劉曉薇 , 方芳, 李蘭蘭, 鄧呈遜, 胡淑恒, 俞志敏

1. 合肥學院生物食品與環(huán)境學院,合肥 230601

2. 合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院,合肥 230009

3. 安徽省生物質(中德)國際聯(lián)合研究中心,合肥 230601

近年來,大量的塑料碎片通過直接或間接的方式進入水環(huán)境,成為最常見的海洋垃圾[1-2]。 塑料廢棄物在自然環(huán)境中存留時間長,通過物理、化學和生物降解等方式裂解為更小的碎片[3-4],一般把粒徑＜5 mm 的塑料碎片定義為微塑料[5]。 微塑料廣泛存在于海洋、河流和湖泊等各類環(huán)境介質和生物體中[6-7],因其尺寸小、比表面積大、疏水性高等表面特性,微生物更容易粘附定殖在其表面進而形成異質性結構組成的生物膜,被稱之為“塑料圈(plastisphere)”[1,8]。 相比于其他天然基體和周圍水環(huán)境,微塑料生物膜具有特異性的結構和生物群落組成[1,9-10],并且更易成為一些病原菌的聚集地[11-12],從而可能會影響抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在微塑料生物膜上的賦存和動態(tài)演化特征。 由于微塑料在水環(huán)境中大量存在且具有時間尺度的持久性、空間尺度高傳輸性[13],還可通過食物鏈在生態(tài)圈中傳遞[14],其攜帶ARGs 的擴散傳播作用不容忽視,會對整個水生態(tài)圈安全甚至人類健康造成潛在威脅。

已有研究表明,河流、河口和海洋環(huán)境中的微塑料會對 ARGs 選擇性富集,成為 ARGs 的庫[15-17]。基體上生物膜的形成除了受基體特性的影響外,還取決于時間演替[18]。 因此,探究微塑料上ARGs 時間序列動態(tài)變化特征,對了解微塑料對ARGs 傳播擴散的影響具有重要意義。 已有研究表明,聚乙烯(polyethylene, PE)微塑料生物膜上ARGs 和可移動元件具有時間動態(tài)演化特征,病原菌富集、可移動元件持久性以及對抗生素的耐受性是使得微塑料上ARGs 傳播擴散風險增加的主要因素[19]。 抗生素的選擇壓力作用顯著影響著ARGs 的傳播[20-21],在抗生素脅迫下,PE 生物膜對ARGs 和Ⅰ類整合子整合酶基因(intI1)具有明顯的選擇富集作用[15],其中intI1 常被用作ARGs 在環(huán)境中水平轉移的重要標記物[22]。 然而,抗生素脅迫濃度以及微塑料種類對其生物膜上ARGs 時間動態(tài)演化特征的影響目前尚不清楚。

本研究選擇實際水環(huán)境中2 種常檢出的微塑料PE 和聚苯乙烯(polystyrene, PS)[6-7],構建水-沉積物-微塑料微反應體系模擬實際水環(huán)境特征,研究不同濃度抗生素脅迫下,不同種類微塑料生物膜上ARGs、intI1 和微生物群落的時間序列動態(tài)變化特征及其關聯(lián)性;探究不同微塑料生物膜上ARGs 差異性響應機制,進一步明確微塑料對ARGs 傳播擴散的影響,對有效遏制微塑料引起的ARGs 傳播風險具有重要科學意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗設計

