陳東宇，楊曉雨，王紅心，樊文龍，劉興華，林泳煌，何玉清

(1.東莞市寮步醫(yī)院皮膚科，廣東 東莞 523400； 2.廣東醫(yī)科大學(xué) a.公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系，b.醫(yī)學(xué)系統(tǒng)生物學(xué)研究所，廣東 東莞 523808)

銀屑病是一種全身性免疫炎癥疾病，典型的皮膚表現(xiàn)包括紅斑、硬化和鱗屑斑塊，其發(fā)病同時受到遺傳易感性、環(huán)境危險因素、代謝、感染和生活方式等因素相互作用的影響[1]。銀屑病可在任何年齡發(fā)病，估計影響著全世界1.25億人[2]。大量基于人群的研究表明，銀屑病在歐洲白人中的發(fā)病率最高，其次是黑人和西班牙裔人[3]。在銀屑病異常的免疫系統(tǒng)中，角質(zhì)形成細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞之間通過釋放炎癥細(xì)胞因子和趨化因子導(dǎo)致免疫細(xì)胞顯著浸潤，最終引起表皮過度增殖和角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化[4]。目前研究認(rèn)為，銀屑病潛在的病理機制涉及免疫細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子增多，免疫細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞之間的病理串?dāng)_以及先天免疫系統(tǒng)與獲得性免疫系統(tǒng)慢性激活的復(fù)雜相互作用[5]。識別這些遺傳關(guān)聯(lián)內(nèi)在的發(fā)病分子機制是目前研究銀屑病的研究熱點。本研究運用生物信息學(xué)等方法篩選銀屑病的保護基因，為明確其發(fā)病機制和臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)的篩選 利用美國國家生物技術(shù)信息中心的基因表達數(shù)據(jù)庫GEO(Gene Expression Omnibus)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)進行基因表達譜芯片篩選及數(shù)據(jù)處理。利用R語言limma包對芯片數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化和DEGs的篩選，|log2FoldChange|≥1和校正后的P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA) 采用clusterProfiler包對所有基因集合進行GSEA，參考基因集來自MSigDB數(shù)據(jù)庫(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)的c2.cp.kegg.v7.4.entrez基因集。以P<0.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DA)<0.25(矯正方法為Bonferroni矯正法)作為明顯富集基因集的判定標(biāo)準(zhǔn)，取交集的通路進行分析。

1.3加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)構(gòu)建 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的基因表達矩陣，利用WGCNA包和limma包構(gòu)建WGCNA，分別進行樣本聚類，計算軟閾值，構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)渲丿B矩陣。通過基因顯著性和模塊顯著性評價基因/模塊和臨床癥狀信息之間的關(guān)聯(lián)性，篩選出相關(guān)性最高的基因模塊。

1.4DEGs的驗證 根據(jù)WGCNA結(jié)果，計算各個模塊對應(yīng)的模塊顯著性和基因顯著性，篩選與銀屑病相關(guān)度最高的模塊基因，繪制韋恩圖得到交集DEGs?；赾lusterProfiler包進行基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)的富集分析以及可視化?；谧畲蠹瘓F中心性模式(maximal clique centrality，MCC)篩選連接度最高的前10個DEGs，并驗證上述DEGs的表達情況。

1.5免疫細(xì)胞浸潤評價及相關(guān)性分析 CIBERSORT算法利用RNA表達數(shù)據(jù)推斷混合細(xì)胞群體中成員細(xì)胞類型的豐度[6]。加載R package e1071作為前置條件，模擬次數(shù)設(shè)為100，篩選出P<0.05的樣本。分析22種免疫細(xì)胞在所有樣本中的比例，查看數(shù)據(jù)集中各免疫細(xì)胞浸潤的分布情況。繪制小提琴圖來可視化免疫細(xì)胞浸潤的差異，最后對DEGs和浸潤免疫細(xì)胞進行Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1DEGs的識別 篩選得到GSE13355和GSE14905，兩芯片均基于同一平臺GPL570。選取GSE13355中的116個樣本(58例銀屑病患者皮損和58例非皮損皮膚樣本)和GSE14905的61個樣本(33例銀屑病患者皮損和28例非皮損皮膚樣本)進行分析。GSE13355芯片中共篩選出328個DEGs，其中上調(diào)基因176個、下調(diào)基因152個，見圖1a。在GSE14905芯片中共篩選出1 171個DEGs，其中上調(diào)基因617個、下調(diào)基因554個，見圖1b。

