記好的177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26，分別使用10 μL生理鹽水、高糖培養(yǎng)液、新生牛血清稀釋，稀釋液在室溫保存，分別在2、4、48、72 h使用iTLC檢測。

2.5 177Lu-NOTA-OPEs-RM26細胞內化

將177Lu-NOTA-RM26,177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26用細胞培養(yǎng)液稀釋至9.07 kBq/mL。在6孔板中接種PC3細胞，每個孔接種4×104個細胞，然后在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，然后將培養(yǎng)液吸走，加入1 mL稀釋好的177Lu-NOTA-RM26,177Lu-NOTA-OPE-1-RM26或177Lu-NOTA-OPE-2-RM26溶液，6孔板中37 ℃分別培養(yǎng)1、2、6、24 h。培養(yǎng)結束后，收集每個孔的培養(yǎng)液，并用0.8 mL PBS溶液清洗一次，合并培養(yǎng)液和清洗液，測量其放射性計數(shù)，作為細胞膜外放射性計數(shù)A外。冰浴冷卻，加入預冷的1 mL pH=2.0的尿素溶液(含4 mol/L尿素和0.2 mol/L甘氨酸)，冰浴靜置5 min，收集清液，重復一次，將兩次的尿素溶液合并，測量放射性計數(shù)，作為細胞膜放射性計數(shù)A膜。室溫下加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，靜置30 min，收集液體，重復一次，將兩次的氫氧化鈉溶液合并，測量放射性計數(shù)，作為細胞膜內放射性計數(shù)A內。分別計算細胞膜和細胞內放射性攝取率。細胞膜放射性攝取率：U膜=A膜/(A外+A膜+A內)；細胞內放射性攝取率：U內=A內/(A外+A膜+A內)。

2.6 177Lu-NOTA-OPEs-RM26細胞特異性結合

在6孔板中接種PC3細胞，每個孔接種4×104個細胞，在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后將培養(yǎng)液吸走，加入1 mL含1 000倍蛙皮素(bombesin, BBN)的培養(yǎng)液作為封閉劑[28]，37 ℃培養(yǎng)30 min，將培養(yǎng)液吸走，加入1 mL含有1 000倍BBN和標記化合物(667 Bq/mL)的培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)15、30、45 min，收集培養(yǎng)液，再用0.8 mL PBS清洗，合并兩次液體，測量放射性計數(shù)；加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，靜置15 min，收集液體，重復一次，將兩次的液體合并，測量放射性計數(shù)。

3 結果與討論

3.1 NOTA-OPEs-RM26的制備

化合物1合成得到化合物3的總產率為23%，化合物3合成得到化合物4的產率為19%(OPE-1)和21%(OPE-2)，最終產物NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26的產率為36%和41%?；衔锛兌群徒Y構通過高效液相質譜-質譜(LC-MS)驗證(圖3)。液相質譜結果表明，化合物的化學純度大于95%。質譜采用ESI源離子化，檢測得到一系列荷質比峰，與計算值相比，誤差均小于0.5，確證了化合物結構(表1)。

a——NOTA-OPE-1-RM26；b——NOTA-OPE-2-RM26圖3 LC-MS譜圖Fig.3 LC-MS spectra of NOTA-OPE-1-RM26(a) and NOTA-OPE-2-RM26(b)

表1 NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26荷質比計算值與檢測值Table 1 Calculated and detected specific charges of NOTA-OPE-1-RM26 and NOTA-OPE-2-RM26

3.2 NOTA-OPEs-RM26的標記

177Lu-NOTA-OPEs-RM26的放化純度使用iTLC檢測。展開劑為pH=5.5的檸檬酸溶液。Rf=[樣品位置(min) -起始位置(0.3 min)]/總距離(0.7 min)。游離177LuRf為0.91，標記后化合物Rf接近0。檢測結果表明，化合物177Lu-NOTA-OPE-1-RM26，177Lu-NOTA-OPE-2-RM26和177Lu-NOTA-RM26的標記率均大于99%(圖4)。

a——177Lu-NOTA-OPE-1-RM26；b——177Lu-NOTA-OPE-2-RM26；c——177Lu-NOTA-RM26；d——177LuCl3圖4 iTLC譜圖Fig.4 iTLC spectra

