廖苑辰, 王倩, 蔣小峰, 李梅,2,*

1. 南京大學環(huán)境學院,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,南京 210023

2. 南京大學環(huán)境學院,環(huán)境科學與工程國家級實驗教學示范中心,南京 210023

塑料及其制品應用廣泛,巨大消耗量及不當處置方式導致塑料廢棄物在環(huán)境中的殘留量不斷增加[1]。 大型塑料垃圾在自然條件下經(jīng)物理、化學和生物作用,逐漸分解、破碎,形成更為微小的塑料碎片或顆粒,當其粒徑＜5 mm 時被定義為微塑料(microplastics, MPs)[2-3]。 迄今為止,有關微塑料的研究大多集中在海洋環(huán)境,對土壤微塑料污染的研究相對比較匱乏[4],而陸地環(huán)境與人類接觸更為頻繁,因此土壤環(huán)境中的微塑料污染應受到更多重視[5]。 已有證據(jù)表明,土壤中也存在不同程度微塑料的檢出。Zhang 等[6]在我國東北地區(qū)農(nóng)田中檢測到微塑料的平均含量為0.27 mg·kg-1,最高含量為8.5 mg·kg-1;Fuller 和Gautam[7]的調查顯示,在澳大利亞悉尼工業(yè)區(qū)土壤中微塑料的平均豐度高達4 191 mg·kg-1。陸地環(huán)境被認為是塑料進入海洋的起源和運輸通道[8],大多數(shù)微塑料可通過地膜覆蓋、廢水灌溉、污泥堆肥、道路徑流及大氣輸入等途徑進入土壤中[4,9],并保留數(shù)十年或更長時間,對土壤理化性質產(chǎn)生不利影響[10]。

此外,微塑料具有比表面積大、疏水性強的特性,易吸附環(huán)境中的持久性有機污染物(POPs)和重金屬等污染物并與之發(fā)生相互作用,因此其復合毒性效應日益受到關注[11]。 目前,有關微塑料和重金屬復合污染對生物體的毒性效應研究較少,且多集中于水生生物。 例如,已有報道證實聚乙烯微塑料的存在可增強重金屬對鯉魚的毒性效應[12],同時暴露于聚苯乙烯微塑料和重金屬也可誘導斑馬魚產(chǎn)生氧化應激[13],對七彩神仙魚的先天免疫系統(tǒng)造成刺激[14]。 然而,聚苯乙烯微塑料和重金屬復合污染對土壤生物的毒性影響研究數(shù)據(jù)非常有限[15]。

鎘(Cd)是土壤環(huán)境中常見的毒性最強重金屬污染物之一。 據(jù)調查,我國沿海地區(qū)表層土壤中Cd的平均含量為1.21 mg·kg-1,太湖望虞河沉積物中Cd 的最大檢出量為 131.53 mg·kg-1[16]。 在我國農(nóng)田土壤環(huán)境的微塑料中,也檢出了含量范圍為0.058~0.99 mg·kg-1的Cd,表明微塑料和Cd 在自然環(huán)境中存在共暴露現(xiàn)象[17]。 目前尚不清楚土壤中重金屬對生物的毒性效應是否受微塑料的影響,土壤中微塑料和重金屬復合污染的毒性效應及機制仍不明晰,亟需相關毒理學數(shù)據(jù)的補充。

本文以模式生物赤子愛勝蚓(Eisenia fetida)為受試生物,選取應用最廣泛的塑料之一聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)和重金屬Cd 為受試材料,采用濾紙接觸法,考察PS-MPs 存在下Cd 對蚯蚓的急性致死作用。 進一步通過人工土壤法,模擬實際環(huán)境中兩者復合污染土壤對蚯蚓生長、抗氧化系統(tǒng)、消化酶活性及DNA 損傷的影響,從生長、生理和遺傳毒性角度初步探討PS-MPs 和Cd 對蚯蚓的復合毒性效應,以期為聚苯乙烯微塑料在土壤環(huán)境中的生態(tài)風險評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

