王嘉琦, 趙時(shí)真 , 田樂樂, 蔣昊余, 李軍, 張干

1. 中國科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所,有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640

2. 鄭州大學(xué)電氣工程學(xué)院,鄭州 450001

3. 中國科學(xué)院大學(xué),北京 100049

大量的流行病學(xué)研究證實(shí)了大氣顆粒物(particulate matter, PM)暴露與人群發(fā)病率和死亡率上升有關(guān),尤其是呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和嬰幼兒疾病[1-4]。 目前,學(xué)界普遍認(rèn)為由活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)引發(fā)的氧化應(yīng)激(oxidative stress)是大氣顆粒物導(dǎo)致人體健康效應(yīng)的核心機(jī)制假說[5]。 大氣顆粒物進(jìn)入人體后作為脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的促氧化劑誘導(dǎo)生成過量的ROS,引起細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變,產(chǎn)生氧化應(yīng)激效應(yīng),進(jìn)而觸發(fā)局部和全身系統(tǒng)性炎癥,最終導(dǎo)致呼吸和心臟疾病(CHD)、哮喘、慢性阻塞性疾病(COPD)甚至癌癥等的發(fā)生[6-7]。 ROS 通常具有一個(gè)或多個(gè)不成對(duì)電子,是一類高活性含氧分子,該術(shù)語于1945年首次提出,主要包括單線態(tài)氧分子(1O2)、超氧自由基(·O2-)、過氧化氫(H2O2)、超氧化氫(HO2)以及羥基自由基(·OH)等[8-9]。 PM 誘導(dǎo) ROS 生成的能力稱為氧化潛勢(oxidative potential, OP),是指示大氣顆粒物內(nèi)在健康風(fēng)險(xiǎn)的重要參數(shù)[3]。 目前有多種基于細(xì)胞和非細(xì)胞體系評(píng)價(jià)顆粒物氧化潛勢的方法,其中二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)法可操作性強(qiáng),能更全面地反映顆粒物的物理化學(xué)特征,被廣泛地應(yīng)用于大氣顆粒物氧化潛勢的測定(OPDTT)[10]。 本文從OPDTT的基本原理,OPDTT與顆粒物化學(xué)組成、粒徑和來源的關(guān)系,OPDTT與健康效應(yīng)的關(guān)系及其局限性和挑戰(zhàn)等6個(gè)方面,開展基于DTT 法的大氣顆粒物氧化潛勢測定方法的綜述,可為我國大氣顆粒物健康效應(yīng)的研究提供參考。

1 DTT 法的原理(General principle of OPDTT)

DTT 是一種小分子還原型醇類化合物,與細(xì)胞體系中的還原型谷胱甘肽(GSH)類似,化學(xué)式為C4H10O2S2。 DTT 在還原狀態(tài)下為線性分子,被氧化后變?yōu)榘蜴I的六元環(huán)結(jié)構(gòu),DTT 的強(qiáng)還原性正是來自于該結(jié)構(gòu)的構(gòu)象穩(wěn)定。 DTT 的還原能力與pH 值密切相關(guān),僅在pH＞7 時(shí)體現(xiàn)其還原性,這是由于只有脫去質(zhì)子的硫醇鹽負(fù)離子(—S—)才具有反應(yīng)活性,硫醇(—SH—)則沒有。

如圖1 所示,大氣顆粒物中具有氧化還原活性的成分可捕獲 DTT 中的電子,催化 DTT 氧化為DTT 的硫代物。 顆粒物上的電子進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到O2,將其還原成超氧陰離子(·O2-),·O2-進(jìn)一步生成H2O2和O2

圖1 二硫蘇糖醇(DTT)法的反應(yīng)機(jī)理[6]注:PM 表示大氣顆粒物,DTT 與5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)反應(yīng)生成黃色化合物2-硝基-5-硫代苯甲酸(TNB),該物質(zhì)在412 nm 處有最大吸收波長,通過分光光度計(jì)可確定其含量。Fig.1 The reaction mechanism of the dithiothreitol (DTT) assay[6]Note: PM indicates particulate matter; at each designated time,5,5’-dethiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) reacted with DTT to form 2-nitro-5-thiobenzoic acid (TNB); TNB has the maximum absorption at 412 nm that could be measured by UV-visible spectrophotometer.

