宋崇崇, 張瑾 , 周娜娜, 駱縱縱, 馬添翼

安徽建筑大學(xué)環(huán)境與能源工程學(xué)院,安徽省水污染控制與廢水資源化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,合肥 230601

全球新型冠狀病毒爆發(fā)以來(lái),消毒劑已經(jīng)成為了人們生產(chǎn)生活的必需品。 據(jù)報(bào)道,2020年2月武漢市消毒劑的居民使用量高達(dá)1 900 多t,此外,污水處理廠的消毒劑投放量高達(dá)1 700 多t[1]。 至今,國(guó)外疫情依舊沒(méi)有得到全面控制。 可想而知,全球消毒劑的使用量將是一個(gè)極為龐大的數(shù)字。 大量消毒劑的使用導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境面臨較大的潛在危險(xiǎn)。Tong 等[2]研究發(fā)現(xiàn)含氯消毒劑的大量使用會(huì)造成菌的耐藥性。 此外,在消毒劑使用的過(guò)程中會(huì)伴隨有消毒副產(chǎn)物的生成[3],對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了更為嚴(yán)重的影響。 有調(diào)查甚至發(fā)現(xiàn),新冠疫情后有98.6%的人在使用消毒劑的時(shí)候會(huì)將多余的消毒劑遺棄到環(huán)境中,這勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致水生生態(tài)環(huán)境被直接或是間接的污染[4]。 消毒劑的過(guò)量使用會(huì)使水生生態(tài)系統(tǒng)遭遇極大的破壞,影響水質(zhì)進(jìn)而增加動(dòng)物和人類的間接風(fēng)險(xiǎn)[5-6]。 相比于一般重金屬、抗生素和離子液體等污染物而言,消毒劑易揮發(fā),更易對(duì)人體健康產(chǎn)生危害。 Park 等[7]發(fā)現(xiàn)加濕器消毒劑的主要成分(聚六亞甲基胍)會(huì)造成孕婦和兒童肺部發(fā)生病變。Herron 等[8]研究發(fā)現(xiàn)苯扎氯銨消毒劑會(huì)對(duì)膽固醇生物合成產(chǎn)生影響從而破壞神經(jīng)發(fā)育。 在眾多消毒劑中,季銨鹽類消毒劑(quaternary ammonium salt disinfectant, QASD)是在衛(wèi)生、養(yǎng)殖業(yè)和工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域中廣泛被使用的一種消毒劑[9],目前,對(duì)消毒劑毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究較少,對(duì)QASD 的毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估則更少,因此有必要對(duì)QASD 進(jìn)行毒性研究。

在自然環(huán)境中,污染物常以混合物形式存在[10-12],這就勢(shì)必會(huì)造成污染物的復(fù)合污染。 混合物可能會(huì)產(chǎn)生比單個(gè)污染物風(fēng)險(xiǎn)更大、更復(fù)雜的毒性相互作用,采用適當(dāng)?shù)哪Ｐ涂陀^和準(zhǔn)確地評(píng)估混合物對(duì)環(huán)境的危害和風(fēng)險(xiǎn)是非常關(guān)鍵的。 濃度加和(concentration addition, CA)模型[11-14]是目前眾多評(píng)估模型中應(yīng)用最為廣泛的一種,然而,CA 模型只能定性評(píng)估混合物毒性相互作用。 在環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí),需要關(guān)注到混合污染物對(duì)環(huán)境產(chǎn)生最大風(fēng)險(xiǎn)的程度[15],因此,需要對(duì)混合物毒性相互作用的強(qiáng)度進(jìn)行定量評(píng)估。 基于CA 模型的擬合歸零法[16]將擬合的濃度劑量效應(yīng)曲線(concentration-response curves,CRCs)上的各個(gè)效應(yīng)歸一化到同一尺度,并對(duì)CA 模型預(yù)測(cè)線和CRCs 做偏差分析,可對(duì)毒性相互作用進(jìn)行定量表征。

綜上所述,本文擬以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)為受試生物,以生活中常用的3 種季銨鹽類消毒劑雙十二烷基二甲基溴化銨(didodecyl dimethyl ammonium bromide, DAB)、 苯 扎 溴 銨(benzalkonium bromide, BKB)和度米芬(domiphen bromide, DOM)為研究對(duì)象,采用均勻設(shè)計(jì)射線法(uniform design ray, UD-ray)設(shè)計(jì)消毒劑的三元混合物體系。 應(yīng)用時(shí)間依賴微板毒性分析法(time-dependent microplate toxicity analysis, t-MTA)考察消毒劑及其三元混合體系對(duì)C. pyrenoidosa的毒性效應(yīng)。分別應(yīng)用CA 模型和擬合歸零法對(duì)三元消毒劑混合物的毒性相互作用進(jìn)行定性和定量評(píng)估,以此為其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供數(shù)據(jù)和方法參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