赤子愛勝蚓(E.fetida)購自江蘇省句容市某蚯蚓養(yǎng)殖基地。 試驗前,將所購蚯蚓于清潔土壤中預培養(yǎng)3 ~7 d,挑選具有明顯生殖環(huán)帶、體質量500 ~600 mg 的健康成蚓進行試驗。

聚苯乙烯熒光微球(PS-MPs)購自中國天津市倍思樂色譜技術開發(fā)中心,將原液(10 mg·mL-1)超聲處理 10 min 后,取 10 μL 微塑料原液于 10 mL 超純水中,稀釋1 000 倍,采用透射電子顯微鏡(TEM,Jeol2100F,日本Jeol 公司)和動態(tài)光散射激光粒度儀(DLS,Zetasizer Nano-S,英國 Malvern 公司)進行形貌表征。 結果顯示,試驗所用PS-MPs 呈球狀,平均粒徑為(5.04±0.02) μm,溶液體系分散效果良好(圖1)。

圖1 聚苯乙烯塑料微球(PS-MPs)形貌(a)及粒徑強度分布(b)Fig.1 Transition electron microscopy (TEM) image (a) and dynamic light scattering (DLS) result (b) of polystyrene microplastics (PS-MPs)

無水氯化鎘(CdCl2)(CAS No. 10108-64-2),純度≥99.0%,購自中國上海安譜試驗科技股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 濾紙接觸法

參照OECD Guideline No.207 標準濾紙接觸法研究Cd 單一及與PS-MPs 復合暴露對蚯蚓的急性致死作用,以探討PS-MPs 的存在對Cd 引起蚯蚓死亡率的影響。 根據(jù)預試驗結果,確定正式試驗中Cd2+濃度為 0、6.51、9.77、14.33、21.98 和 31.28 μg·cm-2;PS-MPs 暴露水平為 0、8×10-3、1.6×10-1μg·cm-2。 濾紙法試驗采用平底玻璃管進行,取若干長8 cm,直徑3 cm 的平底玻璃管,管內壁平鋪濾紙,濾紙大小剛好覆蓋玻璃管內壁且不重疊。 用移液器依次吸取0.5 mL Cd 溶液和0.5 mL PS-MPs 溶液至玻璃管中,放入37 ℃烘箱烘干,使受試物在濾紙上均勻沉淀。 對照組用1 mL 超純水做相同處理。 之后,用移液槍移取1 mL 超純水于玻璃管中,確保內襯濾紙足夠濕潤,以便蚯蚓生存。 每管放置1 條蚯蚓,以避免同一管內蚯蚓的死亡對其他蚯蚓產(chǎn)生的可能影響,然后置于溫度(20±1) ℃,濕度80%的恒溫恒濕箱中避光培養(yǎng)48 h。 同時設不含Cd、PS-MPs 的蒸餾水處理為對照組,每個處理組設置10個重復。

1.2.2 人工土壤法

采用人工土壤標準暴露法(OECD Guideline No.207)研究PS-MPs 和Cd 復合污染土壤對蚯蚓的毒性效應。 復合毒性試驗的劑量參照先前已有研究[18-19],同時基于濾紙接觸法試驗的結果進行設定(表1)。 將赤子愛勝蚓暴露于含Cd 和 PS-MPs 的人工土壤中,Cd 和PS-MPs 各設置高和低2個染毒劑量組,其中,低劑量(Cd 1 mg·kg-1,PS-MPs 0.5 mg·kg-1)接近環(huán)境實測值,高劑量(Cd 130 mg·kg-1,PSMPs 10 mg·kg-1)用以模擬高污染區(qū)域。 人工土壤配制參照OECD 207 試驗準則,并在此基礎上加以改進。 稱取350 g 石英砂,50 g 牛糞和100 g 高嶺土于培養(yǎng)缸中,混勻后加入175 mL 經(jīng)蒸餾水稀釋的不同含量受試物溶液,在實驗室條件下穩(wěn)定7 d 后,每缸放置10 條經(jīng)清潔人工土壤馴化24 h 的蚯蚓,于恒溫恒濕箱中避光培養(yǎng)14 d,培養(yǎng)條件同前,每7 d 向土壤表面均勻加入2 g 牛糞作為養(yǎng)料。 同時設置不含Cd、PS-MPs 的清潔人工土壤為對照組,每個處理組設置4個重復。