注：紅點代表上調(diào)的差異表達基因，藍點代表下調(diào)的差異表達基因

2.2GSEA 標(biāo)準(zhǔn)化處理GSE13355和GSE14905矩陣數(shù)據(jù)，以KEGG通路基因集為分類標(biāo)準(zhǔn)進行GSEA。獲得的6條交集通路(嘧啶代謝、利什曼原蟲感染、亞油酸代謝、細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路和嘌呤代謝)均受到抑制，見圖2。

注：Rank in Ordered Dataset為在有序數(shù)據(jù)集中排名，Running Enrichment Score為富集得分，Ranked List Metric為列表指標(biāo)排名

2.3WGCNA 計算得到GSE13355軟閾值β=6，基于軟閾值分步構(gòu)建基因模塊(圖3a、3b)和共表達矩陣網(wǎng)絡(luò)，并通過動態(tài)混合剪切得到13個以熱圖呈現(xiàn)基因模塊與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性的結(jié)果(圖3c)，選擇與銀屑病皮損最顯著相關(guān)的turquoise模塊進行后續(xù)分析。該模塊包括3 308個基因，該模塊的模塊基因與銀屑病的基因顯著性高度相關(guān)(r=0.97，P<0.001)，見圖3d。

注：Scale independence為尺度獨立性，Scale Free Topology Model Fit signed R2為無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2，Soft threshold(power)為軟閾值，Mean connectivity為平均連接度；Gene Dendrogram and module colors為基因樹狀圖與模塊顏色，Dynamic Tree Cut為動態(tài)聚類，Merged Dynamics為合并聚類；Module-trait relationships為模塊-特性關(guān)系；Gene significance for psoriasis為銀屑病的基因顯著性，Module membership in turquoise module為turquoise模塊中的模塊基因

計算GSE14905軟閾值β=18，基于軟閾值分步構(gòu)建基因模塊(圖4a、4b)，得到8個以熱圖呈現(xiàn)基因模塊與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性的結(jié)果(圖4c)，選擇與銀屑病皮損最顯著相關(guān)的lightgreen模塊進行后續(xù)分析。該模塊包括986個基因，該模塊的模塊基因與銀屑病的基因顯著性高度相關(guān)(r=0.93，P<0.001)，見圖4d。

注：Scale independence為尺度獨立性，Scale Free Topology Model Fit signed R2為無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)R2，Soft threshold(power)為軟閾值，Mean connectivity為平均連接度；Gene Dendrogram and module colors為基因樹狀圖與模塊顏色，Dynamic Tree Cut為動態(tài)聚類，Merged Dynamics為合并聚類；Module-trait relationships為模塊-特性關(guān)系；Gene significance for psoriasis為銀屑病的基因顯著性，Module membership in lightgreen module為lightgreen模塊中的模塊基因

2.4DEGs的篩選及功能富集分析 取交集得到89個交集的DEGs(圖5a)?；贛CC模式獲得連接度最高的前10個DEGs：CC趨化因子配體(CC motif chemokine ligand，CCL)20、CXC趨化因子受體4、S100鈣結(jié)合蛋白(S100 calcium binding protein，S100)A7、CXC基序趨化因子配體2、角蛋白16、肽酶抑制劑3、E-選擇素、S100A9、CCL8和富含脯氨酸的小蛋白2B(圖5b)。

圖5 交集差異表達基因的篩選 5a為GSE13355、GSE14905、turquoise模塊和lightgreen模塊交集的差異表達基因，5b為基于最大集團中心性模式的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與差異表達基因的篩選