選取3 種常用的季銨鹽類消毒劑(QASD)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,其中雙十二烷基二甲基溴化銨(DAB)為分析純,購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,苯扎溴銨(BKB)和度米芬(DOM)為分析純,購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司,它們的理化性質(zhì)如表1所示。 為避免消毒劑濃度在儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)生變化,3種消毒劑的溶液均是當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用,且采用Milli-Q水配制,并儲(chǔ)存于棕色瓶中,放置于4oC 的冰箱內(nèi)。

表1 3 種消毒劑的理化性質(zhì)和儲(chǔ)備液濃度Table 1 Physical and chemical properties of the three disinfectants and concentration of stocks

1.2 藻種與培養(yǎng)方法

蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)(FACHB),編號(hào)為FACHB-5,采用BG11 培養(yǎng)基[17]進(jìn)行培養(yǎng),藻液按1 ∶5 的比例進(jìn)行轉(zhuǎn)接,為防止C. pyrenoidosa聚于瓶底,也為了藻液受光均勻,需要每天定時(shí)搖晃錐形瓶,藻的詳細(xì)培養(yǎng)過(guò)程參考文獻(xiàn)[18]。

1.3 混合物設(shè)計(jì)

均勻設(shè)計(jì)射線法(UD-Ray)是一種可用于全面表征三元及以上多元混合物的方法[12,19],在此,采用UD-Ray 設(shè)計(jì)QASD 的三元混合物體系,其中包括5條射線 U1、U2、U3、U4 和 U5,每條射線中各組分的濃度比例(pi)如表2 所示。

表2 三元混合體系中季銨鹽類消毒劑(QASD)的濃度比(pi)Table 2 Concentration ratio (pi) of quaternary ammonium salt disinfectant (QASD) of the ternary mixture system

1.4 時(shí)間依賴微板毒性分析法

通過(guò)時(shí)間依賴微板毒性分析法(t-MTA)[20-21]獲得單個(gè)消毒劑及其三元混合物的濃度-效應(yīng)數(shù)據(jù)。選擇透明的96 孔板為實(shí)驗(yàn)載體,在其四周共36個(gè)微孔中加入200 μL 超純水以避免邊緣效應(yīng)。 在第6、7 列剩余的 12 孔中加入 100 μL 超純水作為空白對(duì)照組,其余列按預(yù)實(shí)驗(yàn)的稀釋因子設(shè)置12個(gè)濃度梯度,最終在每個(gè)微孔中加入100 μL 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(0.2＜OD690＜0.3)的藻液使得每個(gè)孔的總體積為200 μL。 為減少實(shí)驗(yàn)誤差,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個(gè)平行樣。 此外,為了避免蒸發(fā),每個(gè)透明的96 孔板都加蓋,并放置在(25±1)℃、光暗比14 h ∶10 h、光照強(qiáng)度為5 000 lx 的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天定時(shí)交換板的位置以確保受光均勻,在12、24、48、72 和96 h 時(shí)取出,放置于酶標(biāo)儀中讀取OD690值。 毒性效應(yīng)(E)計(jì)算公式如下:

1.5 數(shù)據(jù)擬合

毒性數(shù)據(jù)采用兩參數(shù)非線性模型 Logit 函數(shù)[22-23]來(lái)進(jìn)行擬合,數(shù)據(jù)擬合通過(guò)APTox 軟件[24]來(lái)實(shí)現(xiàn)。 Logit 函數(shù)公式如下:

式中:E表示效應(yīng)(0≤E≤1),α和β是模型參數(shù),c是污染物的濃度。

為了描述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密程度,采用觀測(cè)值置信區(qū)間(confidence interval based on the observation,OCI)[25-26]來(lái)表征數(shù)據(jù)的不確定度。

1.6 混合物毒性相互作用分析

常采用CA 模型[13-14]來(lái)評(píng)估混合物的毒性相互作用,其公式如下:

式中:n表示組分的個(gè)數(shù);ci表示當(dāng)混合體系表現(xiàn)出效應(yīng)x時(shí)所對(duì)應(yīng)的第i個(gè)組分的濃度;ECx,i表示第i個(gè)組分所對(duì)應(yīng)的等效應(yīng)濃度。 當(dāng)CA 模型擬合線與95% OCI 的相對(duì)位置不同時(shí),代表了不同的相互作用規(guī)律,詳細(xì)見(jiàn)判別示意圖1(a)。