表1 實驗設計(人工土壤法)Table 1 Design of experiment (artificial soil test)

1.3 毒理學指標測定

1.3.1 死亡率

分別于濾紙接觸法暴露24 h 和48 h 后,記錄每個處理組蚯蚓的死亡數(shù)量,并計算死亡率。 若蚯蚓前尾部對輕微針扎無反應,則視為死亡。

1.3.2 體質量變化率

在人工土壤法第0 天和第14 天將蚯蚓從不同處理組培養(yǎng)缸中取出,清洗并用濾紙吸去表面水分后稱量,按下式計算體質量變化率:

體質量變化率=(Wt-W0)/W0×100%

式中:Wt為第14 天蚯蚓的平均體質量(mg),W0為第0 天蚯蚓的平均體質量(mg)。

1.3.3 酶活性及可溶蛋白含量測定

人工土壤法第14 天將蚯蚓從土壤中取出,每組3 條,于濕潤濾紙上清腸24 h。 稱取蚯蚓樣品組織,按質量(g)∶體積(mL)=1∶4 的比例加入 4 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件下制成勻漿,3 000 r·min-1離心10 min 后,取上清液,一部分直接用于測定丙二醛(MDA,A003-1-1)含量,另一部分分別稀釋成0.5%、5%和10%(V∶V)的蚯蚓組織勻漿,各用于蛋白含量(A045-4-2)、過氧化氫酶(CAT,A007-1-1)和堿性磷酸酶(AKP,A059-2-2)活性的測定。 另取蚯蚓樣品組織若干,在冰水浴條件下將其以質量(g)與纖維素酶緩沖液(mL)為 1 ∶9 的比例制成勻漿,4 000 r·min-1離心 10 min,取上清液,稀釋成 10%(V∶V)蚯蚓組織勻漿,進行纖維素酶活性(A138-1-1)測定。 試驗用試劑盒及測定方法均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.4 DNA 損傷檢測

人工土壤法培養(yǎng)14 d 后,取出蚯蚓,每組3 條,濕潤濾紙清腸24 h 后,依據(jù)Eyambe 等[20]的方法提取蚯蚓體腔細胞,彗星試驗參考Singh 等[21]方法。蚯蚓體腔細胞經(jīng)制片-裂解-解旋-電泳-中和-染色后,將染色后的載玻片置于熒光顯微鏡(BX41,日本奧林巴斯公司)下,用明美顯微數(shù)碼測量分析系統(tǒng)軟件觀察蚯蚓體腔細胞熒光圖像,并拍照儲存。 圖像用CASP 彗星分析軟件逐一進行分析,選取彗星尾部DNA 百分比(tail DNA%)、彗星尾長(tail length,TL)和 Olive 尾矩(Olive tail moment,OTM)作為 DNA損傷的指標,每張片子分析50個細胞。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2013 和SPSS 20 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行Probit 回歸分析和相關性分析,計算半數(shù)致死劑量(lethal dose 50%, LD50),彗星試驗3 項指標所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 20 進行Mann-Whitney U(二樣本)檢驗。 利用方差分析(ANOVA)方法,在 0.05、0.01 和0.001 的顯著性水平下進行顯著性分析。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 濾紙法測定Cd 單一及與PS-MPs 復合暴露對蚯蚓死亡率的影響

不同濃度Cd 及其與PS-MPs 復合暴露條件下赤子愛勝蚓的死亡率如圖2 所示。 無論PS-MPs 存在與否,蚯蚓的死亡率均隨著Cd 濃度增加呈梯度上升趨勢。 當 Cd 濃度為 31.28 μg·cm-2時,Cd 單一暴露及與0.008 μg·cm-2PS-MPs 復合暴露條件下,赤子愛勝蚓的48 h 死亡率均達100%。

