盧海強(qiáng)，陳 偉，田洪濤，谷新晰，谷子林

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000）

單寧酶(EC 3.1.1.20)是一類能夠水解單寧酯鍵和縮酚酸鍵酶的總稱［1］，廣泛分布在植物，動物和微生物中［2-3］。目前，單寧酶已表現(xiàn)出了巨大應(yīng)用價(jià)值，如茶經(jīng)單寧酶處理后，可有效控制“茶乳”的形成，增強(qiáng)茶的口感和風(fēng)味［3-4］。單寧酶可以提升果汁的澄清度，降低果汁的苦澀及增強(qiáng)果汁的生物活性等效果［6］。除此之外，單寧酶在飼料和廢水處理也有著巨大應(yīng)用［7-8］。目前商品化的單寧酶主要來自曲霉，如黑曲霉［9］和米曲霉［10］等。然而，這些單寧酶也存在一些不足，如較差的縮合單寧降解效率及較高的溫度敏感性，這些因素限制了單寧酶的應(yīng)用領(lǐng)域。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，目前重組菌構(gòu)建越來越受到關(guān)注，單寧酶重組菌也越來越多，如Kanpiengjai 等人從乳酸菌中克隆了堿性單寧酶基因并在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達(dá)［11］；Kumar等人從肺炎克雷伯菌中克隆了單寧酶基因并在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達(dá)［12］。然而，目前只有少數(shù)單寧酶得到了詳細(xì)的表征和商業(yè)化應(yīng)用，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足單寧酶相關(guān)研究和應(yīng)用的需要。2020 年Dai等人首次從植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了單寧酶［13］，豐富了現(xiàn)有單寧酶資源，而該單寧酶的相關(guān)性質(zhì)尚未見報(bào)道。

本研究擬依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化并合成柿樹單寧酶基因；在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行單寧酶生產(chǎn)，利用Ni-NTA 親和層析對產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并對重組單寧酶PsnTanA 進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征，為柿樹單寧酶PsnTanA 的理論和應(yīng)用研究提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（Escherichia coli）BL21(DE3) 由本課題組保存；PCR 反應(yīng)試劑購自大連寶生物有限公司，硫酸卡那霉素（Kan），瓊脂糖凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker 購自河北瑞帕特生物科技有限公司；羅丹寧，沒食子酸正丙酯購自上海源葉生物科技有限公司；Ni-NTA 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 Bio-RAD；SDS-PAGE 電泳設(shè)備 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。立式高速低溫離心機(jī)HITACHI 公司；JY88-IIN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柿樹單寧酶密碼子優(yōu)化及基因合成 使用GenSmart? Codon Optimization 工具（https://www.genscript.com/）對柿樹單寧酶基因（MK381274.1）進(jìn)行稀有密碼子分析及優(yōu)化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并連接至pET30a 表達(dá)載體。

1.3.2 生物信息分析 采用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/interactive）軟件對單寧酶PsnTanA 進(jìn)行同源建模，并利用Pymol 軟件進(jìn)行可視化分析。使用 Vector NTI 11.0 軟件計(jì)算單寧酶PsnTanA 的基本參數(shù)。

1.3.3 重組菌的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá) 表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至E. coilBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，隨后挑取單菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵菌液OD600達(dá)到0.6 左右時(shí)添加IPTG 試劑的進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，取培養(yǎng)液，8 000 r/min 條件下離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，并用PB 緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）重懸后超聲破碎，超聲條件為：超聲5 s，間歇6 s，超聲功率0.3 kW，20 次。細(xì)胞破碎液離心后收集上清，即為粗酶液樣品。

1.3.4 重組單寧酶的純化及SDS-PAGE 分析 采用Ni-NTA親和層析方法進(jìn)行重組酶PsnTanA的純化。將粗酶液注入平衡好的Ni 柱，用9 mL PB 緩沖液分3 次加入洗滌雜蛋白，分別用3 mL 含20，40，80，100，200 和300 mmol/L 咪唑的洗脫液進(jìn)行洗脫處理，收集各部分洗脫液，測定單寧酶酶活性。利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）檢測各組分的純化效果。采用Bradford 方法測定蛋白質(zhì)濃度。