為了進(jìn)一步對(duì)混合物毒性相互作用進(jìn)行定量評(píng)估,采用基于濃度加和偏離指數(shù)(deviation from CA model, dCA)[15,27]和95% OCI 的擬合歸零法對(duì)毒性相互作用實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)定量表征,其公式如下:

式中:dOCI 表示置信區(qū)間的偏差程度,ECAx表示CA 模型預(yù)測(cè)的效應(yīng),Ex表示Logit 函數(shù)擬合的效應(yīng)。 毒性相互作用見(jiàn)判別示意圖1(b)。

圖1 毒性相互作用判別示意圖注:dCA 表示濃度加和偏離指數(shù),dOCI 表示置信區(qū)間的偏差程度。Fig.1 Schematic diagram of toxicity interaction identificationNote: dCA represents deviation from concentration addition model, and dOCI represents the degree of deviation of confidence interval based on the observation.

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 3 種 QASD 對(duì) C. pyrenoidosa 的單元毒性

采用兩參數(shù)非線性函數(shù)(Logit 函數(shù))對(duì)由t-MTA法測(cè)得的3 種QASD 的單元毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,擬合的參數(shù)(α和β)和統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)(RMSE 和R)如表 3所示。 此外,將不同時(shí)間點(diǎn)下的CRCs 繪制于圖2。

由表 3 可知,3 種 QASD 對(duì)C. pyrenoidosa的單元毒性數(shù)據(jù)可以較好地被Logit 函數(shù)擬合(RMSE＜0.070,R＞0.8700)。 其中,初始時(shí)間(12 h)的擬合情況比后面時(shí)間點(diǎn)(24 ~96 h)的擬合情況稍差,這可能是藻在初始時(shí)間下存在適應(yīng)性差異的原因[28]。 半數(shù)效應(yīng)濃度(median effect concentration, EC50)由 Logit 函數(shù)(公式 2)的反函數(shù)計(jì)算而來(lái)。 3 種 QASD 對(duì)C. pyrenoidosa的EC50值比離子液體對(duì)發(fā)光菌[29]、農(nóng)藥對(duì)發(fā)光菌[30]和重金屬對(duì)C. pyrenoidosa[31]的EC50值分別小3個(gè)、2個(gè)和 2個(gè)數(shù)量級(jí)。 已有研究表明,發(fā)光菌比C. pyrenoidosa對(duì)毒性響應(yīng)更加敏感[32],如以pEC50值(EC50的負(fù)對(duì)數(shù))為毒性大小指標(biāo)[33-34],可知,3 種QASD 的毒性遠(yuǎn)大于文獻(xiàn)中所報(bào)道的離子液體、農(nóng)藥和重金屬的毒性。 這也表明在自然環(huán)境下對(duì)消毒劑進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估尤為重要。 一般藻類的測(cè)試終點(diǎn)是96 h,此時(shí)的毒性順序是:DOM＞BKB＞DAB。 但是越來(lái)越多的研究表明,時(shí)間是毒性研究中的一個(gè)重要因素[20,35]。 由表3 和圖2 可知,3種消毒劑對(duì)C.pyrenoidosa呈顯著的時(shí)間依賴毒性效應(yīng),但在48 h 后毒性不再明顯增加。 這也說(shuō)明,在對(duì)污染物的毒性進(jìn)行研究時(shí),需要關(guān)注時(shí)間這一因素,不同污染物隨時(shí)間變化的毒性效應(yīng)規(guī)律有所不同。

表3 Logit 函數(shù)對(duì)3 種 QASD 在不同暴露時(shí)間下毒性數(shù)據(jù)的擬合參數(shù)(α 和 β)、統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)(RMSE 和R)、EC50 和 pEC50 值Table 3 The fitting parameters (α and β), statistical parameters (RMSE and R), EC50, and pEC50 values of the three QASD toxicity data of the Logit function at different exposure times

2.2 3 種QASD 對(duì)C. pyrenoidosa 的三元混合毒性效應(yīng)

5 條三元混合射線的毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)可以較好地被 Logit 函數(shù)擬合(RMSE＜0.050,R＞0.8600)。 擬合的參數(shù)(α和β)和統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)(RMSE 和R)如表 4 所示。 因三元混合物的時(shí)間-毒性-效應(yīng)數(shù)據(jù)在效應(yīng)0~1 范圍內(nèi)分布比單個(gè)消毒劑的均勻,為了更好地分析消毒劑毒性隨暴露濃度和時(shí)間的變化規(guī)律,在三維曲線圖(圖2)的基礎(chǔ)上繪制了濃度時(shí)間效應(yīng)三維曲面圖,如圖3 所示。

