唐麗媛，李興河，王海濤，張素君，蔡 肖，劉存敬，張建宏

(河北省農(nóng)林科學(xué)院 棉花研究所/農(nóng)業(yè)部黃淮海半干旱區(qū)棉花生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室/國家棉花改良中心河北分中心，河北 石家莊 050051)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)中占有十分重要的地位［1］。在當(dāng)前棉花種植面積持續(xù)下降的形勢下［2］，充分利用雜種優(yōu)勢［3-6］育成強優(yōu)勢雜交棉，可有效提高棉花產(chǎn)量。

棉鈴發(fā)育85% 以上所需能量來自棉鈴對位葉［10］，是產(chǎn)量形成的主要源器官，而光合作用是作物產(chǎn)量形成的根本來源，是所有生理進(jìn)程的基礎(chǔ)［11-12］，對植株產(chǎn)量及品質(zhì)的形成至關(guān)重要［13］，且能夠穩(wěn)定遺傳［14-15］，因此通過優(yōu)勢雜交種棉鈴對位葉的光合生理特性分析可解析其產(chǎn)量形成，但棉花上針對棉鈴對位葉進(jìn)行光合生理特性的研究還較少［16］。光合作用是受多基因和蛋白精細(xì)調(diào)控的復(fù)雜性狀，隨著分子生物學(xué)飛速發(fā)展，目前該研究不再只局限于生理指標(biāo)測定，而通過基因表達(dá)、基因組學(xué)等現(xiàn)代分子手段解釋不同作物的雜種優(yōu)勢機制［17-18］。光合機構(gòu)的形成由核質(zhì)基因共同編碼，其中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是決定碳同化速率的關(guān)鍵酶，也是光呼吸中不可缺少的加氧酶，由8 個大亞基和8 個小亞基組成［19］，Rubisco 小 亞 基（Rubisco smaller subunit, RbcS）由核基因組編碼，大亞基（Rubisco larger subunit,RbcL）由葉綠體基因組編碼［20］，在光合作用調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起著重要作用，但其基因表達(dá)在棉花中的報道不多。本研究以高產(chǎn)雜交棉‘冀1518’［21］及雙親為試驗材料，比較其棉鈴發(fā)育各時期棉鈴對位葉的光合性能指標(biāo)差異，分析光合相關(guān)基因表達(dá)特征，從光合性能層面解析雜交棉‘冀1518’獲得高產(chǎn)的生理機制，以期為今后更好的利用雜種優(yōu)勢定向創(chuàng)制新種質(zhì)、培育高產(chǎn)雜交種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以高產(chǎn)雜交棉‘冀1518’［21］及雙親為試驗材料，母本為‘冀228’［22］，父本為‘冀567’，材料均由河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2 試驗地點及試驗設(shè)計

試驗于2018—2019 年在河北省農(nóng)林科學(xué)院棉花研究所石家莊小安舍試驗站進(jìn)行，供試土壤為砂壤土，地力均勻，前茬作物為棉花。2018 年4 月25日播種，5 月14 日移栽；2019 年4 月23 日播種，5月13 日移栽。試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置3 次重復(fù)，小區(qū)面積7.1 m×6 m，行距0.75 m，株距0.25 ～0.30 m，將每小區(qū)一半作為田間取樣區(qū)，一半作為調(diào)查、測產(chǎn)區(qū)。小區(qū)周圍設(shè)置保護(hù)行。田間管理同一般試驗田管理。