1.3.5 單寧酶酶活力的測定 參考Sharma 等［14］的方法進(jìn)行單寧酶活性的測定：取適當(dāng)稀釋酶液（100 μL）與沒食子酸丙酯溶液（400 μL，1.25 mmol/L，pH 6.0） 混 勻，30 ℃反 應(yīng)10 min 后 加 入300 μL羅丹寧甲醇溶液（50 mmol/L）終止反應(yīng)，加入溶液KOH（200 μL，0.5 mol/L）進(jìn)行顯色，隨后在520 nm 波長處測定吸光度。定義每分鐘生成1 μmol沒食子酸所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 溫度和pH 對重組單寧酶活性的影響 以沒食子酸正丙酯為底物，在0 ～80 ℃的溫度的條件下測定重組酶PsnTanA 活性變化規(guī)律；在40 ℃或50℃條件下處理0、5、10、20、30 和60 min 后，測定重組單寧酶活性變化規(guī)律；將重組酶PsnTanA 在pH 2.0 ～12.0 條件下測定重組酶PsnTanA 活性變化規(guī)律；在不同pH 2.0 ～12.0 緩沖液中，0 ℃保溫1 h 后測定重組酶PsnTanA 活性變化規(guī)律。

1.3.7 金屬離子及化學(xué)試劑對重組單寧酶活性的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入不同金屬離子或不同化學(xué)試劑，使其濃度分別為1 mmol/L 和5 mmol/L（或體積濃度1%和5%）進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行活性的測定。

1.3.8 重組單寧酶底物特異性及動力學(xué)常數(shù)的測定 參考上述活性測定方法，分析重組酶PsnTanA 對沒食子酸甲酯（MG）、沒食子酸乙酯（EG）、沒食子酸正丙酯（PG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的底物的水解能力。稱取1.0 g 茶（紅茶、綠茶）或谷物（高粱、綠豆）研磨成粉末狀，料水比（w/v）為1∶50，煮沸，冷卻至適當(dāng)溫度，加入單寧酶（以U 為單位添加），在單寧酶的最適反應(yīng)溫度下反應(yīng)1 h，煮沸5 min 滅酶活，測定沒食子酸。在最適條件下，以PG（0.25 ～5 mmol/L）為反應(yīng)底物，基于Lineweaver-Burk 方法計(jì)算重組單寧酶PsnTanA 的Km 和Vmax 值。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì) 上述試驗(yàn)均重復(fù)3 次，并利用GraphPad Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酶PsnTanA 的生物信息學(xué)分析

柿樹單寧酶PsnTanA 的基因全長912 bp，編碼303 個(gè)氨基酸和1 個(gè)終止密碼子。經(jīng)分析野生型柿樹單寧酶基因中含有30 個(gè)大腸桿菌稀有密碼子和5處連續(xù)稀有密碼子（CCC CCC、GGA CCC、GGG AGG、ACG GGG 和AGA GGG）。優(yōu)化后，該基因共有21 個(gè)稀有密碼子進(jìn)行了同義密碼子的替換，并消除了連續(xù)稀有密碼子。CAI（Codon Adaptation Index）值和GC 含量由此前的0.62 和60.20%分別改變?yōu)?.76 和57.11%，基因序列優(yōu)化前后的一致性為78.3%。

經(jīng)三維結(jié)構(gòu)模擬分析可知（見圖1），單寧酶PsnTanA 由2 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是α/β 水解酶折疊域和Lid 結(jié)構(gòu)域。α/β 水解酶折疊核心域或由8 個(gè)β 折疊片和5 個(gè)α 螺旋組成，其中2 個(gè)α螺旋位于8 個(gè)β 折疊的凹側(cè)(α2 和α17)，3 個(gè)位于凸面(α3、α4 和α12)。Lid 結(jié)構(gòu)域則由2 個(gè)平行的β 折疊和1 個(gè)反平行的β 折疊組成。單寧酶PsnTanA 催化三聯(lián)體殘基為S164、D245 和H278，具有保守活性位點(diǎn)基序“G-X-S-X-G”，而與微生物來源單寧酶中普遍存在的“CS-D-HC”保守基序存在差異［15］。Dai 等人構(gòu)建了柿樹單寧酶G76A和G77A 突變體，發(fā)現(xiàn)突變體不再具有單寧酶活性，證明了Gly-Gly 氧陰離子洞在催化水解過程具有關(guān)鍵的作用［13］。Ser164 位于底物口袋底部特征性的“親核肘”位置，處于β8-α4 的loop 結(jié)構(gòu)頂部，這允許親核氨基酸殘基有效地呈遞給底物，并將酶-底物中間體定位在氧陰離子洞的氫鍵距離內(nèi)，從而使過渡態(tài)的穩(wěn)定。