3.3 體外穩(wěn)定性

化合物177Lu-NOTA-OPE-1-RM26，177Lu-NOTA-OPE-2-RM26和177Lu-NOTA-RM26在生理鹽水、高糖培養(yǎng)液、新生牛血清中均穩(wěn)定存在，經過72 h后，三種化合物的放化純度均大于99%。

3.4 177Lu-NOTA-OPEs-RM26細胞內化

177Lu-NOTA-RM26的細胞膜表面吸收迅速達到最大值26%并逐漸降低到15%，而內化率則從1 h的5%逐漸上升到24 h的28%，總攝取率在6 h達到最大47%(圖5a)。177Lu-NOTA-OPE-1-RM26的細胞膜表面吸收2 h達到最大值23%然后逐漸降低，24 h后為6%，而內化劑量逐漸升高，從1 h的5%增加到24 h的30%，總攝取在6 h達到最大41%(圖5b)。177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的細胞膜表面吸收在2 h達到最大值32%并逐漸降低到15%，而內化率從1 h的6%逐漸升到到39%，總攝取在6 h達到最大值55%(圖5c)。

a——177Lu-NOTA-RM26；b——177Lu-NOTA-OPE-1-RM26；c—— 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26圖5 PC3細胞內化實驗結果Fig.5 Cellular internalization of 177Lu-NOTA-RM26(a) ， 177Lu-NOTA-OPE-1-RM26 (b) and 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26 (c) to PC3 cells

比較三個化合物的吸收發(fā)現(xiàn)：1) 細胞膜表面的吸收迅速達到最大值然后逐漸下降；2) 內化劑量隨著時間逐漸升高；3) 最大攝取量在6 h達到最大并基本保持穩(wěn)定。實驗結果表明，細胞膜表面的吸附是一個快速的過程，而化合物的內化則需要時間，因此在6 h后，細胞膜表面劑量降低，內化劑量升高，總劑量基本保持不變。引入OPE-1和OPE-2后，細胞內化率從28%分別提高到30%和39%，表明OPE-1稍微提高內化率，而OPE-2顯著提高了內化率。OPE-2比OPE-1效果更好的可能原因是OPE-2含有3個叔胺基團，而OPE-1只有一個叔胺基團，而叔胺基團可逆的質子化/去質子化過程可以調節(jié)化合物的親水/親脂性，有助于提高化合物的跨膜能力[17]。引入OPE-1和OPE-2后，細胞總攝取從47%分別變化為41%和55%。引入OPE-1后，化合物溶解性下降，導致細胞表面吸附降低，從而細胞總攝取降低，而OPE-2具有更好的溶解性和內化能力，從而導致總攝取率提高。

3.5 細胞特異性結合

細胞特異性結合實驗可以驗證引入OPE是否改變了RM26的特異性結合能力?；衔锝涍^BBN封閉后，177Lu-NOTA-RM26總攝取低于1.1%，而177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的總攝取不高于2.1%和4.3%(圖6)。經過BBN封閉后，177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的細胞攝取率分別從41%和55%降低到2.1%和4.3%，說明引入OPE并沒有改變RM26的特異性結合能力。

圖6 177Lu-NOTA-RM26, 177Lu-NOTA-OPE-1-RM26和 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26的PC3細胞特異性結合(1 000倍BBN作為封閉劑)Fig.6 Cellular binding affinity of 177Lu-NOTA-RM26, 177Lu-NOTA-OPE-1-RM26 and 177Lu-NOTA-OPE-2-RM26 to PC3 cells (1000-fold of BBN as the blocking agent)

4 結論

將具有跨膜能力的OPE與具有特異性結合的RM26結合，得到兩種潛在放射性治療藥物前體NOTA-OPE-1-RM26和NOTA-OPE-2-RM26。其177Lu標記率均大于99%，并且標記物在生理鹽水、高糖培養(yǎng)液、新生牛血清中穩(wěn)定性良好。細胞內化實驗表明，引入OPE-1稍微提高了化合物的內化率，引入OPE-2明顯提高了化合物的內化率。引入OPE并沒有改變RM26的特異性結合能力。結果表明，引入跨膜基團OPE有助于提高拮抗劑多肽的內化率，從而提高拮抗劑作為放射性治療藥物的療效。