對DEGs進行GO功能注釋(圖6a)，這些DEGs在生物過程方面主要富集在對細(xì)菌分子的反應(yīng)、抗菌體液反應(yīng)等生物學(xué)功能上；在分子功能方面主要富集在晚期糖基化終末產(chǎn)物受體受體結(jié)合鈣依賴性蛋白結(jié)合細(xì)胞因子活性、Toll樣受體4結(jié)合等生物學(xué)功能上；KEGG主要涉及3個通路：白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-17信號通路、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用和晝夜節(jié)律(圖6b)。

注：DEGs為差異表達基因；GO為基因本體，KEGG為京都基因和基因組百科全書，The Most Enriched GO Terms為最富集的GO條目，GeneRatio為基因比率

3a為不同軟閾值對應(yīng)的無尺度網(wǎng)絡(luò)擬合指數(shù)和不同軟閾值對應(yīng)的平均連通性(β=6)，3b為模塊特征基因與臨床特征相關(guān)性的熱圖，3c為基因聚類樹及模塊劃分，3d為turquoise模塊特征基因的散點圖

2.5驗證DEGs的表達情況 GSE166388包含 4例中國銀屑病患者皮損和4例非皮損皮膚樣本。驗證上述89個交集DEGs在GSE166388的表達水平。結(jié)果顯示，在銀屑病患者皮損與非皮損組織間25個DEGs[S100A9、肽酶抑制劑3、醛脫氫酶1家族成員A3、細(xì)胞色素C氧化酶2、排斥性導(dǎo)向分子B(repulsive guidance molecule BMP co-receptor B，RGMB)、神經(jīng)前體分化調(diào)節(jié)同系物(maturin,neural progenitor differentiation regulator homolog，MTURN)、核酸結(jié)合蛋白1、乳鐵蛋白、LOC100506990、B細(xì)胞淋巴瘤2相關(guān)蛋白A1、鋅指蛋白273(zinc finger protein 273，ZNF273)、F-box蛋白6、原腸(胚)形成糖蛋白(proteoglycan like sulfated glycoprotein，PAPLN)、S100A7、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶2、CCL20、鹽誘導(dǎo)激酶1(salt inducible kinase 1，SIK1)、尿苷磷酸化酶1、維甲酸相關(guān)孤兒受體 α(retinoic acid-related orphan receptor α，RORα)、單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶假定蛋白(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,pseudogene，CMAHP)、Wnt家族成員2B(Wnt family member 2B，WNT2B)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體21(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 21，PTPN21)、CCL8、S100A2和羥類固醇17β脫氫酶2]比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6免疫細(xì)胞浸潤及相關(guān)性分析 綜合兩個數(shù)據(jù)集，用箱線圖表示22種免疫細(xì)胞在所有樣本中的比例。各免疫細(xì)胞浸潤的分布情況見圖7a。含量前三的免疫細(xì)胞是活化的CD4記憶T細(xì)胞、未活化的樹突狀細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞。小提琴圖顯示，與銀屑病非皮損組織相比，皮損組織的活化的CD4記憶T細(xì)胞、未活化的自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、未活化的肥大細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞的免疫浸潤表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，見圖7b。

注：TME Cell composition為腫瘤微環(huán)境細(xì)胞組成，Cell composition為細(xì)胞組成，Cell Type為細(xì)胞類型；B cells naive為幼稚B細(xì)胞，B cells memory為記憶B細(xì)胞，Plasma cells為漿細(xì)胞，T cells CD8為CD8 T細(xì)胞，T cells CD4 naive為幼稚CD4 T細(xì)胞，T cells CD4 memory resting為未活化的CD4記憶T細(xì)胞，T cells CD4 memory activated為活化的CD4記憶T細(xì)胞，T cells follicular helper為濾泡輔助性T細(xì)胞，T cells regulatory(Tregs)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，T cells gamma delta為γδT細(xì)胞，NK cells resting為未活化的自然殺傷細(xì)胞，NK cells activated為活化的自然殺傷細(xì)胞，Monocytes為單核細(xì)胞，Macrophages M0為M0型巨噬細(xì)胞，Macrophages M1為M1型巨噬細(xì)胞，Macrophages M2為M2型巨噬細(xì)胞，Dendritic cells resting為未活化的樹突狀細(xì)胞，Dendritic cells activated為活化的樹突狀細(xì)胞，Mast cells resting為未活化的肥大細(xì)胞，Mast cells activated為活化的肥大細(xì)胞，Eosinophils為嗜酸粒細(xì)胞，Neutrophils為中性粒細(xì)胞；Fraction為分?jǐn)?shù)；紅色小提琴代表銀屑病皮損，藍色小提琴代表非皮損皮膚