1.3 取樣

本研究以棉鈴對位葉為研究對象，棉花盛花期對植株中部第6 ～8 果枝的1 ～2 果節(jié)在開花當(dāng)天掛牌標(biāo)記［10］，分別取開花后0DPA(Days post anthesis)、10DPA、20DPA、30DPA、40DPA 共5個時期棉鈴對位葉，每個時期取10 片，經(jīng)液氮速凍保存于- 80℃冰箱待測相關(guān)酶活性及基因表達(dá)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 光合數(shù)據(jù)及葉綠素含量測定 對標(biāo)記的棉鈴對位葉自開花當(dāng)日起每隔10 d 測定光合性能指標(biāo)，測定時間與取樣時間同步，0DPA ～40DPA 分5個時期完成測定。于晴天北京時間9:00—12:00 用Li6400 便攜式光合測定儀，測定各材料對應(yīng)葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），為減小環(huán)境中自然條件不穩(wěn)定造成的誤差，使用內(nèi)置人工光源和葉室控溫裝置，并開啟空氣干燥器，光照強度設(shè)置為1 200 umol/(m2·s)，葉室溫度設(shè)為30 ℃固定值［16］，當(dāng)光合速率數(shù)值在設(shè)置的光照強度和葉室溫度條件下穩(wěn)定時進(jìn)行測定，每個小區(qū)測5 片葉，取平均值；同時用日本產(chǎn)SPAD-502 型葉綠素計測定該葉片葉綠素含量，每個小區(qū)測5 片葉，取平均值。

1.4.2 水分利用效率和羧化效率 利用測定光合數(shù)據(jù)計算水分利用效率（WUE，）和羧化效率（CE），作為衡量光合特性指標(biāo)。WUE=Pn/Tr［23］；CE=Pn/Ci［24］。

1.4.3 超氧化物歧化酶、過氧化物酶酶活及丙二醛含量測定 分別采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司試劑盒測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）酶活和丙二醛（MDA）含量。

1.4.4 葉面積測定和棉鈴調(diào)查 每調(diào)查區(qū)選擇連續(xù)5 株生長一致的棉株，在盛花期（7 月25 日）、結(jié)鈴盛期（8 月20 日）和吐絮期（9 月20 日）對棉株果節(jié)數(shù)、脫落數(shù)進(jìn)行調(diào)查，并測定各果節(jié)對位展開葉最大葉面積。

1.4.5 雜種優(yōu)勢計算 應(yīng)用雜種優(yōu)勢率和超親優(yōu)勢率度量雜種優(yōu)勢程度。雜種優(yōu)勢率（中親優(yōu)勢率）=（雜交種性狀值-父母性狀本均值）/父母本性狀均值×100%［16］，＞0 為正向優(yōu)勢，＜0 為負(fù)向優(yōu)勢；超親優(yōu)勢率=（雜交種性狀值-高值親本性狀值）/高值親本性狀值×100%［25］。

1.4.6 產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成因素測定 于吐絮期調(diào)查各小區(qū)農(nóng)藝性狀，計算單株鈴數(shù)；待棉鈴成熟自然吐絮風(fēng)干后，每小區(qū)收獲10 株進(jìn)行單株籽棉產(chǎn)量測定；收獲中部50 個棉鈴稱重后計算單鈴重；收獲測產(chǎn)區(qū)全部籽棉，經(jīng)混合取樣后考種軋花計算衣分及皮棉產(chǎn)量。

1.4.7 葉片光合相關(guān)基因表達(dá)測定 使用普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司試劑盒提取不同時期葉片樣品的總RNA，利用Takara PrimeScript? RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄合成第1 鏈cDNA，以第1 鏈cDNA 為 模 板 在CFX96 定 量PCR 儀（Bio-Rad，USA）上進(jìn)行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。查找光合相關(guān)基因［19,26］，使用Primer Premier 5.0設(shè)計特異引物（表1），蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物。按照北京艾德萊生物科技有限公司2×Sybr Green qPCR Mix 推薦的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增。每個樣品設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)，以陸地棉組蛋白基因Histone3為內(nèi)參基因，采用2-△△CT法分析基因相對表達(dá)量。