采集巢湖0 ~5 cm 表層沉積物和上覆水樣,分別過 2 mm 篩和 20 ~25 μm 膜(Grade 4, Whatman,UK)去除大的顆粒物和浮游生物。 根據(jù)OECD 308指南,取80 g 沉積物和250 mL 水樣在1 L 的錐形瓶中構建水-沉積物體系。 10 g 滅菌PE 顆粒(粒徑為 3 ~4 mm,密度為 0.95 g·cm-3)、10 g 滅菌 PS 顆粒(粒徑為3 ~4 mm,密度為1.05 g·cm-3)分別添加到水-沉積物體系(圖1)。 水樣中添加礦物營養(yǎng)(包含礦物鹽、微量元素和生長因子)促進微生物增殖,礦物營養(yǎng)組分參照OECD 301 指南。 添加Na2CO3維持體系中pH 值在6.8 ~7.2 之間,用透氣隔菌膜封住瓶口。 所有反應體系置于22 ℃、恒溫振蕩培養(yǎng)箱90 r·min-1培養(yǎng)一周以達到穩(wěn)定狀態(tài)。 磺胺類抗生素磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole, SMX)在我國地表水環(huán)境中具有較高的檢出率和濃度水平[23],并常被用作抗生素脅迫作用研究中的代表性抗生素[24]。 選取EUCAST 數(shù)據(jù)庫中SMX 的觀察最低最小抑制濃度 1 000 μg·L-1作為高脅迫水平[25],并以 1/10 倍和1/100 倍濃度 SMX 作為中(100 μg·L-1)和低(10 μg·L-1)脅迫水平,對反應體系進行抗生素脅迫。 設置無抗生素脅迫的控制對照組(CK)。 每組均設3個平行實驗組。 在第0 天(SMX 添加前),添加 SMX 后第15 天、第 30 天、第45 天和第 60 天取等量微塑料,并提取微塑料生物膜DNA,在-80 ℃保存用于進一步分析。 每次取微塑料前測定水相中SMX 濃度,向系統(tǒng)中補充一定量SMX 至初始設定濃度。

圖1 磺胺甲惡唑(SMX)對聚乙烯(PE)和聚苯乙烯(PS)微塑料生物膜抗生素抗性基因(ARGs)的影響Fig.1 The effect of sulfamethoxazole (SMX) on antibiotic resistance genes (ARGs) in polyethylene (PE)and polystyrene (PS) microplastic biofilms

1.2 生物膜分離和DNA 提取

在超凈工作臺中,用＜3 mm 的滅菌漏網(wǎng)取2.5 g微塑料置于無菌燒杯中,用0.9%無菌NaCl 溶液輕輕沖洗微塑料顆粒,在50 mL 50 mmol·L-1無菌焦磷酸緩沖液(Na4P2O7-Tween80, 0.05%)中渦旋2 min[26],分離并收集菌落生物膜,重復2 次,混勻后過0.22 μm 微孔濾膜。 所有濾膜置于凍存管,快速液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱待用。 用 FastDNA?SPIN 土壤基因組DNA 試劑盒提取微塑料生物膜中的總DNA,保存于-80 ℃冰箱。 超微量分光光度計(NanoDrop One, ThermoFisher)測定 DNA 的 OD260/OD280 值在 1.8 ~2.0 之間。

1.3 ARGs 分析

利用實時熒光定量 PCR (LightCycler?96,Roche)對 3 種磺胺類抗性基因(sul1、sul2 和sul3)、16S rRNA、intI1 基因進行定量分析。 以目標基因質粒的梯度稀釋溶液作為模板DNA 進行qPCR 擴增,擴增體系共20 μL,包括2×SGExcel FastSYBR Mixture 10 μL,上、下引物(10 μmol·L-1)各 0.4 μL,模板DNA 1 μL,滅菌 ddH2O 補充至 20 μL。 引物和qPCR 擴增信息如表 1 所示。 按照 LightCycler?96熒光定量PCR 儀默認程序進行熔點曲線分析,驗證特異性擴增。 各目的基因的qPCR 標準曲線擴增效率為84% ~110%,R2＞0.99。 利用超微量分光光度計測得的質粒DNA 濃度,通過標準曲線即可得出目的基因的絕對豐度。 目標基因的相對豐度通過16S rRNA 進行歸一化。

表1 目標基因的qPCR 引物序列和退火溫度Table 1 qPCR analysis primers and annealing temperature for target genes

