許京淑，徐奔，向國(guó)強(qiáng)，向航

(恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院血液病科，湖北 恩施 445000)

臨床上約30%的霍奇金淋巴瘤淋巴瘤為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)[1]。DLBCL患者臨床表現(xiàn)特異性小，確診時(shí)多為中晚期，嚴(yán)重影響治療效果[2]。目前DLBCL主要通過(guò)影像學(xué)檢查與病理學(xué)聯(lián)合診斷，但以上技術(shù)在判定患者預(yù)后方面具有一定局限性。DLBCL患者免疫表型、病理學(xué)等特征差異較大，表現(xiàn)為高度異質(zhì)性，進(jìn)一步增加了治療的難度[3]。有學(xué)者認(rèn)為DLBCL臨床治愈率較低、預(yù)后差，與其缺乏特異性的標(biāo)志物密切相關(guān)[4]。近年來(lái)癌癥篩查技術(shù)取得了長(zhǎng)足發(fā)展，其中在乳腺癌、胃癌及結(jié)腸癌等腫瘤中發(fā)揮重要作用的Wnt信號(hào)通路的抑癌因子分泌型蛋白Dickkopf相關(guān)蛋白3(Dickkopf-associated protein 3，DKK3)引人關(guān)注[5]。在癌細(xì)胞中，DKK3基因可調(diào)控c-myc以及細(xì)胞周期蛋白D1等靶基因，進(jìn)一步阻滯下游信號(hào)通路Wnt而抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移[6]。研究發(fā)現(xiàn)，DKK3低表達(dá)是胃癌、乳腺癌等不利的預(yù)后因素，因此，鑒定腫瘤組織的DKK3表達(dá)水平對(duì)判定腫瘤預(yù)后可能有一定幫助，而DKK3對(duì)DLBCL預(yù)后的影響尚缺乏研究依據(jù)[7]。本研究主要探討DKK3蛋白水平在DLBCL患者中的變化及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2017年12月至2019年12月恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院收治的56例DLBCL患者，將術(shù)中切除的DLBCL組織與癌旁組織作為檢測(cè)標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理確診為DLBCL且符合《惡性淋巴瘤診斷治療學(xué)》[8]分類標(biāo)準(zhǔn)；②年齡≥18歲；③臨床資料完整；④進(jìn)行R-CHOP(利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長(zhǎng)春新堿、潑尼松)方案或R-CHOEP(依托泊苷聯(lián)合R-CHOP)方案或多柔比星、長(zhǎng)春新堿等化療；⑤生存期預(yù)計(jì)≥3個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)疾病、肝腎功能重度異常者；②繼發(fā)其他腫瘤；③DLBCL復(fù)發(fā)者；④失訪者；⑤原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的DLBCL；⑥精神疾病史及認(rèn)知障礙者。其中男30例、女26例，年齡29～72歲，平均(53±7)歲；Ann Arbor分期：Ⅰ期9例，Ⅱ期19例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；疾病類型：生發(fā)中心型42例，非生發(fā)中心型14例。本研究獲得恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署了知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DKK3蛋白表達(dá) 制作組織微陣列蠟塊后切成厚度約4 μm的組織切片，常規(guī)脫蠟水化后，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次，浸入0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液，抗原修復(fù)后加入3% H2O2室溫孵育10 min，室溫下羊血清孵育1 h，加濃度為1∶80的一抗DKK3(北京新力生物科技公司生產(chǎn)，批號(hào)：ab35847)抗體于4 ℃過(guò)夜；次日取出用磷酸鹽緩沖液沖洗，加入二抗工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，滴加以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的工作液，37 ℃孵育15 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，采用二氨基聯(lián)苯氨顯色，純水終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，返藍(lán)、中性樹(shù)膠封片[9]。

1.2.2染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 隨機(jī)挑選并觀察光學(xué)顯微鏡下每張切片的3個(gè)高倍視野，采用半定量的方法進(jìn)行結(jié)果判定。著色細(xì)胞比例評(píng)分：0%為0分，1%～10%為1分，11%～50%為2分，>50%為3分；染色強(qiáng)度評(píng)分：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃褐色為2分[10]?？傇u(píng)分=著色細(xì)胞比例評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分，總評(píng)分≥4分判定為陽(yáng)性，<4分判定為陰性。