表1 光合相關(guān)基因的引物Table 1 Photosynthetic genes primer sequences

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)使用Excel2010 軟件進(jìn)行處理，計算兩年均值及標(biāo)準(zhǔn)差，使用DPS15.1 對各性狀指標(biāo)進(jìn)行方差分析，以最小差數(shù)法（LSD 法）進(jìn)行多重比較，使用SigmaPlot 14.0 及R 語言作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘冀1518’產(chǎn)量雜種優(yōu)勢表現(xiàn)

對‘冀1518’及雙親主要產(chǎn)量性狀（表2）分析，‘冀1518’2 年產(chǎn)量性狀均表現(xiàn)出了顯著的雜種優(yōu)勢。

表2 ‘冀1518’及雙親主要產(chǎn)量性狀Table 2 Main yield traits between ‘Ji1518’ and its parents

2 年平均，‘冀1518’單株籽棉產(chǎn)量比兩親本分別高21.46%、8.64%，群體皮棉產(chǎn)量比兩親本分別高28.37%、12.42%，與父母本均呈顯著差異，表現(xiàn)出較強的超親優(yōu)勢；產(chǎn)量構(gòu)成因素中，‘冀1518’的平均鈴重、衣分及單株鈴數(shù)均表現(xiàn)出超親優(yōu)勢，單株鈴數(shù)（11.25%）＞衣分（2.70%）＞鈴重（1.25%），其中衣分和單株鈴數(shù)與雙親差異達(dá)顯著水平。

2.2 ‘冀1518’及雙親單株棉鈴對位葉相關(guān)性狀表現(xiàn)

對‘冀1518’及雙親單株棉鈴對位葉相關(guān)性狀（表3）分析發(fā)現(xiàn)，‘冀1518’總果節(jié)數(shù)比父本少但差異不顯著，而顯著多于母本，其所對葉面積同樣比父本小但差異不顯著，而顯著大于母本；‘冀1518’的成鈴率、單株成鈴對位葉總?cè)~面積和平均棉鈴葉面積均高于雙親，表現(xiàn)出4.92%～21.16%的超親優(yōu)勢，說明‘冀1518’在實際成鈴及有效光合產(chǎn)物生產(chǎn)方面具有超親優(yōu)勢。

表3 ‘冀1518’及雙親單株棉鈴對位葉相關(guān)性狀Table 3 Subtending leaf of cotton boll related traits per plant between ‘Ji1518’ and its parents

2.3 ‘冀1518’及親本不同時期棉鈴對位葉光合性能差異

分析‘冀1518’及親本棉鈴對葉位光合性能指標(biāo)的反應(yīng)如圖1 所示。

圖1 ‘冀1518’及親本棉鈴對葉位光合性能指標(biāo)分析Fig.1 Analysis of photosynthetic properties of subtending leaf of cotton boll between ‘Ji1518’ and its parents

Pn隨棉鈴增大呈逐漸降低趨勢，‘冀1518’Pn整個棉鈴發(fā)育階段均高于雙親，20DPA ～40 DPA與父母本差異均達(dá)到顯著水平，其中20DPA、30DPA超親優(yōu)勢率均達(dá)23.53%以上；Gs隨棉鈴發(fā)育逐漸降低，Gs在棉鈴發(fā)育前期（0DPA ～10DPA）介于母本和父本之間，自20DPA 均高于雙親，但僅在40DPA 與母本差異顯著；Ci在棉鈴整個發(fā)育階段呈單峰曲線趨勢，3 個材料均在30DPA 達(dá)到最高值，‘冀1518’在20DPA 低于雙親且與父本差異顯著，其他時期各材料間差異均不顯著；Tr在棉鈴發(fā)育階段整體呈逐漸下降趨勢，‘冀1518’在10DPA 極顯著低于雙親，而其他各時期值多介于雙親間且與雙親差異不顯著。