[6]。 顆粒物在整個(gè)氧化還原過程中起到催化劑的作用,DTT 的消耗速率在一定線性范圍內(nèi)(DTT 的消耗量低于50%)與顆粒物的催化能力成正比,通過測定反應(yīng)前后DTT 的消耗速率來評(píng)價(jià)顆粒物的氧化潛勢大小[11]。

常見DTT 法檢測顆粒物氧化潛勢的基本流程如下[12-14]:首先配制0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(77.8 mmol·L-1Na2HPO4和 22.2 mmol·L-1KH2PO4;pH 7.4);以緩沖溶液分別配制 10 mmol·L-1的 DTT 儲(chǔ)備液和 10 mmol·L-1的 5,5’-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(5,5’-dethiobis-2-nitrobenzoic acid, DTNB)儲(chǔ)備液(2周內(nèi)使用完畢)并儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中待用;在測定樣品之前用緩沖液分別稀釋為0.1 mmol·L-1DTT 工作液和0.1 mmol·L-1DTNB 工作液(2 h 之內(nèi)完成實(shí)驗(yàn))。 測定過程中將DTT 工作液加入至顆粒物萃取液中開始計(jì)時(shí),37 ℃下避光振蕩混勻。 分別在給定時(shí)間點(diǎn)內(nèi)加入DTNB 工作液使反應(yīng)終止,然后采用分光光度計(jì)在412 nm 處檢測吸光值。 以不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的DTT 濃度做出一條直線,將所得斜率扣除空白斜率,標(biāo)準(zhǔn)化后即為DTT 活性數(shù)據(jù)。

大氣顆粒物氧化潛勢的計(jì)算公式主要分為2 種表達(dá)形式,將DTT 的消耗速率進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化,即單位時(shí)間內(nèi)DTT 消耗量與參與反應(yīng)顆粒物質(zhì)量的比值,以 OPm表示,單位為 pmol DTT·min-1·μg-1PM,表征單位質(zhì)量顆粒物的氧化潛勢,可類比為氧化潛勢的“密度”。 將DTT 的消耗速率進(jìn)行體積標(biāo)準(zhǔn)化,即單位時(shí)間內(nèi)DTT 消耗量與空氣采樣體積的比值,以 OPv表示,單位為 nmol DTT·min-1·m-3,該值被認(rèn)為與流行病學(xué)中顆粒物暴露導(dǎo)致的健康效應(yīng)密切相關(guān)。 此外,為了比較不同實(shí)驗(yàn)條件下從不同研究中所獲得的OPDTT數(shù)據(jù),研究者常以1,4-萘醌(1,4-NQN)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),將OPDTT數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理為氧化劑生成和毒性的標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)(the normalized index of oxidant generation and toxicity, NIOG)[11,15]。

2002年,Kumagai 等[16]首次利用 DTT 法分析了柴油廢氣顆粒物誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS 的水平,并發(fā)現(xiàn)顆粒物中的醌類物質(zhì)能夠促進(jìn)生物系統(tǒng)中ROS 的生成。2005年,Cho 等[14]基于DTT 法分析了美國洛杉磯盆地不同站點(diǎn)大氣顆粒物粒徑(2.5 ~10 μm、＜2.5 μm和＜0.15 μm)、化學(xué)組成與 ROS 生成水平的關(guān)系,結(jié)果表明,顆粒物的氧化還原活性隨粒徑的增大而減小,元素碳、有機(jī)碳及多環(huán)芳烴與顆粒物的氧化還原活性呈現(xiàn)較好的相關(guān)性,而硫酸鹽、硝酸鹽等與氧化還原活性無顯著相關(guān)關(guān)系。 此后,DTT 法被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)大氣顆粒物、柴油尾氣顆粒物和納米顆粒物等各類顆粒物的氧化潛勢。 2015年,Fang 等[17]基于DTT 法設(shè)計(jì)開發(fā)了一套半自動(dòng)化系統(tǒng),該系統(tǒng)的測定效果與手動(dòng)測量結(jié)果具有很好的一致性(r2=0.92),該系統(tǒng)的建立有助于未來開展大尺度環(huán)境顆粒物的氧化潛勢評(píng)估。