1.4 16S rRNA 擴增子測序和數(shù)據(jù)處理

基于上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina MiSeq 平臺(Illumina, San Diego, USA)對 CK 和SMX 脅迫第60 天PE 和PS 生物膜樣品的細菌群落16S rRNA 進行測序。 首先利用熱循環(huán) PCR 系統(tǒng)(GeneAmp 9700, ABI, USA),采用引物 338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’) 和 806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 對 細 菌 16S rRNA 基因的V3-V4 高變異區(qū)進行Miseq 擴增子測序。 對MiSeq 測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù),進行拼接、質控過濾、去接頭等得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。 基于優(yōu)化數(shù)據(jù)按照97%相似性對非重復序列進OTU 聚類(版本7.1,http://drive5.com/uparse/)。 比對 Silva 數(shù)據(jù)庫,采用RDP 分類器貝葉斯算法(http://rdp.cme.msu.edu/)對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析。

1.5 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件(IBM, USA)對目標基因進行顯著性檢驗及相關性分析。 針對符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù),顯著性檢驗采用獨立樣本t檢驗和單因素方差分析;非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Wilcox 秩和檢驗組間非參數(shù)檢驗法。 基于Bray-Curtis 距離算法采用主坐標分析(PCoA)法分析不同微塑料在OTU水平上的細菌群落結構差異性,并利用相似性分析(ANOSIM)[31]對差異性進行檢驗(999 次置換)。 利用R vegan 包進行 PCoA 和 ANOSIM 分析。 利用 R Hmisc 包對ARGs、intI1 及抗性基因細菌宿主進行Spearman 秩相關性分析,并通過Gephi 平臺(V0.9.1)對相關分析結果進行網(wǎng)絡可視化分析。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 抗生素脅迫下不同微塑料生物膜上ARGs 和intI1 分布特征

PS 與PE 生物膜中所有樣品中除sul3 外,sul1、sul2 和intI1 基因均被檢出。 在 CK 組和 SMX 選擇壓力下,PS 與 PE 生物膜中sul1、sul2 和intI1 基因相對豐度均無顯著差異(t檢驗,P＞0.05)(圖2(a)和圖2(b))。 此外,有研究也表明長江口5 種不同微塑料上ARGs 豐度總體上無顯著性差異[17]。 可見,不同的微塑料上ARGs 豐度可能不具有顯著差異。 由于目標微塑料種類和基因有限,需采用高通量qPCR 等技術手段進一步分析更多的微塑料上ARGs 豐度水平,以確定微塑料生物膜上ARGs 是否存在差異性分布特征。

在SMX 的選擇壓力作用下,PE 和PS 生物膜上sul1、sul2 和intI1 基因總豐度顯著高于無抗生素選擇的 CK 組(t檢驗,PE 生物膜:P＜0.05;PS 生物膜:P＜0.01)(圖 2(a)和圖 2(b))。 可見,抗生素的脅迫作用會進一步增加微塑料上ARGs 豐度水平。 此外,微塑料生物膜中sul1 與intI1 之間存在顯著相關性(PE 生物膜:r=0.78,P＜0.05;PS 生物膜:r=0.88,P＜0.05),研究證實sul1 基因位于intI1 的保守片段上[32],因此在微塑料生物膜上intI1 豐度增加是促進ARGs 擴散的關鍵因素之一。