圖2 不同暴露時(shí)間下3 種QASD 對(duì)C. pyrenoidosa 的擬合濃度劑量效應(yīng)曲線(CRCs)Fig.2 Fitted concentration-response curves (CRCs) of three QASD to C. pyrenoidosa at different exposure times

由圖3 可知,三維曲面圖的顏色映射情況可以很好地呈現(xiàn)出污染物毒性與濃度和時(shí)間因素的變化規(guī)律。 同一暴露時(shí)間下,5 條QASD 三元混合射線對(duì)C. pyrenoidosa的抑制率隨混合濃度增加而逐漸變大,即具有濃度依賴毒性效應(yīng)。 張瑾等[33]在研究氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)青?；【拘蕴攸c(diǎn)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了該規(guī)律。 同一濃度下,5 條QASD 三元混合射線對(duì)C. pyrenoidosa的抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變大,即具有時(shí)間依賴毒性效應(yīng),丁婷婷等[32]發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素對(duì)發(fā)光菌和C. pyrenoidosa也具有時(shí)間依賴毒性效應(yīng)。 將0.1 ~0.9 的效應(yīng)用紅色實(shí)線在三維曲面上標(biāo)注出來(lái),可知不同的效應(yīng)濃度隨時(shí)間的變化規(guī)律有所不同。 12 ~48 h 時(shí),EC10、EC20、EC30和EC40在逐漸減小,而在48 ~96 h 時(shí)則逐漸變大,但每個(gè)效應(yīng)濃度隨時(shí)間的變化程度有所不同。 由紅色實(shí)線的彎曲程度可知,48 ~96 h 的效應(yīng)濃度變化的程度在逐漸變小。 圖3 中5 條射線的 EC50值在12 ~48 h 快速減小,在48 ~72 h 緩慢減小,而在72~96 h 則緩慢增大,這和表4 中EC50值的變化規(guī)律一致。

圖3 3 種QASD 對(duì)C. pyrenoidosa 的濃度-時(shí)間-效應(yīng)三維曲面圖Fig.3 Three dimensional surface diagram of concentration-time-effect of three QASD on C. pyrenoidosa

表4 Logit 函數(shù)對(duì)三元混合物的5 條射線在不同暴露時(shí)間下毒性數(shù)據(jù)的擬合參數(shù)(α 和β)、統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)(RMSE 和 R)、EC50 和 pEC50 值Table 4 The fitting parameters (α and β), statistical parameters (RMSE and R), EC50, and pEC50 values of the ternary mixture toxicity data of the Logit function at different exposure times

2.3 QASD 三元混合體系的時(shí)間依賴協(xié)同作用

5 條QASD 三元混合射線的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)、擬合的CRCs、95% OCI 和 CA 模型預(yù)測(cè)線如圖4 所示。由圖4 可知,在12 h 時(shí),5 條射線在低濃度區(qū)間的CA 模型預(yù)測(cè)線落于95% OCI 內(nèi),呈加和作用,但隨暴露濃度的加大CA 模型預(yù)測(cè)線逐漸低于95%OCI 下限,呈協(xié)同作用。 在 24 h 時(shí),U1 和 U2 在中濃度區(qū)間的CA 模型預(yù)測(cè)線低于95% OCI 下限,呈協(xié)同作用,而低濃度和高濃度區(qū)卻呈加和作用,U3、U4 和U5 在整個(gè)濃度區(qū)間的CA 模型預(yù)測(cè)線幾乎都在 95% OCI 內(nèi),呈加和作用。 在 48 h 時(shí),U1 和 U2中濃度區(qū)的CA 模型預(yù)測(cè)線和95% OCI 下限的偏離程度加大,即協(xié)同作用變強(qiáng),而 U3、U4 和 U5 在中濃度區(qū)也逐漸表現(xiàn)出弱協(xié)同作用。 在72 h 和96 h 時(shí),低濃度下5 條射線都呈加和作用,隨暴露濃度的增加,CA 模型預(yù)測(cè)線逐漸低于95% OCI 下限,呈協(xié)同作用。 當(dāng)暴露時(shí)間從24 h 到96 h 的過(guò)程中,5 條射線的協(xié)同作用都在逐漸變強(qiáng),呈現(xiàn)時(shí)間依賴協(xié)同作用規(guī)律。

