張靖男，韋麗君，陳娟娟，楊鑫雷，穆國俊，侯名語，崔順立，劉立峰

（河北農(nóng)業(yè)大學 華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/華北作物種質(zhì)資源教育部重點實驗室/河北省種質(zhì)資源實驗室，河北 保定 071001）

花生是世界重要的油料作物之一，同時也是人類重要的優(yōu)質(zhì)植物油脂和蛋白質(zhì)來源。目前，有關花生轉錄因子家族的鑒定與分析已有一些進展，如bHLH［1］、WRKY［2］、bZIP［3］等，其中與bHLH家族蛋白具有相似DNA 結構域的轉錄因子家族——TCP 轉錄因子［4］，則在花生中鮮見報道。TCP 是由玉米的Teosinte branched1（TB1）、金魚草的Cycloidea（CYC）和水稻的Proliferating cell factors（PCF1 和PCF2）4 個基因的首字母組合而成［5］。其中，TB1 基因與植物的頂端優(yōu)勢有關，CYC 基因對花序的對稱結構有重要作用，PCF 則與水稻PCAN 基因的啟動子結合相關［6］。前人研究表明，TCP 轉錄因子廣泛參與植物激素合成和信號轉導［7］、形態(tài)建成［8］和逆境脅迫應答［9］。TCP 基因家族已在擬南芥（24 個）和水稻（21 個）［10］、玉米（43 個）［11］、大 豆（54 個）［12］、陸 地 棉（74個）［13］等作物中被鑒定，且部分基因的分子功能已清楚。如擬南芥AtTCP1 基因通過調(diào)節(jié)DWF4 的表達來調(diào)節(jié)BR 的生物合成［14］；AtTCP20 能夠調(diào)控葉片的衰老［15］；水稻OsPCF7 基因能夠調(diào)控水 稻 株 高 及 分 蘗［16］；玉 米GRMZM2G120151、GRMZM2G148022和GRMZM2G089361可能參與調(diào)控分生組織細胞分裂周期，從而影響器官發(fā)育［17］；TCP 家族基因可能影響大豆的花序形態(tài)建成及側枝數(shù)［18］；陸地棉GhTCP14在纖維伸長期的細胞中表達量受外源生長素上調(diào)表達［19］。鑒于此，本研究通過側枝發(fā)育轉錄組測序及生物信息學方法，對花生TCP 家族基因進行全基因組鑒定、理化性質(zhì)分析、保守結構域分析、系統(tǒng)進化分析及在側枝發(fā)育的不同時期的轉錄表達分析，為進一步研究花生TCP 轉錄因子的功能及其調(diào)控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料花生品種‘冀花5 號’（直立型）和‘M130’（匍匐型）由河北農(nóng)業(yè)大學花生育種組提供，種植于河北農(nóng)業(yè)大學創(chuàng)新實踐園，催芽盆栽。待2品種的第1 對側枝長出后的5、10、15、20、25、30 d，每個時期分別取3 株混樣（3 次生物學重復）樣品（每份樣品由3 株混樣），液氮速凍，存放于-80 ℃冰箱，送至北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序。

1.2 方法

1.2.1 花生TCP 基因家族鑒定 從Peanutbase 網(wǎng)站下載四倍體花生和野生二倍體花生基因組蛋白序列；同時，從Pfam 數(shù)據(jù)庫下載隱馬爾可夫模型文件（PF03634），通過在線工具HMMER（https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）進行TCP 蛋白序列搜索，并在Pfam 數(shù)據(jù)庫中進行序列比對和確認。

1.2.2 花生TCP 家族基因生物信息學分析 依據(jù)各成員在花生基因組中的物理位置，依次命名［20］；通 過TAIR（https://www.arabidopsis.org/） 下 載 擬南芥TCP 家族成員，采用MEGA-X（https://www.megasoftware.net/）進行花生和擬南芥TCP 家族成員的多序列比對，鄰接法構建系統(tǒng)進化樹；利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在線預測保守基序；采用GSDS 2.0［21］繪制基因結構圖；通過Expasy (http://www.expasy.org/tools/protparam)在線網(wǎng)站對各成員的氨基酸數(shù)量、分子量大小、等電點等理化性質(zhì)進行預測；利用Cello（http://cello.life.nctu.edu.tw/）進行亞細胞定位預測；通過PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線預測各基因啟動子區(qū)順式作用元件，采用GSDS2.0 繪制順式作用元件圖。

1.2.3 花生TCP 家族基因表達分析 以‘冀花5 號’和‘M130’第1 對側枝不同生長時期的轉錄測序FPKM 值作為基因表達衡量標準進行表達分析。采用R 語言繪制基因表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 花生TCP 家族基因的全基因組鑒定

全基因組共獲得51 條保守域完整的序列，除TCP 保守域外，還在部分成員發(fā)現(xiàn)R 域。研究分別在AABB、AA 與BB 各基因組中獲得30 個（AhTCP1 ～AhTCP30）、11（AduTCP1 ～AduTCP11）和10 個（AipTCP1 ～AipTCP10）TCP 家 族 成 員（表1）。結果顯示，30 個AhTCPs 位于14 條染色體上，其中染色體13 上分布最多，為4 個。11 個AduTCPs 位于6 條染色體上，其中染色體A03 和A04 分布最多，為3 個。10 個AipTCPs 位于5 條染色體上，其中染色體B03 和B10 上最多，為3 個。