圖2 Cd 及其與PS-MPs 復合暴露24 h (a)和48 h (b)后赤子愛勝蚓的急性致死率(濾紙法)Fig.2 The motility of E. fetida treated with Cd and Cd+PS-MPs after 24 h (a) and 48 h (b) exposure time (filter paper method test)

以Cd 濃度對數(shù)作為橫坐標,將蚯蚓死亡率進行概率變換作為縱坐標,通過線性擬合得到線性回歸方程(表 2)。 Cd 單一暴露時,蚯蚓 24 h 和 48 h 的LD50分別為 22.09 μg·cm-2和 13.55 μg·cm-2,即1 380.7 mg·L-1和 843.75 mg·L-1。 其中,24 h-LD50與Neuhauser 等[22]、吳聲敢等[23]的研究結果一致,但48 h 急性毒性結果較已有研究結果稍低,這可能是由于赤子愛勝蚓個體差異及處理劑量的不同造成的。

表2 Cd 及其與PS-MPs 復合暴露對赤子愛勝蚓的急性毒性效應回歸分析Table 2 The regression analysis of the acute toxic effects of Cd and Cd+PS-MPs on E. fetida

當 PS-MPs 濃度為 0.008 μg·cm-2(即 0.5 mg·L-1)時,蚯蚓 24 h 和 48 h 的 LD50分別為 21.96 μg·cm-2和 14.44 μg·cm-2;當 PS-MPs 濃度為 0.160 μg·cm-2(即 10.0 mg·L-1)時,蚯蚓的 24 h-LD50和 48 h-LD50分別為 21.75 μg·cm-2和 16.43 μg·cm-2。 由實驗結果可知,Cd 單一及其與PS-MPs 復合暴露對蚯蚓的24 h-LD50無明顯差異;48 h 作用下,Cd 與0.160 μg·cm-2PS-MPs 復合暴露對蚯蚓的 LD50最大,Cd 單一暴露對蚯蚓的LD50最小。 LD50數(shù)值越小,表示急性毒性效應越強。 Davarpanah 和 Guilhermino[24]研究發(fā)現(xiàn),微塑料與銅的結合可以減輕重金屬對微藻(Tetraselmis chuii)的毒性。 有證據(jù)表明,微塑料顆粒易于吸附包括Cd2+在內的金屬陽離子[25],因此在本研究中,PS-MPs 可能在溶液中吸附重金屬,導致Cd 在濾紙上的沉積量減少,降低了Cd的生物利用度,從而減輕其對蚯蚓的毒害作用[26]。即PS-MPs 的存在一定程度上降低了Cd 對蚯蚓的濾紙法急性毒性。

2.2 人工土壤法

2.2.1 Cd 與PS-MPs 復合污染對蚯蚓體質量的影響

Cd 與PS-MPs 復合污染對赤子愛勝蚓體質量的影響如圖3 所示。 暴露14 d 后,各處理組蚯蚓體質量增長率與對照組相比均顯著降低(P＜0.05),為對照組的69.15% ~74.93%,表明 Cd 與 PS-MPs 復合暴露對蚯蚓的生長速率具有一定抑制作用,與先前研究結果類似。 有報道表明,土壤中的高含量Cd(250 ~500 μg·g-1)可降低蚯蚓生長速率,導致體質量減輕[27]。 Cao 等[28]研究了赤子愛勝蚓對土壤聚苯乙烯微塑料暴露的適應性,結果表明,高含量(1%和2%)(m/m)PS-MPs 暴露下蚯蚓生長受抑,死亡率增加。 Zhou 等[15]研究發(fā)現(xiàn),聚丙烯微塑料(300 ~9 000 mg·kg-1)與 Cd(8 mg·kg-1)復合暴露使赤子愛勝蚓的生長速率降低,且Cd 的存在加劇了聚丙烯微塑料對蚯蚓生長的負面影響,其中,較高含量(＞3 000 mg·kg-1)聚丙烯微塑料對蚯蚓腸道造成的磨損和堵塞可能是蚯蚓體質量減輕的直接原因,這與我們的研究結果略有不同。 在本試驗中,不同處理組之間的體質量增長率無明顯差異,結果的不同可能與土壤成分、微塑料種類以及暴露濃度有關,這也說明了土壤環(huán)境中微塑料和重金屬相互作用的復雜性。