進一步將上述得到的25個DEGs與22種免疫細(xì)浸潤胞的特征基因表達量進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示 CMAHP、LOC100506990、MTURN、PAPLN、PTPN21、RGMB、RORα、SIK1、WNT2B和ZNF273的表達量均與活化的CD4記憶T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞浸潤呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見圖8。

注：Mast cells resting為未活化的肥大細(xì)胞，Eosinophils為嗜酸粒細(xì)胞，NK cells resting為未活化的自然殺傷細(xì)胞，Dendritic cells resting為未活化的樹突狀細(xì)胞，T cells regulatory Tregs為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，T cells CD4 memory resting為未活化的CD4記憶T細(xì)胞，B cells memory為記憶B細(xì)胞，Neutrophils為中性粒細(xì)胞，Plasma cells為漿細(xì)胞，Macrophages M2為M2型巨噬細(xì)胞，T cells gamma delta為γδT細(xì)胞，Dendritic cells activated為活化的樹突狀細(xì)胞，B cells naive為幼稚B細(xì)胞，T cells CD4 naive為幼稚CD4 T細(xì)胞，Macrophages M0為M0型巨噬細(xì)胞，T cells CD8為CD8 T細(xì)胞，Monocytes為單核細(xì)胞，T cells follicular helper為濾泡輔助性T細(xì)胞，T cells CD4 memory activated 為活化的CD4記憶T細(xì)胞，NK cells activated為活化的自然殺傷細(xì)胞，Macrophages M1為M1型巨噬細(xì)胞，Mast cells activated為活化的肥大細(xì)胞；CMAHP為單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶假定蛋白，MTURN為神經(jīng)前體分化調(diào)節(jié)同系物，PAPLN為原腸(胚)形成糖蛋白，PTPN21為蛋白酪氨酸磷酸酶非受體21，RGMB為排斥性導(dǎo)向分子B，RORα為維甲酸相關(guān)孤兒受體α，SIK1為鹽誘導(dǎo)激酶1，WNT2B為Wnt家族成員2B，ZNF273為鋅指蛋白273；Correlation Coefficient(r)為相關(guān)系數(shù)，abs(cor)為相關(guān)系數(shù)的絕對值；點的大小代表基因與免疫細(xì)胞之間相關(guān)性的強度

3 討 論

銀屑病是一種復(fù)雜的多因素疾病，皮膚表現(xiàn)多種多樣，自身免疫和自體炎癥反應(yīng)共存[7]。近年來出現(xiàn)了各種治療銀屑病的新方法，但目前銀屑病仍不能治愈[8-9]。本研究通過R語言聯(lián)合WGCNA的方法篩選出89個交集DEGs。KEGG注釋顯示這些DEGs富集到了IL-17信號通路這條關(guān)鍵的致病通路。研究證明，IL-23/輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th細(xì)胞)17通路是調(diào)控銀屑病發(fā)病機制中的一個關(guān)鍵途徑?？乖蔬f、核因子κB信號通路激活、Th細(xì)胞分化和IL-17反應(yīng)增強共同參與銀屑病的致病過程，誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)的發(fā)生和免疫細(xì)胞浸潤[10]。中性粒細(xì)胞胞外陷阱的過度表達會刺激IL-17的釋放以及炎癥介質(zhì)的合成，進而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的自我放大[11]。此外，角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和表達IL-17受體，啟動和促進銀屑病的發(fā)生[12]。在IL-17和炎癥因子共同作用下，內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達增加[13]。研究證明，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)抑制劑對IL-17驅(qū)動的銀屑病的療效顯著[14]。因此，針對TNF-α、IL-23和IL-17的生物制劑已經(jīng)被開發(fā)并被批準(zhǔn)用于銀屑病的治療。