2.4 ‘冀1518’及親本不同時期SPAD、WUE 及CE 分析

SPAD在整個棉鈴發(fā)育階段呈逐漸下降趨勢(圖2)，‘冀1518’與雙親始終無顯著差異，雜種優(yōu)勢不明顯；WUE隨棉鈴發(fā)育未見明顯的一致性規(guī)律，其中‘冀1518’在10DPA ～30DPA 保持較高的水分利用率，顯著高于雙親，超親優(yōu)勢達(dá)24.25% ～42.89%，0DPA 和40DPA 與母本差異不顯著且在40DPA 低于母本；CE 整體呈下降趨勢，‘ 冀1518’ 整 個 時 期 高 于 雙 親， 表 現(xiàn) 出9.09% ～30.93%的超親優(yōu)勢，與母本在20DPA、40DPA 差 異 顯 著， 與 父 本 在0DPA ～20DPA、40DPA 差異顯著，3 個材料在30DPA 無顯著差異。

圖2 ‘冀1518’及親本棉鈴對葉位葉綠素含量(SPAD)、水分利用率(WUE)及羧化效率(CE)分析Fig.2 Analysis of SPAD, WUE and CE of subtending leaf of cotton boll between ‘Ji1518’ and its parents

2.5 ‘冀1518’及親本不同時期葉片細(xì)胞保護(hù)酶活性差異

圖3 分析表明，SOD和POD活性均呈單峰曲線，SOD活性中‘冀1518’和父本在20DPA 達(dá)到峰值，‘冀1518’高于雙親并與母本差異顯著，其他時期值均介于雙親值之間，‘ 冀1518’在10DPA ～40DPA 的 葉 片SOD活 性 表 現(xiàn) 為0.02%～12.83%的中親優(yōu)勢；3 個材料的POD活性0DPA ～20DPA 均較低，在30DPA 迅速達(dá)到峰值，‘冀1518’在各時期均高于雙親值，表現(xiàn)為16.14% ～31.34% 的 超 親 優(yōu) 勢， 在10DPA、30DPA、40DPA 與父母本均差異顯著；隨棉鈴增大，棉鈴對位葉逐漸衰老受損，‘冀1518’及其雙親MDA含量持續(xù)升高，‘冀1518’MDA含量及變化與母本相似，增長速率較慢且自30DPA 以后MDA含量顯著低于父本，整個時期表現(xiàn)為-0.57%～-26.62%的負(fù)向優(yōu)勢。以上結(jié)果表明，‘冀1518’為棉鈴發(fā)育提供主要營養(yǎng)的對位葉，在棉鈴發(fā)育階段尤其是中后期（30DPA ～40DPA），葉片細(xì)胞保護(hù)酶生理活性高而細(xì)胞損傷慢，因此葉功能期較雙親延長。

圖3 ‘冀1518’及親本棉鈴對葉位超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和丙二醛（MDA）分析Fig.3 Analysis of SOD, POD and MDA of subtending leaf of cotton boll between ‘Ji1518’ and its parents

2.6 ‘冀1518’及親本光合生理性能相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性分析

對各時期棉鈴對位葉光合生理性能相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4 所示，‘冀1518’與雙親的各項指標(biāo)間相關(guān)性及其顯著程度大致相同，Pn與Gs、Tr、SPAD、CE均呈極顯著正相關(guān)，在一定范圍內(nèi)各指標(biāo)變化一致，而與MDA、SOD、POD均呈顯著以上水平負(fù)相關(guān)，說明隨光合速率降低，葉片走向衰老，細(xì)胞保護(hù)酶開始活躍并發(fā)揮作用；Gs與Tr、SPAD、CE均呈極顯著正相關(guān)；Tr與SPAD、CE均呈極顯著正相關(guān)，與WUE呈顯著負(fù)相關(guān)；SPAD與CE呈極顯著正相關(guān)。不同的是‘冀1518’的Ci與Tr、CE顯著負(fù)相關(guān)，Ci與WUE、WUE與SOD極顯著正相關(guān)，而在親本中相關(guān)性均不顯著；‘冀1518’的SOD與POD正相關(guān)未達(dá)顯著水平，而在親本中極顯著正相關(guān)。