2 顆粒物化學(xué)組成對(duì)OPDTT 的影響(Effects of PM chemical compositions on OPDTT)

大氣顆粒物的化學(xué)組成是決定OPDTT最根本的因素,目前國內(nèi)外已有研究發(fā)現(xiàn)大氣顆粒物誘導(dǎo)ROS 生成水平主要與過渡金屬及以醌類化合物為代表的碳質(zhì)組分相關(guān)。 其中過渡金屬(如Fe、Cu、V和Mn)主要通過Fenton 反應(yīng)誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)從而生成過量的 ROS,如式(4) ~ (6),M 為金屬簡稱[11-12]。 此外,Fe2+還可以通過還原 H2O2生成·OH(式(5))[18]。

不同種類過渡金屬的 OPDTT不同(表1)。 See等[19]通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),水溶性金屬與OPDTT的相關(guān)性要高于用酸提取的總金屬,其中Mn 與OPDTT呈現(xiàn)顯著正相關(guān),其次是V 和Zn,研究還發(fā)現(xiàn)更易溶于水的 Cd、Co、Cu、Fe、Mn 和 Ni 等痕量金屬均能夠誘導(dǎo) ROS 生成。 Shinyashiki 等[20]對(duì) 7 種柴油尾氣顆粒物的物理化學(xué)特征進(jìn)行定量分析,并采用DTT 方法測定了顆粒物的ROS 生成水平(OPDTT),估測出可溶性金屬的貢獻(xiàn)約占OPm的45%,其中Cu 和 Fe 的貢獻(xiàn)較為顯著。 Verma 等[21]利用 Chelex樹脂(金屬螯合劑)調(diào)控顆粒物提取物中重金屬含量,研究了重型卡車尾氣中的重金屬對(duì)顆粒物OPDTT的影響,其多元線性回歸模型結(jié)果顯示過渡金屬 Fe、Co 和 Ni 對(duì)顆粒物 OPDTT的貢獻(xiàn)最大。Charrier 和Anastasio[12]基于DTT 法對(duì)美國加利福尼亞州圣華金谷區(qū)域的城市及鄉(xiāng)村PM2.5的ROS 生成水平進(jìn)行定量分析,驗(yàn)證了過渡金屬會(huì)影響顆粒物的OPDTT,并估測過渡金屬的貢獻(xiàn)約占DTT 損失的80%以上,其中Cu 和Mn 的貢獻(xiàn)較為顯著,醌類物質(zhì)約占DTT 損失的20%,此外研究還發(fā)現(xiàn)金屬螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)能夠抑制金屬與醌類物質(zhì)在DTT 實(shí)驗(yàn)中的響應(yīng),應(yīng)當(dāng)避免在DTT 實(shí)驗(yàn)中添加EDTA[12]。

大量研究發(fā)現(xiàn)醌類化合物具有較強(qiáng)的氧化活性(表1),其氧化還原循環(huán)與過渡金屬的反應(yīng)方程式相似,即式(4) ~ (6)[15,18,21-22]。 如圖 2 所示,在還原劑DTT(作用同細(xì)胞內(nèi)NADPH 氧化酶)存在的條件下,醌類化合物能夠催化電子的轉(zhuǎn)移引發(fā)氧化還原循環(huán),從而形成半醌自由基、對(duì)苯二酚和DTT-二硫化物(DTT-disulfide)。 隨后半醌自由基和對(duì)苯二酚與溶解態(tài)的O2反應(yīng)再次生成醌以及超氧陰離子,并可進(jìn)一步生成H2O2。 此外,有研究者采用DTT 法測定發(fā)現(xiàn),不同醌類化合物的ROS 生成水平不同。Chung 等[23]采集了美國加利福尼亞州弗雷斯諾市全年的總懸浮顆粒物樣品(TSP),采用氣相色譜-質(zhì)譜定量分析了樣品中12 種醌類化合物濃度,同時(shí)使用DTT 方法評(píng)估了樣品中ROS 生成水平,研究發(fā)現(xiàn)醌類化合物濃度的總量與OPDTT無相關(guān)性,其中僅1,2-萘醌、1,4-萘醌和菲醌與 OPDTT線性相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.73、0.39 和0.76。