表1 花生TCP 基因家族染色體位置信息Table 1 Chromosome position information of TCP gene family in peanut

續(xù)表：

2.2 TCP 家族基因的系統(tǒng)進化分析

通過對花生和擬南芥TCP 家族成員的系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)（圖1），家族成員在2 物種內(nèi)相對保守。51 個花生TCP 家族成員聚為ClassⅠ和ClassⅡ兩類，又在ClassⅡ劃分為CYC/TB1 和CIN 2 個亞類。其中，AhTCPs 在ClassⅠ、CYC/TB1 與CIN 等亞類分別含有12 個、10 個和8 個家族成員；AduTCPs 在各亞類分別含有4 個、3 個和4 個家族成員；AipTCPs分別含有2 個、3 個和5 個家族成員。研究發(fā)現(xiàn)部分包含R 域的成員聚在ClassⅡ中。

圖1 花生和擬南芥TCP 基因家族進化樹Fig .1 Phylogenetic analysis of TCP gene family between Arabidopsis and peanut

2.3 基因結構與Motif 分析

基因結構分析發(fā)現(xiàn)，AhTCPs 含有1 ～6 個外顯子，其中以1 個外顯子（10 個）和2 個外顯子（9 個）成員居多（圖2a）。AduTCPs 含有1 ～5個外顯子（圖2b），其中AduTCP4、AduTCP10最多，為5 個；AipTCPs 含有1 ～7 個外顯子（圖2c），其中AipTCP9最多，為7 個。通過對Motif的比較發(fā)現(xiàn)（表2，圖3），所有AhTCPs 都存在Motif1-AABB，Motif2-AABB 存 在 于Class Ⅱ的AhTCP2、AhTCP19、AhTCP12、AhTCP28、AhTCP8、AhTCP22、AhTCP15、AhTCP30、AhTCP20、AhTCP6這10 個成員內(nèi)，Motif3-AABB僅存在于Class Ⅰ，Motif4-AABB 分布于部分成員，Motif5-AABB 僅存在于CYC/TB1；AA 基因組中，Motif1-AA 存在于除AduTCP5外的所有AduTCPs中，Motif2-AA 僅 存 在 于AduTCP8和AduTCP11中，Motif3-AA 存在于所有AduTCPs 中，Motif4-AA 和Motif5-AA 僅存于ClassⅡ；BB 基因組中，Motif1-BB 存 在 于 除AipTCP9外 的AipTCPs 中，Motif2-BB 僅 存 在 于AipTCP6和AipTCP10中，Motif3-BB 僅存于CIN 亞組，Motif4-BB 存在于除AipTCP1 外的所有AipTCPs 中，Motif5-BB 僅存在于ClassⅠ。綜上可知，Motif1 構成TCP 保守域，Motif2 構成R 域。

圖2 花生TCP 家族基因結構圖Fig. 2 Gene structure of TCP family genes in peanut

表2 花生TCP 基因家族Motif 預測及序列信息Table 2 Motif prediction and sequence information of TCP gene family in peanut

2.4 理化性質(zhì)及亞細胞定位預測分析

理化性質(zhì)預測分析發(fā)現(xiàn)（表3）：AhTCPs 的氨基酸數(shù)目在131 ～658 之間，平均分子量為43.53 kD，分別多于AA（83 ～456，30.16 kD）和BB（127 ～455，33.67 kD）基因組的氨基酸數(shù)目和平均分子量大小。

表3 花生TCP 蛋白理化性質(zhì)、二級結構及亞細胞定位Table 3 Physicochemical properties, secondary structure and subcellular location of TCP proteins in peanut

2.5 啟動子區(qū)順式作用元件分析

家族成員上游2 000 bp 啟動子區(qū)順式作用元件預測發(fā)現(xiàn)：AA、BB、AABB 基因組分別發(fā)現(xiàn)77、75 和94 種順式作用元件，其中22 種順式作用元件與激素響應、植物生長發(fā)育和逆境脅迫等相關（圖3）。與激素響應相關的家族成員，分別有24 個存在脫落酸反應元件（ABRE）、19 個有生長素應答元件（AuxRR-core 和TGA-element）、44 個有乙烯反應元件（ERE）、26 個有赤霉素反應元件（GAREMotif、P-box 和TATC-box）、27 個有水楊酸反應元件（TCA-element）以及30 個有MeJA 反應調(diào)控元件（CGTCA-Motif 和TGACG-Motif）；與植物生長發(fā)育調(diào)控元件相關的家族成員，分別有15 個存在與分生組織表達相關調(diào)控元件（CAT-box 和CCGTCC-box）、20 個存在與晝夜節(jié)律調(diào)控相關元件（circadian）、17 個存在參與胚乳表達的調(diào)控元件（GCN4_Motif）、20 個存在玉米醇溶蛋白調(diào)控元件（O2-site）；與逆境脅迫響應元件相關家族成員，分別有43 個存在厭氧誘導元件（ARE）、15個存在低溫響應元件（LTR）、24 個存在干旱誘導元件（MBS）、10 個存在防御應激元件（TC-rich repeats）、28 個存在傷口應激元件（WUN-Motif）。