圖1 柿單寧酶PsnTanA 的 三維結(jié)構(gòu)模擬Fig. 1 The overall structure of tannase PsnTanA from persimmon

2.2 重組酶PsnTanA 的純化及SDS-PAGE 分析

發(fā)酵液菌體經(jīng)超聲波破碎處理后，采用鎳柱親和層析方法進(jìn)行重組蛋白的純化。經(jīng)測定，當(dāng)洗脫液為40 mmol/L 咪唑時(shí)，收集到的單寧酶活性最高。經(jīng)SDS-PAGE 分析（見圖2），泳道1 為細(xì)胞破碎液上清，泳道2 為純化的重組蛋白，表觀分子量約為39 kD，其比酶活力為1.08 U/mg。本研究中，重組酶PsnTanA 采用融合表達(dá)His 標(biāo)簽策略進(jìn)行異源表達(dá)，繼而增大了酶蛋白分子量，類似的現(xiàn)象也有報(bào)道［16］。

圖2 重組單寧酶PsnTanA 的SDS-PAGE 分析Fig. 2 The SDS-PAGE analysis of purified recombinant tannase PsnTanA

2.3 單寧酶PsnTanA 的酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 溫度和pH 對重酶活力的影響 如圖3A 所示，單寧酶PsnTanA 在0 ～70 ℃范圍內(nèi)均表現(xiàn)出一定的活性，50 ℃時(shí)活性最高，在40 ～50 ℃的溫度范圍酶活力維持在76.9%，隨著反應(yīng)溫度的增加，重組單寧酶活性急劇下降，70 ℃僅殘留10%左右的酶活力。重組酶PsnTanA 在40 ℃溫度條件下處理60 min 后，酶活力仍保持80.0%以上，該酶表現(xiàn)出較好的溫度穩(wěn)定性；隨著處理溫度的提升，酶的溫度耐受性隨之減弱，如在50 ℃溫度條件下處理60 min后，酶活力保持在10.0%左右（圖3D）。

由 圖3B 可 知， 重 組 酶PsnTanA 在pH2.0 ～12.0 范圍內(nèi)均表現(xiàn)出活性，pH 7.0 反應(yīng)條件下，PsnTanA 的酶活力最大，而pH8.0 條件下，PsnTanA的酶活力降至20.3%。經(jīng)重組酶PsnTanA 的pH 穩(wěn)定性測定結(jié)果（圖3C）可知，該酶在pH6 ～12 之間具有較好的穩(wěn)定性，殘余酶活力大于60%，在酸性條件下，重組酶的穩(wěn)定性較差。

圖3 重組單寧酶PsnTanA 的酶學(xué)特性Fig. 3 Enzymatic properties of the recombinant tannase PsnTanA

2.3.2 金屬離子和化學(xué)試劑對酶活力的影響 經(jīng)測定低濃度（1 mmol/L）的Ca2+對PsnTanA 無抑制作用，Na+、K+、Li+及Mg2+在1 和5 mmol/L 的濃度下，對PsnTanA 酶活力有輕度抑制作用，殘余酶活力保持在70% 以上。Al3+對PsnTanA 酶活力有中度抑制作用，重金屬離子Ag+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+對PsnTanA 酶活力有重度抑制作用。在5 mmol/L 的濃度下Ag+、Zn2+、Cu2+和Fe3+可使PsnTanA 酶活力喪失90%以上，其中Cu2+幾乎完全抑制PsnTanA 的酶活力（見表1）。

表1 金屬離子和化學(xué)試劑對單寧酶PsnTanA 的影響Table 1 Effect of metal ions and chemical reagents on the activity of tannase PsnTanA

化學(xué)試劑對重組酶PsnTanA 均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，并且多數(shù)試劑添加量越大抑制作用越強(qiáng)，只有尿素在高濃度下抑制作用反而減弱。螯合劑EDTA 抑制了PsnTanA 約35% 的酶活力；表面活性劑SDS、吐溫80 和CTAB 的抑制作用最強(qiáng)，幾乎完全抑制了PsnTanA 的酶活力；5%的甲醇、乙醇、異丙醇及丙酮可抑制90%以上的酶活力。