圖4 ‘冀1518’與雙親棉鈴對位葉光合生理性能指標(biāo)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of photosynthetic physiological properties of subtending leaf of cotton boll of ‘Ji1518’ and its parents

2.7 ‘冀1518’棉鈴對位葉光合生理性能雜種優(yōu)勢分析

‘冀1518’棉鈴對位葉光合生理性能各項指標(biāo)的雜種優(yōu)勢率和超親優(yōu)勢率統(tǒng)計表明（圖5），Pn，CE和POD在棉鈴發(fā)育的各個時期均具有較強的超親的雜種優(yōu)勢；Gs，WUE各時期為正 向 優(yōu) 勢， 且Gs在20DPA ～40DPA、WUE在10DPA ～30DPA 為 超 親 優(yōu) 勢；Ci在40DPA 前 均表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢，40DPA 是轉(zhuǎn)為超親優(yōu)勢；MDA在開花當(dāng)日表現(xiàn)為正向優(yōu)勢，之后整個時期表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢；SOD與MDA相反，在開花當(dāng)日表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢，之后各時期均表現(xiàn)為正向優(yōu)勢，并在20DPA ～30DPA 表現(xiàn)出較低的超親優(yōu)勢；Tr在10DPA 時負(fù)向優(yōu)勢，其余時期為正向優(yōu)勢；SPAD在10DPA 和30DPA 時表現(xiàn)為負(fù)向優(yōu)勢，其余時期為正向優(yōu)勢，但超親優(yōu)勢不明顯?？梢姡?518’棉鈴對位葉的雜種優(yōu)勢隨棉鈴開始就已體現(xiàn)，并隨棉鈴發(fā)育進(jìn)程推進(jìn)而更加顯著，尤其Pn，CE、POD和WUE的雜種優(yōu)勢體現(xiàn)最為明顯。

圖5 ‘冀1518’棉鈴對位葉光合生理性能的雜種優(yōu)勢分析Fig.5 Heterosis analysis of photosynthetic physiological properties of subtending leaf of cotton boll in ‘Ji1518’

2.8 棉鈴對位葉光合相關(guān)基因表達(dá)分析

本研究選取陸地棉中Rubisco 的大、小亞基各1 個基因及活化酶（Rubisco activase, RCA）基因進(jìn)行表達(dá)量測定。圖6 隨著棉鈴對位葉衰老，‘冀1518’與雙親的RbcL基因表達(dá)迅速下調(diào)，至30DPA ～40DPA 表 達(dá) 量 均 極 低，0DPA ～20DPA棉鈴對位葉各時期在‘冀1518’中表達(dá)量顯著高于雙親；‘冀1518’與雙親的RbcS基因表達(dá)量均呈緩慢下降趨勢，其中在‘冀1518’與母本中表達(dá)量僅在10DPA、40DPA 差異顯著，而在各時期與父本均差異顯著； RCA 基因在‘冀1518’和母本中先上調(diào)表達(dá)，在20DPA 達(dá)到峰值后下降，父本則呈現(xiàn)持續(xù)下調(diào)的趨勢，在‘冀1518’中的表達(dá)量在0DPA ～20DPA 未表現(xiàn)優(yōu)勢表達(dá)，在中后期30DPA ～40DPA 則超親表達(dá)。

圖6 ‘冀1518’及親本棉鈴對葉位光合相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.6 Relative expression analysis of photosynthetic genes of subtending leaf of cotton boll between ‘Ji1518’ and its parents