1.3隨訪及預(yù)后評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 行門(mén)診或電話隨訪，隨訪截至2020年12月31日。根據(jù)世界衛(wèi)生組織制訂的療效標(biāo)準(zhǔn)[11]評(píng)價(jià)術(shù)后1年患者的臨床療效。完全緩解：病灶徹底消失；部分緩解：病灶最大直徑減少≥50%，穩(wěn)定≥1個(gè)月；無(wú)緩解：病灶未變化或緩解不明顯。總有效率=(完全緩解例數(shù)+部分緩解例數(shù))/總例數(shù)×100%。在隨訪結(jié)束時(shí)統(tǒng)計(jì)分析中位無(wú)進(jìn)展生存期。

2 結(jié) 果

2.1DKK3在DLBCL組織和癌旁組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，DLBCL組織中DKK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織[42.86%(24/56)比83.93%(47/56)](χ2=7.782，P<0.001)，見(jiàn)圖1。

注：DLBCL為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤，DKK3為Dickkopf相關(guān)蛋白3

2.2DLBCL患者DKK3蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 不同性別、年齡、累及部位、乳酸脫氫酶水平、疾病類型以及有無(wú)B癥狀的DKK3陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但臨床分期Ⅰ～Ⅱ期的DKK3陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅲ～Ⅳ期，國(guó)際預(yù)后指數(shù)評(píng)分0～2分的DKK3陽(yáng)性表達(dá)率高于3～4分(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 DLBCL患者DKK3蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.3DKK3蛋白表達(dá)與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系 術(shù)后1年DKK3陽(yáng)性表達(dá)的DLBCL患者的總有效率明顯高于DKK3陰性表達(dá)患者[79.17%(19/24)比53.13%(17/32)](χ2=4.051，P=0.044)，DKK3陽(yáng)性表達(dá)的臨床療效優(yōu)于DKK3陰性表達(dá)患者(Z=2.127，P=0.014)，見(jiàn)表2。至隨訪結(jié)束，DKK3陽(yáng)性表達(dá)的DLBCL患者中位無(wú)進(jìn)展生存期長(zhǎng)于DKK3陰性表達(dá)患者[(36±6)個(gè)月比(22±4)個(gè)月](t=9.775，P<0.001)。

表2 DKK3蛋白表達(dá)與DLBCL患者預(yù)后的關(guān)系 (例)

3 討 論

DLBCL是臨床常見(jiàn)的淋巴瘤類型之一，目前治療主要以化療為主[12]。60%～70%的DLBCL患者使用利妥昔單抗、阿霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿和潑尼松等方案可達(dá)到較好的治療效果[13]。而部分患者在發(fā)病早期即出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，近50%的患者治療后期出現(xiàn)復(fù)發(fā)，但具體發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能原發(fā)于小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤等，也可從淋巴結(jié)外組織等發(fā)展而來(lái)[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者化療敏感性、預(yù)后與免疫組織分型、細(xì)胞學(xué)及病理學(xué)等密切相關(guān)[16]。因此，探討DLBCL發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制及相關(guān)蛋白、基因等生物學(xué)特征，對(duì)進(jìn)一步提高DLBCL的早期診斷率和改善患者預(yù)后尤為必要[17]。

目前，臨床主要通過(guò)B超、磁共振成像及CT等影像學(xué)技術(shù)對(duì)DLBCL進(jìn)行早期診斷，該類技術(shù)雖然定位準(zhǔn)確但定性難度大?；驑?biāo)志物被認(rèn)為是一種無(wú)創(chuàng)性輔助診斷方法，目前DLBCL仍缺乏特異性檢測(cè)指標(biāo)。此外，影響DLBCL預(yù)后的因素較多，同時(shí)DLBCL在臨床上有多種分子分型，考慮患者的分子分型與基因異常存在部分重合，任意單一因素變化均可能造成較大影響，提示DLBCL的調(diào)控基因復(fù)雜且具有顯著異質(zhì)性[18]。因此，在龐雜的調(diào)控基因中準(zhǔn)確找到對(duì)DLBCL患者診斷與預(yù)后有臨床意義的標(biāo)志物是當(dāng)前急需解決的問(wèn)題。

Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可介導(dǎo)調(diào)控多種惡性腫瘤的增殖分化過(guò)程，其高度活化時(shí)可積聚胞質(zhì)內(nèi)下游蛋白(β聯(lián)蛋白)，使下游蛋白進(jìn)入細(xì)胞核觸發(fā)原癌基因轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖分化[19]。隨著近年來(lái)臨床篩查腫瘤標(biāo)志物工作的陸續(xù)開(kāi)展，發(fā)現(xiàn)潛在腫瘤標(biāo)志物DKK3具有較好的應(yīng)用前景，現(xiàn)研究證明其在胃癌、腸癌及輸卵管癌中可作為潛在治療新靶點(diǎn)[20-21]。DKK3基因是經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要負(fù)性調(diào)控因子，是一種腫瘤抑制因子，在多種癌癥中低表達(dá)，在腫瘤增殖分化中起關(guān)鍵作用[22]。DKK3基因高表達(dá)可調(diào)控c-myc以及細(xì)胞周期蛋白D1等靶基因，從而下調(diào)下游信號(hào)通路Wnt發(fā)揮抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用[23]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DKK3可通過(guò)介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2抑制腫瘤血管生成[24]。目前研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞中DKK3基因處于低表達(dá)狀態(tài)，值得注意的是DKK3基因表達(dá)缺失的直接原因?yàn)樵摶騿?dòng)子區(qū)的高甲基化，在胃癌組織中腫瘤細(xì)胞主要通過(guò)高甲基化或啟動(dòng)子甲基化沉默DKK3基因[25]。當(dāng)前異常的啟動(dòng)子甲基化已在生殖系統(tǒng)及消化系統(tǒng)腫瘤DKK3基因中發(fā)現(xiàn)，其直接影響患者腫瘤惡性程度及預(yù)后，提示DKK3基因可作為腫瘤患者病情判定及評(píng)估預(yù)后的潛在標(biāo)志物[26]。目前，有關(guān)DKK3基因與DLBCL的相關(guān)性研究較少。有研究報(bào)道，DKK3蛋白表達(dá)水平與卵巢癌患者總生存率呈正相關(guān)，且DKK3蛋白表達(dá)水平與患者的分期、淋巴轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度密切相關(guān)[27]。

本研究結(jié)果顯示，DLBCL組織DKK3陽(yáng)性率低于癌旁組織(P<0.01)，DLBCL患者DKK3蛋白表達(dá)與臨床分期和國(guó)際預(yù)后指數(shù)評(píng)分之間存在關(guān)聯(lián)(P<0.05)，但與性別、年齡、累及部位及乳酸脫氫酶水平不存在顯著性關(guān)聯(lián)(P>0.05)。Dellinger等[28]研究認(rèn)為，DKK3啟動(dòng)子中的甲基化標(biāo)志著子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良，提示DKK3高表達(dá)可能抑制腫瘤組織細(xì)胞的分化、增殖及浸潤(rùn)過(guò)程。本研究結(jié)果為DKK3蛋白表達(dá)水平與其他腫瘤發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性提供了支持。本研究結(jié)果同時(shí)提示DKK3蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者的總有效率高于DKK3蛋白陰性表達(dá)(P<0.05)，無(wú)進(jìn)展生存期明顯長(zhǎng)于DKK3蛋白陰性表達(dá)者(P<0.01)，提示DLBCL患者預(yù)后與DKK3表達(dá)情況存在關(guān)聯(lián)，表明DKK3陽(yáng)性患者術(shù)后生存期更長(zhǎng)，提示其作為抑癌基因?qū)LBCL患者預(yù)后產(chǎn)生積極影響。以上證據(jù)表明，DKK3基因過(guò)表達(dá)在診斷DLBCL中的潛在價(jià)值，DKK3表達(dá)增強(qiáng)可能是DLBCL發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。未來(lái)對(duì)DKK3蛋白不同活化程度的DLBCL患者可采取不同的治療方式，同時(shí)做到積極隨訪及密切監(jiān)測(cè)以改善患者預(yù)后。

綜上所述，在部分DLBCL患者組織中DKK3陽(yáng)性表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)率與患者臨床分期及國(guó)際預(yù)后指數(shù)評(píng)分相關(guān)，DKK3蛋白陰性表達(dá)預(yù)示著預(yù)后較差，其有望成為DLBCL臨床診斷、治療及判斷預(yù)后的新指標(biāo)。