2.4 單寧酶PsnTanA 的底物譜和動力學(xué)參數(shù)

經(jīng)測定，單寧酶PsnTanA 隨著底物酯鏈的增加而活性降低，且該酶對合成底物（MG、EG 和PG）表現(xiàn)出比天然底物（EGCG）更高的活性。以PG 為底物，重組酶PsnTanA 的Km 值和Vmax 值分別為1.71 mmol/L 和2.56 mmol/（L·min）。本研究進(jìn)一步測定了該酶在綠茶、紅茶、高粱及綠豆中的降解能力（圖4）。重組酶PsnTanA 可有效降解綠茶中的單寧物質(zhì)，使得單寧酸的含量提高了40%左右（綠茶含7.5 μg/mL），然而類似的現(xiàn)象并未在紅茶的酶解中發(fā)現(xiàn)。除此之外，該酶對高粱中的單寧有表現(xiàn)出了高效的降解，使得沒食子酸含量增加了42.2 μg/mL。同樣，重組酶對綠豆中的單寧也顯示出了較好的降解能力。

圖4 重組單寧酶PsnTanA 的底物特異性Fig. 4 The substrate specificity of the recombinant tannase PsnTanA

3 結(jié)論與討論

柿樹與大腸桿菌的遺傳密碼子使用頻率存在較大差異，因此，參照大腸桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化PsnTanA 的野生型基因，替換了21 個(gè)大腸桿菌稀有密碼子，改善了密碼子偏性狀況，CAI 值由0.62 提高至0.76，更接近于理想值1.0［17］，這為該酶的成功表達(dá)提供了保障。

重組酶PsnTanA 最適反應(yīng)溫度為50 ℃，在40 ～55 ℃反應(yīng)時(shí)，該酶可表現(xiàn)出約80 % 以上的酶活力，當(dāng)溫度大于60 ℃后，酶活力急劇下降。Kanpiengai 等人報(bào)道的戊糖乳桿菌單寧酶LpTanBA-7 的最適反應(yīng)溫度同樣為50 ℃，LpTanBA-7 在50 ℃下酶活力半衰期為30 min。重組酶PsnTanA 在50 ℃溫條件下處理10 min 后，酶活力保持在49.0%，在40 ℃溫度條件下處理60 min后，仍保持80.0%的酶活力。pH 值影響活性位點(diǎn)氨基酸殘基的質(zhì)子化和去質(zhì)子化，而影響酶的催化效率和穩(wěn)定性［18］。多數(shù)真菌單寧酶在酸性環(huán)境中有較高酶活力，最適pH 值在pH 4.5 ～6.0 的范圍內(nèi)［19］；而大多數(shù)細(xì)菌來源的單寧酶則在pH 值7.0 ～8.0 的范圍內(nèi)具有較高酶活力［20］。魯頓葡萄球菌單寧酶pH 值為7.0，同重組單寧酶PsnTanA 一樣在酸性環(huán)境中酶活力較低，但經(jīng)過固定化后魯頓葡萄球菌單寧酶酶活力提高了35%［21］。酶經(jīng)固定化材料包埋后，固定化酶在液體環(huán)境中的暴露減小，溶液中pH的變化對固定化酶活性的影響較小。因此，單寧酶PsnTanA 的固定化應(yīng)是提高該酶特性的策略之一。

金屬離子和化學(xué)試劑對重組酶PsnTanA 的酶活力均表現(xiàn)出不同程度的抑制，其中金屬離子的抑制作用尤為顯著，如Cu2+和Fe3+幾乎完全使PsnTanA活性喪失。類似的現(xiàn)象在黃蕾等［22］、Kanpiengjai等等人研究中均有發(fā)現(xiàn)［11］。推測這很可能是由于金屬離子與酶活性部位的巰基、色氨酸殘基和或羧基相結(jié)合，繼而阻礙了酶與底物結(jié)合而生成產(chǎn)物。

本研究實(shí)現(xiàn)了柿樹單寧酶PsnTanA 在大腸桿菌中的異源表達(dá)，重組酶 PsnTanA 最適反應(yīng)溫度和最適pH 分別為50 ℃和7.0 ，該酶對高粱中的單寧有較好的降解效果，本研究有利于柿樹單寧酶PsnTanA 理論和應(yīng)用研究的進(jìn)一步開展。