孫冠群， 周思蕾， 曾榃倫， 劉君宇， 梁喜俊， 程 卓

1 海軍軍醫(yī)大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 臨床腫瘤研究所， 上海 200433；2 海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院 腫瘤科， 上海 200433

肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是最常見的肝臟原發(fā)性腫瘤，致死率極高且預(yù)后差[1]，5年生存率僅為18%，是繼胰腺癌之后排名第2位的致死性腫瘤[2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織年度預(yù)測(cè)，2030年或?qū)⒂谐^100萬患者死于肝癌[3]。然而，目前尚缺少十分有效的肝癌標(biāo)志物。因此，探索新的肝癌治療靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)預(yù)后復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是一種廣泛表達(dá)的神經(jīng)肽，屬于降鈣素家族，在不同器官中表達(dá)差異較大[4-5]。CGRP受體成分蛋白(CGRP receptor component protein，CRCP)與降鈣素受體樣受體和受體活性修飾蛋白-1共同組成CGRP受體，并參與調(diào)控體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[6]。此外，CRCP還被稱為DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶Ⅲ亞基RPC9，在RNA轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用。目前，CRCP在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的功能尚無研究報(bào)道。本研究旨在觀察CRCP分子在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)水平，并分析其與肝癌患者預(yù)后和臨床病理數(shù)據(jù)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2003年6月—2009年9月在海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院行手術(shù)切除治療的肝癌患者的肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本79例，記錄其臨床病理數(shù)據(jù)(如病理分級(jí)、腫瘤大小、是否伴有門靜脈癌栓等)并進(jìn)行術(shù)后隨訪，記錄患者腫瘤復(fù)發(fā)、死亡時(shí)間，末次隨訪時(shí)間為2012年3月。

1.2 CRCP分子檢測(cè) 免疫組化染色所用CRCP單克隆抗體購自Abcam公司。石蠟切片60 ℃烘烤1 h，二甲苯、乙醇脫蠟，室溫下于3% H2O2甲醇液中放置20 min，雙蒸水洗滌5 min×3次。酸性修復(fù)液煮沸，進(jìn)行抗原修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫，雙蒸水洗滌5 min×2次，PBS洗滌1次，5 min。均勻滴加1%BSA的封閉液，使其完整覆蓋整塊切片， 37 ℃孵育30 min。吸棄封閉液，滴加一抗(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜。第2天，取出切片，室溫復(fù)溫15 min，PBS洗滌4次，每次5 min，二抗孵育30 min，PBS洗滌5 min×4次。滴加DAB顯色液顯色，至切片出現(xiàn)明顯棕色即終止，雙蒸水洗滌5 min×2次，蘇木素復(fù)染10 min后用1%鹽酸分化1～2次，自來水流水沖洗20～30 min，洗去多余蘇木素，雙蒸水洗滌5 min×2次。二甲苯、乙醇脫水，滴加適量中性樹脂，蓋上干凈蓋玻片，徹底干燥后觀察染色情況并掃片分析。

1.3 免疫組化芯片評(píng)分方法 免疫組化芯片利用ImageScope(Aperio公司)軟件進(jìn)行掃描，掃描后利用該軟件的Algorithms(Positive Pixel Count)程序?qū)γ總€(gè)組織點(diǎn)進(jìn)行“陽性Pixel”分析計(jì)算，選擇Positivity數(shù)據(jù)(Positivity=Positive例數(shù)/Total例數(shù))作為分析對(duì)象。

1.4 Western Blot檢測(cè) 取約3 mm×3 mm大小的肝癌與癌旁組織樣本，加入M-PER裂解液研磨(70 Hz，180 s)，冰上裂解10 min后，于4 ℃，12 000 r/min離心10 min。BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入6×上樣緩沖液，煮沸變性。通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，利用電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(100 V，60 min)，使用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉1 h，于TBST稀釋的一抗(購自Abcam)中4 ℃孵育過夜。次日，回收一抗，TBST洗滌3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后，使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色底物法檢測(cè)蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特性曲線(ROC曲線)分析獲得曲線下面積(AUC)，評(píng)估擬合優(yōu)度確定其預(yù)測(cè)效能，計(jì)算Youden指數(shù)確定最佳截?cái)嘀担肒aplan-Meier生存分析法分析CRCP表達(dá)與肝癌復(fù)發(fā)和預(yù)后的關(guān)系，兩組間比較采用log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 79例肝癌患者中，男67例，女12例，年齡10～72歲；病理分級(jí)4級(jí)1例，3級(jí)61例，2級(jí)17例；20例合并門靜脈癌栓；巴塞羅那分期0期5例，A期55例，B期11例，C期8例。