免疫反應(yīng)紊亂是銀屑病炎癥發(fā)生和維持的原因，而持續(xù)炎癥通過TNF-α、IL-17和γ干擾素導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞不受控制的增殖和分化功能障礙[15]。值得關(guān)注的是，本研究GSEA交集通路的結(jié)果顯示，篩選出的DEGs均抑制了嘧啶代謝、利什曼原蟲感染、亞油酸代謝、細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路和嘌呤代謝上述信號通路，說明這些DEGs可能對銀屑病的發(fā)生發(fā)展起重要的抑制作用。

T細(xì)胞信號在銀屑病的發(fā)病機制、治療和共病方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。先天免疫系統(tǒng)中多種免疫細(xì)胞在銀屑病皮損中顯著增加，如角質(zhì)形成細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等貫穿尋常型銀屑病的發(fā)病過程。皮損部位角質(zhì)形成細(xì)胞可通過釋放趨化因子招募T細(xì)胞聚集[16]，產(chǎn)生IL-17A和IL-23，并與產(chǎn)生CD8+T淋巴細(xì)胞的獲得性免疫反應(yīng)細(xì)胞(如Th17細(xì)胞和IL-17)相互作用[17]。銀屑病的免疫學(xué)紊亂與T細(xì)胞亞群以及相應(yīng)的細(xì)胞因子(如γ干擾素、TNF-α、IL-23和IL-17)的過度刺激有關(guān)[18]。因此，為了進一步探討免疫細(xì)胞浸潤在銀屑病中的作用，本研究對DEGs與22種免疫細(xì)浸潤胞的特征基因表達量進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示，初始B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、初始CD4 T細(xì)胞、未活化的CD4記憶T細(xì)胞、活化的CD4記憶T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、γδ T細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞、未活化的樹突狀細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤增加，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、未活化的NK細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞和未活化的肥大細(xì)胞的浸潤減少可能與銀屑病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。這些關(guān)聯(lián)的具體機制還需要進一步的實驗證據(jù)進行驗證。本研究顯示，CMAHP、LOC100506990、MTURN、PAPLN、PTPN21、RGMB、RORα、SIK1、WNT2B和ZNF273對抑制免疫細(xì)胞浸潤發(fā)揮重要作用。

GO注釋顯示RORα均較好地關(guān)聯(lián)到與銀屑病發(fā)病緊密相關(guān)的生物學(xué)功能上。在免疫系統(tǒng)中，RORα作為炎癥關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，在淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞均有表達，其與IL-17A、IL-23R的表達和Th-17細(xì)胞的分化有關(guān)[19-20]。SIK1負(fù)調(diào)節(jié)Toll樣受體4誘導(dǎo)的核因子κB的激活，減少促炎性細(xì)胞因子的表達，其抑制作用可將巨噬細(xì)胞再轉(zhuǎn)化為抗炎表型[21-22]。研究發(fā)現(xiàn)，PTPN21可能與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后有關(guān)，其過表達可激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路，促進細(xì)胞增殖[23-24]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞過度表達PTPN21后，免疫抑制功能受損，腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的募集能力增強[25]。有研究顯示，MTURN在肺癌組織中表達上調(diào)，可作為肺癌的潛在生物標(biāo)志物[26]。此外，PAPLN過表達則提示急性髓系白血病髓外浸潤的預(yù)后較好[27]。WNT2B在宮頸癌細(xì)胞中表達水平上調(diào)，逆轉(zhuǎn)了某些微RNA對癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用以及并促進了相關(guān)細(xì)胞的凋亡[28]。

綜上所述，本研究采用GSEA聯(lián)合WGCNA和CIBERSORT算法等生物信息學(xué)分析手段，篩選和挖掘了與銀屑病發(fā)病相關(guān)的DEGs(CMAHP、LOC100506990、MTURN、PAPLN、PTPN21、RGMB、RORα、SIK1、WNT2B、ZNF273)，這些靶基因可能在銀屑病的發(fā)病過程中起保護作用，這將有助于后續(xù)更加深入地探討其致病機制，為銀屑病的臨床診斷、治療提供新思路。