不同濃度的抗生素脅迫會對ARGs 擴散產(chǎn)生差異性影響[33]。 對不同濃度 SMX 脅迫下,微塑料生物膜上磺胺類抗性基因(sul)和intI1 基因相對豐度進行比較(圖 2(c)和圖 2(d))。 在低濃度(10 μg·L-1)和中等濃度(100 μg·L-1)SMX 脅迫下,sul和intI1基因豐度未產(chǎn)生顯著性差異(單因素方差分析,P＞0.05),高濃度(1 000 μg·L-1)SMX 脅迫使得基因相對豐度顯著增加(單因素方差分析,P＜0.05),其原因可能是由于與低濃度脅迫相比,1 000 μg·L-1SMX脅迫下ARGs 接合轉移頻率更高[34],且亞抑制濃度抗生素脅迫也會增加抗性突變概率[35]。 此外,有研究表明受高濃度SMX 脅迫的活性污泥反應器中ARGs 豐度也會明顯增加[36]。 PE 和 PS 生物膜上sul和intI1 基因總體的相對豐度在時間序列上均無顯著變化(單因素方差分析,P＞0.05)。 然而,高濃度SMX(1 000 μg·L-1)脅迫下明顯增加了sul和intI1基因相對豐度,且隨著時間變化具有顯著性差異,在脅迫15 d 后增速開始明顯下降;中濃度SMX 脅迫下sul基因隨時間增加無顯著變化;低濃度脅迫下sul和intI1 基因相對豐度在第60 天顯著增加。 高濃度抗生素脅迫下微塑料上ARGs 豐度增速明顯降低的主要原因可能是由于微塑料生物膜逐漸形成并成熟,會對抗生素產(chǎn)生耐受[37],從而降低對ARGs 的選擇壓力作用。 此外,長時間高濃度SMX 脅迫會改變微生物群落結構,同時也可能抑制微塑料上ARGs 潛在宿主菌的生長[38]。 然而,低濃度 SMX 會逐漸在微塑料生物膜表面積累產(chǎn)生選擇壓力作用,隨著時間演化進一步促進ARGs 傳播。

圖2 intI1 和ARGs 在PE 和PS 生物膜上相對豐度(log10 轉換值)的比較(a)~(b)與不同濃度抗生素脅迫下PE 與PS 生物膜上ARGs 和intI1 的時間序列變化特征和比較(c)~(d)注:CK、S10、S100、S1000 分別表示 0、10、100 和 1 000 μg·L-1的 SMX 濃度;d15、d30、d45 和 d60 表示采樣時間在第 15 天、第 30 天、第45 天和第60 天;圖中不同字母表示不同選擇壓力下intI1 和ARGs 具有顯著性差異;*P＜0.05,**P＜0.01。Fig.2 Comparisons of the relative abundance (log10 conversion value) of intI1 and ARGs in PE and PS biofilms (a)~(b), and the time series changes and comparisons of ARGs and intI1 in PE and PS biofilms under antibiotic stress at different concentrations (c)~(d)Note: CK, S10, S100 and S1000 indicate the concentrations of SMX at 0,10,100, and 1 000 μg·L-1, respectively; d15, d30, d45, and d60 indicate the sampling time at day 15, day 30, day 45, and day 60, respectively; different letters indicate significant differences between intI1 and ARGs under different selection pressures and among time series changes; *P＜0.05 and **P＜0.01.

2.2 不同微塑料生物膜細菌群落的差異性

PE 和PS 微塑料生物膜上的OTU 總數(shù)分別為4 384個和5 369個,可見PS 微塑料細菌群落的物種較豐富。 對 PE、PS 生物膜細菌群落進行 Alpha多樣性分析(表2),Coverage 值＞98%,說明測序結果完整、可信度高。 PS 生物膜的 Sobs、ACE 和 Chao指數(shù)都顯著高于PE 生物膜(P＜0.01),表明PS 生物膜上細菌群落豐富度較高。 PS 的Shannon 指數(shù)較高且Simpson 指數(shù)較小,表明PS 生物膜具有較高的均勻度,但2 種微塑料生物膜細菌群落均勻度無顯著差異(P＞0.05)。 整體而言,PE 和 PS 生物膜細菌群落的多樣性存在一定的差異性。

表2 PE 和PS 微塑料生物膜上Alpha 多樣性比較Table 2 Comparisons of Alpha diversity in PE and PS microplastic biofilms