2.2 CRCP分子在肝癌中的表達(dá)情況 Western Blot檢測(cè)6例患者肝癌及癌旁組織中CRCP表達(dá)水平，結(jié)果顯示，4例患者肝癌組織中CRCP表達(dá)水平低于癌旁組織(圖1)。利用免疫組化法檢測(cè)79例患者肝癌及癌旁組織中CRCP的表達(dá)水平及定位情況，60例(75.9%)的患者肝癌組織中CRCP表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(圖2)。

注：N，癌旁組織；T，腫瘤組織。

注：a，2例肝癌患者癌組織及癌旁組織中的CRCP表達(dá)情況(×12.8)，CRCP在胞漿與胞核中均有表達(dá)，與癌組織相比，癌旁組織染色更深，提示癌旁組織中CRCP表達(dá)量更高。b，79例肝癌患者CRCP的相對(duì)表達(dá)，每位患者癌組織與癌旁組織的免疫組化評(píng)分(Positivity，簡稱P)相除后取log值[即log(P癌組織/P癌旁組織)]并作圖，其中60例(75.9%)患者的癌組織CRCP表達(dá)量低于癌旁組織即為低表達(dá)部分，19例(24.1%)癌組織CRCP表達(dá)量高于癌旁組織即為高表達(dá)部分。

2.3 CRCP分子表達(dá)與肝癌預(yù)后的關(guān)系 使用ImageScope軟件對(duì)79例患者的免疫組化芯片染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，利用SPSS 21.0軟件將患者癌組織中CRCP表達(dá)量對(duì)預(yù)后(生存和復(fù)發(fā))的影響進(jìn)行ROC曲線分析，評(píng)估生存和復(fù)發(fā)的AUC分別為0.770、0.644, 計(jì)算約登指數(shù)確定CRCP最佳截?cái)嘀?生存：0.425，復(fù)發(fā)：0.245)，依據(jù)最佳截?cái)嘀祵RCP表達(dá)分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。采用Kaplan-Meier 生存分析法分析CRCP表達(dá)與肝癌患者生存、復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果顯示，與CRCP低表達(dá)組相比，CRCP高表達(dá)組患者的總體生存期更長，復(fù)發(fā)率更低(P值分別為<0.001、0.009)(圖3)。

圖3 肝癌組織中CRCP表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 CRCP表達(dá)水平與肝癌臨床病理特征的關(guān)系 以上述癌組織中CRCP表達(dá)量對(duì)生存的影響進(jìn)行ROC曲線分析，根據(jù)最佳截?cái)嘀?0.425)將CRCP表達(dá)分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。 CRCP低表達(dá)組CK19陽性、腫瘤包膜不完整、合并門靜脈癌栓和腫瘤病理分級(jí)高的患者所占比例更高(χ2值分別為6.410、4.829、9.319、9.083，P值均<0.05)，提示CRCP低表達(dá)的肝癌患者的惡性程度更高(表1)。

表1 CRCP分子表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

惡性腫瘤是全球第二大病死原因，僅次于心血管疾病。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長期的多因素共同影響的過程[7]。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，部分腫瘤的診療手段也愈發(fā)精準(zhǔn)、有效，但仍有很多肝癌患者因確診較晚、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移且暫無有效的治療方法等原因死亡[8]。外科治療是肝癌患者獲得根治和長期生存的最主要途徑[9]，但肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，尤其復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[10]。因此，探索更多肝癌轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)和預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物意義重大。

CRCP在細(xì)胞內(nèi)通過參與降鈣素受體成分蛋白和RNA聚合酶Ⅲ的形成，在CGRP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNA合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CGRP是由37個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)肽，由中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)分泌[11]，在心血管系統(tǒng)和心臟所有部位均能夠被檢測(cè)到[12]，是最有效的血管舒張藥之一[13-14]。CGRP還參與體內(nèi)多種重要生理功能，例如強(qiáng)心作用和代謝、促炎等過程[15]。CRCP由148個(gè)氨基酸殘基組成[16]，作為CGRP受體的輔助蛋白存在，能夠耦聯(lián)CGRP受體參與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)，CRCP的表達(dá)受炎癥、神經(jīng)性疼痛的影響。此外，有研究[18]發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中，CRCP通過調(diào)節(jié)P53信號(hào)調(diào)節(jié)造血干/祖細(xì)胞維持。但CRCP是否參與調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展過程尚不明確。