圖2 醌類化合物在細(xì)胞內(nèi)和DTT 實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生的氧化還原循環(huán)[15]注:NAD(P)+表示煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸,NAD(P)H 表示還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,PAH 表示多環(huán)芳烴,GSH 表示谷胱甘肽,RNA 表示核糖核酸,DNA 表示脫氧核糖核酸。Fig.2 The redox cycling of quinones generating reactive oxygen species (ROS) in vivo, and the similar cycling in DTT assay[15]Note: NAD(P)+ indicates nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NAD(P)H indicates triphosphopyridine nucleotide, PAH indicates polycyclic aromatic hydrocarbon, GSH indicates glutathione, RNA indicates ribonucleic acid, and DNA indicates deoxyribonucleic acid.

表1 大氣顆粒物中具有DTT 活性化合物匯總Table 1 The summary of DTT responses of oxidative compounds in particulate matter

多環(huán)芳烴(PAHs)是醌類化合物在大氣中的重要前體物,Ntziachristos 等[24]對(duì)美國加利福尼亞地區(qū)大氣顆粒物不同化學(xué)組分與OPDTT進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)PAHs 與OPDTT具有很高的正相關(guān)性,并提出PAHs 濃度是 OPDTT的良好指示物。 Verma 等[25]通過對(duì)美國洛杉磯地區(qū)大氣顆粒物中半揮發(fā)性組分OPDTT的研究也得到了類似的結(jié)論。 事實(shí)上PAHs自身幾乎沒有氧化還原活性,但其能夠與大氣中的氧化物質(zhì)(如·OH、NO3和O3)發(fā)生光化學(xué)氧化還原反應(yīng)或在顆粒物上發(fā)生多相反應(yīng)轉(zhuǎn)化為醌,從而與OPDTT呈現(xiàn)較好的相關(guān)性[14,26]。 Verma 等[27]采用DTT 法對(duì)比了大氣顆粒物中水溶性有機(jī)物和非水溶性有機(jī)物(甲醇相)以及親水性組分和憎水性組分之間的ROS 生成水平,發(fā)現(xiàn)顆粒物的OPDTT與棕色碳(BrC)的含量呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)關(guān)系,而BrC 主要由腐殖質(zhì)類物質(zhì)(HULIS)組成。 Lin 和Yu[28]對(duì)中國珠江三角洲大氣顆粒物中HULIS 的研究也得到了相似的結(jié)論。 HULIS 本身的氧化還原活性很低,但是在1,4-萘醌或大氣顆粒物中其他無氧化還原活性有機(jī)組分(如吡啶、咪唑及其烷基衍生物)的催化作用下,會(huì)增加其對(duì)DTT 的消耗,原因是未質(zhì)子化的氮原子可作為氫鍵的接收者,在ROS 的生成過程中促進(jìn)氫原子的轉(zhuǎn)移[29]。