變形菌(Proteobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)和放線菌(Actinobacteria)在2 種微塑料生物膜上占主導,與長江口實際水環(huán)境中微塑料上細菌門種類較一致[9]。 PCoA 分析和 ANOSIM 顯著性檢驗顯示PE 和PS 生物膜細菌群落結構存在顯著差異(R=0.423,P＜0.01)(圖 3(a))。 不同濃度 SMX 脅迫對微塑料細菌群落結構產(chǎn)生顯著性影響(PS:R=1.00,P＜0.01; PE:R=1.00,P＜0.01),且 PC1 和 PC2 共解釋度均超過90%(圖3(b)和圖3(c))。 可見,不同種類微塑料生物膜細菌群落結構存在顯著差異,不同濃度SMX 脅迫會明顯改變微塑料生物膜上細菌群落結構。 其中,酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和疣微菌門(Verrucomicrobia)等優(yōu)勢菌在PE 和PS 生物膜上具有顯著差異,且在PS 生物膜中相對豐度均顯著高于PE生物膜(圖 4(a)和圖 4(b))。

圖3 PS 與PE 生物膜細菌群落比較分析(OTU 水平)(a)與不同濃度SMX 對PS 和PE 生物膜細菌群落的差異性影響(OTU 水平)(b~c)Fig.3 Comparative analysis of bacterial communities in PS and PE biofilm (at OTU level) (a), and influence of SMX at difference concentrations on the bacterial communities in PS and PE biofilms (at OTU level) (b~c)

目前微塑料種類對附著微生物群落結構的影響研究尚未獲得一致的結論。 Zettler 等[1]對北大西洋不同微塑料樣品的分析表明,PE 和聚丙烯(polypropylene, PP)生物膜微生物群落存在差異性;然而,de Tender 等[39]對北海PE 和PP 生物膜樣品中微生物群落未觀察到明顯的差異性;此外,Li 等[40]對海河口PE、PP 和PS 這3 種微塑料生物膜細菌群落結構也未觀察到明顯的差異性。 然而本研究中PE 和PS微塑料生物膜細菌群落結構存在差異性。 目前有關微塑料材質引起的微生物群落結構差異性的機制尚不清楚,一種原因可能是由于不同微塑料生物膜結構組成存在差異[41],同時不同的生物膜結構組成對抗生素的脅迫響應也存在差別,從而會導致對微塑料生物膜中微生物群落產(chǎn)生不同的選擇壓力作用。

2.3 細菌群落與ARGs 和intI1 的共現(xiàn)性網(wǎng)絡分析

細菌群落的演變會引起 ARGs 豐度水平變化[42]。 對不同種類微塑料生物膜細菌群落與ARGs進行網(wǎng)絡分析,確定不同分類水平下細菌群落與ARGs 間的關聯(lián)性,找出2 種微塑料上的潛在ARGs宿主菌。 PE 生物膜上細菌群落5個細菌門與sul1、sul2 和intI1 具有明顯關聯(lián)性(圖5(a));其中,變形菌門和放線菌門為PE 生物膜上優(yōu)勢細菌,分別占總關聯(lián)菌的52.17%和21.74%。 PS 生物膜上細菌群落6個細菌門(24個潛在宿主菌屬)與sul1、sul2 和intI1 具有明顯相關關系(圖5(b));其中,厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門為PS 生物膜上的優(yōu)勢細菌,均占總體的33.33%。 已有研究表明細菌間ARGs 水平轉移主要發(fā)生在變形菌門、放線菌門和厚壁菌門基因組中[43-45]。 然而,PE 和 PS 上這 3 種與 ARGs 擴散密切相關的細菌在門水平無顯著性差異(圖4(b))。

圖4 PE 和PS 微塑料生物膜細菌群落門水平結構和差異性比較注:Wilcoxon 秩和檢驗,*P＜0.05。Fig.4 The structure characteristics of bacterial communities in PE and PS biofilms at phylum level and their comparisonsNote: Wilcoxon rank sum test, *P＜0.05.