圖3 Cd 和PS-MPs 復合污染對赤子愛勝蚓體質量變化的影響注:CK 表示對照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs; *表示與 CK 相比有顯著差異,P＜0.05。Fig.3 Changes of growth rate of E. fetida treated with PS-MPs and CdNote: CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs; *indicates a significant difference compared with CK, P＜0.05.

2.2.2 Cd 與PS-MPs 復合污染對蚯蚓體內抗氧化系統(tǒng)的影響

CAT 是抵御活性氧傷害的典型酶類,可以清除逆境過程中活性氧轉化產(chǎn)生的H2O2,緩解其對細胞的毒害[29]。 由圖4(a)可知,不同處理組蚯蚓體內CAT 活性均顯著低于對照組(P＜0.05)。 其中,CAT活性在 130 mg·kg-1Cd 與 10 mg·kg-1PS-MPs 復合暴露時僅為對照組的29.39%。 比較同含量Cd 與不同含量PS-MPs 組合的實驗結果可知,相同暴露時間下,PS-MPs 含量高的處理組,CAT 活性較低。 當PS-MPs 含量為 10 mg·kg-1時,隨 Cd 含量升高,CAT活性呈下降趨勢,表明 CAT 活性與 Cd 含量以及PS-MPs 含量均呈一定劑量效應關系。 Wen 等[14]的研究也有類似結果,Cd 與PS-MPs 聯(lián)合暴露七彩神仙魚(Symphysodon aequifasciatus)時,CAT 活性受MPs、Cd 這2 種壓力源及其相互作用影響,且聯(lián)合暴露組較對照組有所下降,CAT 活性受到抑制。 較對照而言,處理組的CAT 活性值整體呈下降趨勢,即活性受到抑制,說明在Cd 與PS-MPs 復合暴露條件下,機體受到氧化脅迫作用,自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡被破壞,CAT 分解H2O2的速度低于其產(chǎn)生速度,使得CAT 消耗殆盡,酶活性降低,而CAT活性的抑制將導致H2O2的累積,可能對蚯蚓造成過氧化損傷[30]。

圖4 Cd 和PS-MPs 復合污染對赤子愛勝蚓過氧化氫酶(CAT)活性(a)和丙二醛(MDA)含量(b)的影響注:CK 表示對照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;與 CK 相比有顯著差異,*表示 P＜0.05,**表示 P＜0.01,***表示 P＜0.001。Fig.4 Changes of catalase (CAT) activity (a) and malondialdehyde (MDA) content (b) in E. fetida treated with PS-MPs and CdNote: CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;a significant difference compared with CK, *represents P＜0.05, **represents P＜0.01, ***represents P＜0.001.