圖3 花生TCP 基因家族順式作用元件分析Fig .3 The analysis of cis-acting elements of TCP gene family in peanut

2.6 花生TCP 基因表達分析

AhTCPs 在‘冀 花5 號’‘和M130’的6 個側 枝 發(fā) 育 時 期（5、10、15、20、25 和30 d）的表達模式分析結果顯示（圖4），30 個AhTCP 基因共檢測到24 個基因，其中AhTCP1、AhTCP4、AhTCP5、AhTCP17、AhTCP25和AhTCP26尚未在轉錄組中檢測到。第Ⅰ組中AhTCP12、AhTCP13、AhTCP14、AhTCP15、AhTCP28和AhTCP30具有相似的表達特征，6 個基因在兩品種的6 個生長時期中普遍低水平表達。第Ⅱ組中AhTCP3、AhTCP7、AhTCP16、AhTCP21和AhTCP27具 有相似的表達特征，5 個基因在2 品種的6 個生長時期中普遍高水平表達，其中以AhTCP27表達水平最高。第Ⅲ組中，AhTCP2、AhTCP6、AhTCP8、AhTCP9、AhTCP11、AhTCP19、AhTCP20、AhTCP22、AhTCP23和AhTCP29表達水平均較高。而AhTCP18在2 品種中表達趨勢一致，呈現(xiàn)出先降低后升高的表達模式；AhTCP10和AhTCP25在‘冀花5 號’中呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，而在M130呈現(xiàn)逐步降低的趨勢。

圖4 AhTCPs 基因在栽培種花生側枝發(fā)育中的轉錄表達模式Fig. 4 Transcriptional expression pattern of AhTCPs in the lateral branch development of the cultivated peanut

3 討論

隨著高通量測序技術的完善，大量物種完成了基因組測序，TCP 轉錄因子已在多個植物種被鑒定，其家族成員數(shù)目不盡相同［10-14］。本研究通過全基因組鑒定獲得51 個花生TCP 轉錄因子家族成員，被劃分為兩類3 組，與擬南芥TCP 基因家族分類一致［10］；其中ClassⅠ大部分家族成員僅具有編碼序列（CDS），內(nèi)含子數(shù)目較ClassⅡ家族成員少，說明花生TCP 基因在進化中序列呈現(xiàn)高度保守狀態(tài)，與Yao 等［10］研究結果相符。TCP 氨基酸序列與bHLH 氨基酸序列存在較大差異，Marc 等［5］認為這可能是趨同進化的結果；啟動子順式作用元件預測結果中存在與激素響應、生長發(fā)育、脅迫應答元件，相關研究結果與Ling 等［22］一致。大量研究表明，擬南芥中的AtTCP11基因參與維管束后生木質(zhì)部導管分子的分化和形成［23］；AtTCP20基因調(diào)控植物生長發(fā)育、茉莉酸 (JA) 生物合成及葉片衰老［24］；AtTCP22基因負向調(diào)控葉片衰老，并與AtTCP15基因存在功能冗余現(xiàn)象［25］，而花生TCP 家族基因上游2 000 bp 啟動子區(qū)內(nèi)的多種順式作用元件的存在，可推測TCP 家族基因也參與花生生長發(fā)育的多個生物學進程。

本 研 究 中AhTCP11、AhTCP29和AtTCP9被劃分到ClassⅠ中，具有較高的序列同源性，推測AhTCP11和AhTCP29可能具有類似AtTCP9調(diào)控葉片衰老和根系發(fā)育［25］的功能；AhTCP5、AhTCP18與AtTCP3、AtTCP4被劃分到ClassⅡ中，且具有較高的同源性，推測其可能作為microRNA 的靶基因參與花生葉片發(fā)育［26］；AhTCP2、AhTCP19與AtTCP18（TB1 同系物）［27］被劃分到ClassⅡ（CYC/TB1）中，且序列同源性較高。水稻OsTB1基因［28］和高粱SbTB1 基因［29］均屬于TB1，與擬南芥AtTCP18序列高度同源，過表達后抑制腋芽的發(fā)育，減少分蘗的總數(shù)，進而影響植物的分枝發(fā)育。本研究通過對不同株型花生品種側枝發(fā)育轉錄表達分析，發(fā)現(xiàn)AhTCP2、AhTCP18和AhTCP19在2 品種不同側枝發(fā)育時期存在表達差異，推測3 個基因可能具有調(diào)控花生側枝發(fā)育，改變植物形態(tài)的作用，其生物學功能有待進一步驗證。另外，AhTCP3和AhTCP16基因與AtTCP11［27］基因具有的高同源性，推測AhTCP3和AhTCP16可能參與木質(zhì)部細胞的形成 與 分 化；AhTCP23和AhTCP9與AtTCP20［28］具有較高的同源性，推測AhTCP23和AhTCP9調(diào)控花生葉片衰老。