3 討論與結(jié)論

較大的葉片光合面積為作物高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)提供基礎(chǔ)［13］，并主要影響對產(chǎn)量貢獻(xiàn)最大的鈴數(shù)、鈴重等［27］。本研究‘冀1518’產(chǎn)量構(gòu)成各因素中平均鈴重、衣分及單株鈴數(shù)均表現(xiàn)出超親優(yōu)勢，單株鈴數(shù)＞衣分＞鈴重；‘冀1518’單株總果節(jié)數(shù)和葉面積表現(xiàn)雜種優(yōu)勢但均較父本低而顯著高于母本，說明‘冀1518’和父本均具有較強成鈴潛力；‘冀1518’在實際成鈴率和有效成鈴對位葉葉面積均表現(xiàn)了明顯的超親優(yōu)勢，并最終獲得超親優(yōu)勢的產(chǎn)量，說明提高有效果節(jié)數(shù)和有效葉面積，更有利于棉株群體產(chǎn)量發(fā)展，是棉花取得高產(chǎn)的重要因素，這與前人研究結(jié)果一致［28-29］。棉鈴對位葉是棉鈴發(fā)育的主要源器官，對棉鈴發(fā)育貢獻(xiàn)最大，其生理代謝狀況直接影響棉鈴生物量的積累［10］。本研究‘冀1518’棉鈴對位葉在主要發(fā)現(xiàn)光合指標(biāo)中表現(xiàn)出顯著雜種優(yōu)勢，具有更強的光合能力，整個時期尤其是中后期表現(xiàn)出高凈光合速率、低胞間CO2濃度、高氣孔導(dǎo)度、高羧化效率和高水分利用率。研究與Dong 等［30］的研究結(jié)果一致，高光合能力的雜交種在產(chǎn)量上較雙親常規(guī)種表現(xiàn)出優(yōu)勢。

進(jìn)一步探索高產(chǎn)雜交棉F1具有高光合能力的原因，發(fā)現(xiàn)隨棉鈴開始發(fā)育，雖然基因RbcL、RbcS隨棉鈴對位葉衰老均下調(diào)表達(dá)，但‘冀1518’中基因RbcL在各時期表達(dá)量均表現(xiàn)出超親優(yōu)勢，RbcS呈超親優(yōu)勢或正向優(yōu)勢，RCA在30DPA ～40DPA表現(xiàn)出超親優(yōu)勢。復(fù)雜的光合基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的同時，葉片激發(fā)細(xì)胞保護(hù)酶活性從而減緩細(xì)胞衰老損傷速率，‘冀1518’棉鈴對位葉SOD和POD活性自10DPA 后均表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢，尤其POD活性整個時期具有超親優(yōu)勢，有效的抑制了MDA的增長。

但與葛勇等［16］研究認(rèn)為葉綠素含量表現(xiàn)明顯的雜種優(yōu)勢以維持高效率的光合作用結(jié)果不同，本研究中‘冀1518’葉綠素含量在整個時期與雙親差異不顯著，并未表現(xiàn)或只在某些時期表現(xiàn)微弱的雜種優(yōu)勢，在‘冀1518’棉鈴光合生產(chǎn)效率顯著的雜種優(yōu)勢中未起到關(guān)鍵作用，這可能是由于‘冀1518’雙親自身葉功能均較好，雖然葉綠素與光合速率呈極顯著正相關(guān)，但這一性狀在本研究材料中所起到的雜種優(yōu)勢作用不顯著。因此，‘冀1518’在雜合基因調(diào)控下，具有較大的葉片光合面積，棉鈴對位葉通過Rubisco 和Rubisco 活化酶等光合相關(guān)基因的表達(dá)保持較高活力，使棉鈴對位葉光合能力強，同時細(xì)胞保護(hù)酶的雜種優(yōu)勢延緩葉片衰老，營養(yǎng)物質(zhì)運轉(zhuǎn)快，光合產(chǎn)物積累多，為棉鈴提供豐富的養(yǎng)分。這是‘冀1518’表現(xiàn)出產(chǎn)量雜種優(yōu)勢的主要原因。本研究為進(jìn)一步探索雜種優(yōu)勢機理提供依據(jù)，為后續(xù)利用雜種優(yōu)勢培育高產(chǎn)雜交棉品種提供參考。