本研究結(jié)果顯示，CRCP在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織。目前，關(guān)于CRCP表達(dá)的調(diào)控機(jī)制相關(guān)報(bào)道極少。Gao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺導(dǎo)管癌中，CGRP啟動(dòng)子甲基化修飾導(dǎo)致CGRP表達(dá)下調(diào)。劉彥梅等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細(xì)胞中，CGRP可調(diào)控CRCP的表達(dá)。筆者團(tuán)隊(duì)推測(cè)，CRCP在肝癌中低表達(dá)機(jī)制可能與上述研究類似：CGRP高甲基化導(dǎo)致CGRP表達(dá)降低，最終引起CRCP表達(dá)減少。此外，微小RNA(miRNA)可通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA翻譯，下調(diào)靶基因蛋白表達(dá)水平[21]。筆者團(tuán)隊(duì)猜測(cè)，肝癌中CRCP分子低表達(dá)可能與相關(guān)miRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。Lou等[22]研究發(fā)現(xiàn)miR-494-3p、miR-1207-5p和miR-1225-5p等在肝癌患者轉(zhuǎn)移腫瘤組織中表達(dá)高于原位腫瘤組織，過表達(dá)miR-494-3p可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。筆者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過TargetScan 7.0數(shù)據(jù)庫查詢發(fā)現(xiàn)，miR-494-3p 、miR-1207-5p和miR-1225-5p可直接結(jié)合CRCP mRNA的3′UTR區(qū)域，據(jù)此猜測(cè)肝癌患者腫瘤組織可能通過上調(diào)上述miRNA，進(jìn)而下調(diào)CRCP的蛋白表達(dá)水平。

預(yù)后分析顯示，CRCP低表達(dá)的肝癌患者生存期更短，復(fù)發(fā)率更高，預(yù)后更差。同時(shí)，CRCP低表達(dá)與CK19陽性、腫瘤包膜不完整、伴有門靜脈癌栓及更高的病理分級(jí)呈正相關(guān)。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，CK19和GPC3聯(lián)合可作為肝癌轉(zhuǎn)移的參考分子，CK19+/GPC3+肝癌患者發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、微脈管入侵、局部淋巴結(jié)入侵和遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高；也有研究[24-27]顯示，原發(fā)性肝癌中CK19高表達(dá)與預(yù)后差相關(guān)，CK19是原發(fā)性肝癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有效風(fēng)險(xiǎn)因子。有研究[28]報(bào)道，血清CK19水平高提示癌細(xì)胞低分化，惡性程度高，轉(zhuǎn)移能力高。本研究的CK19陽性患者中，CRCP低表達(dá)患者占比(80%)遠(yuǎn)高于高表達(dá)患者(20%)。腫瘤包膜破損及門靜脈癌栓的形成也是影響肝癌患者預(yù)后的重要因素。有研究[29]發(fā)現(xiàn)，與有腫瘤包膜的肝癌相比，無腫瘤包膜的肝癌血管侵犯的比例更高、分化程度更差。本研究結(jié)果顯示，腫瘤外無包膜或包膜不完整的患者腫瘤組織中CRCP低表達(dá)更多。此外，合并門靜脈癌栓的患者中，CRCP低表達(dá)患者占比遠(yuǎn)高于高表達(dá)患者，且腫瘤病理分級(jí)越高的患者，其CRCP低表達(dá)患者所占比例越高。據(jù)此，筆者團(tuán)隊(duì)提出假設(shè)：CRCP低表達(dá)患者的腫瘤可能更易發(fā)生轉(zhuǎn)移，惡性程度更高。

綜上所述，肝癌組織中CRCP低表達(dá)的患者預(yù)后更差，CRCP可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程，該分子或可作為肝癌患者預(yù)后判定的生物標(biāo)志物。但由于肝癌具有高度異質(zhì)性，且本研究樣本量較小，為獲得更準(zhǔn)確、詳實(shí)的研究數(shù)據(jù)和結(jié)論，還需擴(kuò)大樣本數(shù)量開展進(jìn)一步探究。

倫理學(xué)聲明：本研究于2020年6月15日經(jīng)由海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬東方肝膽外科醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：孫冠群和周思蕾負(fù)責(zé)文章撰寫及相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲??；曾榃倫、劉君宇負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析；梁喜俊負(fù)責(zé)文章撰寫、修改指導(dǎo)；程卓負(fù)責(zé)關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、文章撰寫、修改指導(dǎo)及審定。