當蚯蚓受到外界脅迫打破抗氧化防御系統(tǒng)與體內活性氧之間動態(tài)平衡時,過量的超氧陰離子會與細胞中重要大分子結合,造成脂質過氧化、DNA 損傷等。 MDA 是自由基引發(fā)的脂質過氧化產(chǎn)物,可指示蚯蚓受到的氧化損傷,含量越高,表明損傷越大[31]。 在本研究中,Cd 與PS-MPs 復合暴露14 d 后,各處理組 MDA 含量均顯著高于對照組(P＜0.01)(圖 4(b)),分別為對照組的 2.21 倍、2.46 倍、4.74倍和1.89 倍,說明蚯蚓受到氧化損傷。 Panzarino等[32]研究了Cd 單一脅迫下蚯蚓(Eisenia andrei)各生物標志物的響應,發(fā)現(xiàn)100 μg·g-1Cd 顯著誘導蚯蚓體內MDA 含量的上升,抑制CAT 活性。 也有研究證實,聚苯乙烯微塑料暴露可以誘導赤子愛勝蚓體內活性氧水平的升高和抗氧化酶活性的降低,對蚯蚓產(chǎn)生氧化損傷[33],與本研究結果一致。 在本試驗中,Cd 與PS-MPs 復合作用誘導蚯蚓脂質過氧化反應,產(chǎn)生了氧化損傷,對機體產(chǎn)生一定損害,表明在Cd 與PS-MPs 復合作用下,蚯蚓抗氧化系統(tǒng)受到一定程度的損傷。

2.2.3 Cd 與PS-MPs 復合污染對蚯蚓體內消化酶活性的影響

AKP 是一種普遍存在的膜結合金屬酶,在細胞生長、細胞凋亡、細胞遷移和蛋白質磷酸化等生理過程中必不可少[34]。 其活性也可以反映蚯蚓的代謝效率及消化能力[35]。 由圖5(a)可知,不同處理組的AKP 活性與體質量變化結果相類似,均較對照組低(圖3),但二者變化趨勢仍存在一定差異,其可能原因為生物量變化聯(lián)系著化學脅迫、化學效應與能量變化等多種因素,是機體在個體水平的綜合響應[36]。其中,130 mg·kg-1Cd 與 0.5 mg·kg-1PS-MPs 復合暴露對蚯蚓體內AKP 活性呈顯著抑制(P＜0.01),酶活性僅為對照組的29.90%。 這與Banaee 等[12]的研究結果一致,該研究在暴露于高濃度Cd 和MPs 的鯉魚(Cyprinus carpio)中發(fā)現(xiàn)AKP 活性顯著下降。AKP 活性的降低一方面可能與機體的Cd 吸收有關,AKP 活性中心含有金屬離子鋅(Zn),Cd 的存在能打亂其現(xiàn)有構象,從而特異性抑制AKP 活性[37];另一方面,微塑料的加入也能阻礙機體消化能力,降低物質代謝水平,導致AKP 活性降低[38]。

纖維素酶是蚯蚓體內主要的消化酶,其活性變化可以指示蚯蚓生命活動狀況,直接反映蚯蚓分解土壤有機質的能力[39]。 纖維素酶活性測定結果顯示,除 1 mg·kg-1Cd 與 0.5 mg·kg-1PS-MPs 復合暴露組外,其余各處理組纖維素酶活性均顯著高于對照組(P＜0.01)(圖 5(b)),說明土壤中 Cd 與 PS-MPs 復合暴露對蚯蚓體內纖維素酶活性起一定激活作用。由圖 4(b)可知,1 mg·kg-1Cd 與 10 mg·kg-1PS-MPs復合脅迫下,蚯蚓體內MDA 含量最高,說明此時蚯蚓體內污染物代謝產(chǎn)物積累值最大,因此纖維素酶活性升高,以清除體內產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。

圖5 Cd 和PS-MPs 復合暴露對赤子愛勝蚓堿性磷酸酶(AKP)活性(a)和纖維素酶活性(b)的影響注:CK 表示對照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;與 CK 相比有顯著差異,*表示 P＜0.05,**表示 P＜0.01。Fig.5 Changes of alkaline phosphatase (AKP) (a) and cellulase activities (b) in E. fetida treated with PS-MPs and CdNote: CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs; a significant difference compared with CK, *represents P＜0.05, **represents P＜0.01.