在屬水平,PE 和 PS 生物膜上分別有23個和24個細菌與ARGs 和intI1 具有明顯共線性,且2 種微塑料上ARGs 潛在宿主菌并不相同(圖5(a))。 在PE 生物膜上的潛在宿主菌中,貪噬菌屬(Variovorax)和Curvibacter已在瓶裝礦泉水中被發(fā)現(xiàn)具有多重耐藥性[46];Nordella攜帶sul基因對磺胺類抗生素具有抗性[47];奈瑟菌屬(Neisseria)和紅球菌屬(Rhodococcus)具有多重耐藥性[48-49]。 在 PS 生物膜潛在宿主菌中,假單胞菌屬(Pseudomonas)作為一種常見的ARGs 宿主菌,在SMX 脅迫下假單胞菌屬多重耐藥性明顯增強[50];在剩余污泥中副球菌屬(Paracoccus)被發(fā)現(xiàn)具有多重耐藥性[51];在SMX 對序批式反應器(SBR)系統(tǒng)脅迫的活性污泥和水樣中動膠菌屬(Zoogloea)為產(chǎn)生似sul1 的主要細菌[52];在雞腸道微生物共生體中Porphyromonadaceae具有四環(huán)素抗性[53],PS 生物膜上該菌與sul1 共現(xiàn),說明其具有多重耐藥性。 由此可見,在屬水平,PE 和PS 生物膜上的一些細菌已被證實是ARGs 潛在宿主菌,且2 種微塑料生物膜上潛在宿主菌具有顯著差異。 此外,PS 和PE 生物膜上sul1 與intI1 均具有明顯的關聯(lián)性,并在潛在宿主菌中具有共現(xiàn)性,可見intI1 在微塑料ARGs 傳播擴散中具有重要作用。intI1 在2 種微塑料上無顯著差異也是PE 和PS 上ARGs 相對豐度無顯著差異的主要因素之一。

圖5 PE(a)和PS(b)生物膜中ARGs、intI1 和細菌群落(屬水平)間的共現(xiàn)模式注:節(jié)點按微生物群落門分類進行著色,每個節(jié)點的大小與連接的數(shù)量(度)成正比,連線表示強的相關性(r≥0.7,P＜0.05)。Fig.5 The co-occurrence pattern among ARGs, intI1 and bacterial communities (genus level) in PE (a) and PS (b) biofilmsNote: The nodes are colored according to the microbial community classification at phylum level, and the size of each node is proportional to the number of connections (degrees); the line indicates a strong correlation (r≥0.7, P＜0.05).

本研究未發(fā)現(xiàn) SMX 脅迫對不同微塑料上ARGs 的相對豐度產(chǎn)生顯著影響。 然而,SMX 的脅迫作用可以通過增加intI1 豐度顯著提高微塑料上ARGs 的豐度水平。 其中,高濃度的 SMX 脅迫對ARGs 豐度具有更明顯的促進作用,但隨著時間演化促進作用明顯減弱。 盡管2 種微塑料生物膜上細菌群落組成結構具有明顯差異,而與ARGs 強關聯(lián)性的細菌門的群落組成并無顯著性差異;然而,在屬水平上2 種微塑料ARGs 潛在宿主菌明顯不同,但未明顯影響其生物膜上ARGs 豐度水平。 微塑料生物膜上intI1 與ARGs 的相關性,及其在細菌群落網(wǎng)絡中與ARGs 的共現(xiàn)性,均表明intI1 也是促進微塑料上ARGs 擴散的主要因素,但2 種微塑料上intI1無明顯差異,未引起微塑料上ARGs 差異性分布。由于目的ARGs 和微塑料種類有限,研究結果可能存在局限性,因此為探明微塑料種類對ARGs 傳播的影響,需對更多種類的微塑料上多種ARGs 和可移動元件的富集特征進行研究,進一步明確不同微塑料上ARGs 分布特征和演化規(guī)律,及引起微塑料上ARGs 傳播的關鍵因子。