盡管CA 模型可以很好地評(píng)估混合毒性相互作用,但在不同濃度水平下,協(xié)同作用(圖4)強(qiáng)度無(wú)法由CA 模型進(jìn)行定量表征。 結(jié)合置信區(qū)間的擬合歸零法將各個(gè)濃度水平的效應(yīng)歸一化到同一尺度,可以對(duì)毒性相互作用進(jìn)行定量表征,擬合歸零指數(shù)如圖5 所示。

與CA(圖4)相比,擬合歸零指數(shù)圖(圖5)可以很清晰地看出協(xié)同作用隨濃度的變化存在有非常明顯的差異。 在12 h 時(shí),隨濃度變大,5 條射線的協(xié)同作用強(qiáng)度逐漸變強(qiáng)。 雖然濃度會(huì)改變混合物毒性相互作用的強(qiáng)度,但并不是濃度越大毒性相互作用強(qiáng)度就越強(qiáng)。 在24 ~96 h 時(shí),隨濃度變大,每條射線的協(xié)同作用強(qiáng)度在逐漸變強(qiáng),當(dāng)?shù)竭_(dá)最大協(xié)同作用強(qiáng)度后,濃度繼續(xù)變大,協(xié)同作用強(qiáng)度則在不斷減弱(除U3-24 h 在整個(gè)濃度水平下都是加和作用外)。Zhang 等[15]在研究氨基糖苷類抗生素對(duì)青海弧菌毒性相互作用規(guī)律時(shí),也發(fā)現(xiàn)混合物體系的協(xié)同作用強(qiáng)度隨濃度呈先變強(qiáng)后變?nèi)醯默F(xiàn)象。 此外,隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng),5 條射線具有最大協(xié)同作用強(qiáng)度所對(duì)應(yīng)的濃度都逐漸變大。 值得注意的是,在24 ~96 h的過(guò)程中,5 條射線的最大協(xié)同作用強(qiáng)度都在逐漸變強(qiáng)。 在96 h,最大協(xié)同作用強(qiáng)度達(dá)到最大,此時(shí),U1、U2、U3、U4 和 U5 的最大協(xié)同作用強(qiáng)度分別為0.3227、0.3507、0.3105、0.2804 和 0.2626。 陳敏等[36]在研究抗生素與重金屬混合物對(duì)C. pyrenoidosa的毒性效應(yīng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了部分混合射線具有時(shí)間依賴協(xié)同作用。 上述研究結(jié)果表明,疫情后大量使用的消毒劑可能會(huì)導(dǎo)致自然水體環(huán)境受到嚴(yán)重污染,而消毒劑之間所產(chǎn)生的協(xié)同毒性作用,且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng),這很可能會(huì)對(duì)環(huán)境健康產(chǎn)生更大的威脅,值得我們密切關(guān)注消毒劑的潛在生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

圖5 不同暴露時(shí)間下QASD 三元混合體系的5 條射線的擬合歸零指數(shù)圖注:dCA 表示濃度加和偏離指數(shù),dOCI 表示置信區(qū)間的偏差程度。Fig.5 Fitting zero index diagram of five mixture rays of QASD ternary mixture systems at different exposure timesNote: dCA represents deviation from concentration addition model, and dOCI represents the degree of deviation of confidence interval based on the observation.

綜上所述:

(1) Logit 函數(shù)可以較好地對(duì) DAB、BKB、DOM及其三元混合射線進(jìn)行擬合。

(2)3 種消毒劑對(duì)C. pyrenoidosa呈顯著的時(shí)間依賴毒性效應(yīng),即隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng),毒性逐漸增強(qiáng),但在48 h 后毒性不再明顯增加。

(3) 時(shí)間-濃度-效應(yīng)三維曲面圖適合描述效應(yīng)在空間濃度分布較為均勻的毒性隨時(shí)間變化規(guī)律,在同一暴露時(shí)間,QASD 三元混合物對(duì)C. pyrenoidosa的抑制率隨混合濃度增加而逐漸變大,同一暴露濃度,QASD 三元混合物對(duì)C. pyrenoidosa的抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸變大。

(4) 依據(jù) CA 模型,QASD 三元混合體系的5 條射線對(duì)C. pyrenoidosa的毒性相互作用幾乎都是協(xié)同作用,且在24 ~96 h 具有時(shí)間依賴協(xié)同作用。

(5) 基于擬合歸零法,可以實(shí)現(xiàn)協(xié)同作用強(qiáng)度的定量表征。 隨暴露濃度增加,協(xié)同作用強(qiáng)度先變強(qiáng)后變?nèi)?隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng),5 條射線具有最大協(xié)同作用,強(qiáng)度都逐漸變大。