張薇等[40]研究發(fā)現(xiàn),不同含量(0.1 ~4 mg·kg-1)恩諾沙星和200 mg·kg-1銅復合污染14 d 顯著抑制赤子愛勝蚓AKP 活性,誘導纖維素酶活性上升;類似地,Shi 等[35]研究了菲暴露14 d 對赤子愛勝蚓消化酶活性的影響,結果顯示,蚯蚓的纖維素酶活性增加,而AKP 活性受到抑制,與本研究結果相一致。誘導的纖維素酶活性表明蚯蚓在一定含量下對Cd與PS-MPs 復合暴露可能表現(xiàn)出興奮效應,增強生理功能以抵抗氧化應激[41-42]。

2.2.4 Cd 與PS-MPs 復合暴露對蚯蚓體腔細胞的DNA 損傷

彗星試驗是一種能快速地在單細胞水平上檢測DNA 損傷的測試方法[43]。 在本研究中,與對照組相比,Cd 與 PS-MPs 不同含量處理組均能引起 tail DNA% 、TL 和 OTM 這 3 項指標顯著增加(圖 6),暗示蚯蚓體腔細胞DNA 受損。 根據(jù)彗星損傷程度等級分析DNA 損傷情況,可知Cd 與PS-MPs 復合污染對蚯蚓DNA 造成輕中度損傷,其中,1 mg·kg-1Cd 與0.5 mg·kg-1PS-MPs 復合暴露組的受損程度最高(表3),說明二者復合暴露對蚯蚓具有潛在的遺傳毒性效應。 已有研究證實PS-MPs 或Cd 單獨暴露可引起赤子愛勝蚓體腔細胞的DNA 損傷[33,44],且隨暴露濃度的增大,損傷加劇。 DNA 損傷可能與污染脅迫引起的氧化應激有關[45],有害環(huán)境的刺激誘導蚯蚓體內活性氧自由基的產(chǎn)生[32],DNA 受自由基攻擊易受到破壞,從而導致單鏈或雙鏈斷裂[46]。Wang 等[30]的研究也表明,外界脅迫下過量活性氧(ROS)的生成,最終可導致赤子愛勝蚓膜脂過氧化和DNA 損傷。 推測在本試驗中,Cd 與 PS-MPs 復合暴露也可能通過氧化脅迫引起蚯蚓DNA 一定程度的損傷。

表3 PS-MPs 和Cd 對赤子愛勝蚓DNA 損傷程度等級表Table 3 The degree of DNA damage in E. fetida after exposed to PS-MPs and Cd

圖6 Cd 和PS-MPs 復合暴露對蚯蚓體腔細胞DNA 損傷注:(a) 彗尾長度,(b) Olive 尾矩,(c) 彗尾DNA 含量;CK 表示對照,1 表示 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 表示1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 表示 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 表示 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;與CK 相比有顯著差異,***表示P＜0.001。Fig.6 Effects of co-exposure of PS-MPs and Cd on DNA damage in E. fetidaNote: (a) Tail length (TL), (b) Oliver tail moment (OTM), (c) Tail DNA%; CK represents the control,1 represents 1 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,2 represents 1 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs,3 represents 130 mg·kg-1 Cd+0.5 mg·kg-1 PS-MPs,4 represents 130 mg·kg-1 Cd+10 mg·kg-1 PS-MPs;a significant difference compared with CK, ***represents P＜0.001.

總的來說,本研究采用濾紙法試驗,比較了Cd單一及其與PS-MPs 復合暴露下蚯蚓存活率的變化情況。 再依據(jù)濾紙法結果,開展人工土壤法試驗,初步證實了土壤環(huán)境中PS-MPs 和Cd 復合污染對蚯蚓的生長、生理代謝及DNA 損傷的不利影響,這些不利影響可能通過食物鏈干擾土壤生態(tài)系統(tǒng)正常的生態(tài)功能,表現(xiàn)出的生態(tài)毒理效應需引起足夠重視。但本研究僅初步探索了微塑料和重金屬在土壤環(huán)境中共存時對土壤生物的毒性效應,其復合毒性效應具有復雜性,機制尚不明晰。 未來還需結合環(huán)境濃度微塑料對土壤生物的單一毒性、微塑料及其復合污染物在土壤環(huán)境中的相互作用展開深入研究。