二次有機(jī)氣溶膠(SOA)是大氣顆粒物中的重要組成部分,它的生成會(huì)加劇與顆粒物污染相關(guān)的人群健康危害(尤其是嬰兒和兒童),由于SOA 化學(xué)組成極其復(fù)雜,對(duì)SOA 進(jìn)行有效的識(shí)別和健康效應(yīng)評(píng)估一直是國際氣溶膠研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[30-31]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)相較于生物源 SOA(如異戊二烯SOA、α-蒎烯 SOA 和β-石竹烯 SOA),人為源 SOA(如間二甲苯SOA、甲苯SOA 和萘SOA)通常具有更高的OPm,同時(shí)研究者還指出該類由芳香族前體物產(chǎn)生的人為源SOA 中的醌含量幾乎可以忽略不計(jì),并推測SOA 主要通過非催化途徑消耗DTT[32-33]。這種推測隨后被研究者證實(shí),并提出芳香族SOA 中的 Michael 受體(如 CHO、COR、COOH 和 COOR)可通過親核加成或共軛加成與DTT 反應(yīng)并形成DTT的加合物,從而消耗 DTT[34-35]。 此外,Gant 等[36]使用體外肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn),揭示了醌類也可與DTT 上的硫醇基發(fā)生芳構(gòu)化反應(yīng),即通過非氧化還原途徑消耗DTT。 McWhinney 等[22]采用 DTT 法評(píng)估了低濃度NOx下,·OH 和萘的光化學(xué)反應(yīng)體系下生成 SOA的ROS 生成水平,結(jié)果表明,1,2-萘醌、1,4-萘醌和5-羥基-1,4-萘醌的貢獻(xiàn)僅占萘SOA 的OPDTT的(30±5)%,研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)除上述3 種醌類化合物外還存在大量未知的具有氧化還原活性的萘SOA 組分。Tobias 和Ziemann[37]向煙霧箱中通入三亞乙基四胺、烯烴、酸類和臭氧,充分反應(yīng)后,在生成的顆粒物中檢測到了有機(jī)過氧化物,同時(shí)采用熱解析-氣相色譜-質(zhì)譜檢測驗(yàn)證了該類反應(yīng)產(chǎn)物,研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)生成的有機(jī)過氧化物更易附著于顆粒相中;并推測大氣有機(jī)物可作為氣溶膠成核核心,同時(shí)產(chǎn)生有機(jī)活性氧物質(zhì)。 Wang 等[38]采用煙霧箱實(shí)驗(yàn)?zāi)Mα-蒎烯和β-蒎烯的臭氧化反應(yīng)及其甲苯光化學(xué)反應(yīng),他們將生成的SOA 通入水相中,并使用液相色譜-熒光檢測器檢測到了大量H2O2的存在。 Docherty 等[39]通過實(shí)驗(yàn)室模擬發(fā)現(xiàn)在1-丙醇、環(huán)己烯和甲醛存在條件下,單萜烯與臭氧可生成SOA 和過氧化物,其中過氧化物占?xì)馊苣z質(zhì)量分?jǐn)?shù)的47% ~85%,在大氣中的半衰期為1 周。 上述研究揭示了SOA 通過非氧化還原途徑消耗DTT,同時(shí)大量的毒理學(xué)研究證實(shí)了SOA 中的過氧化物可通過結(jié)合生物分子上的親核試劑或親核試劑位點(diǎn),來導(dǎo)致DNA 損傷及對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的修飾[35,40]。 因此未來關(guān)于SOA 的ROS 生成水平研究可從非催化性途徑進(jìn)行深入探究。

3 顆粒物粒徑對(duì)OPDTT 的影響(Effects of PM size on OPDTT)

顆粒物粒徑不同,空氣動(dòng)力學(xué)行為不同,對(duì)于身體內(nèi)屏障的穿透力也不同,較大的顆粒物進(jìn)入人體后會(huì)停留在支氣管上,較小的顆粒物則會(huì)穿透呼吸屏障進(jìn)入肺部,而一些超細(xì)顆粒物則更可能進(jìn)入呼吸系統(tǒng)深部甚至參與血液循環(huán)[42-43]。 目前關(guān)于顆粒物粒徑大小與OPDTT的關(guān)系,大多數(shù)研究都表明,OPm伴隨著顆粒物粒徑的減小而增大。 例如,Li等[44]利用DTT 法研究了美國加利福尼亞地區(qū)不同粒徑大氣顆粒物的ROS 生成水平,結(jié)果表明超細(xì)顆粒物(＜0.1 μm)的 OPm分別是粗顆粒物(2.5 ~10 μm)和細(xì)顆粒物(＜2.5 μm)OPm的 21.7 倍和 8.6 倍。 另外,研究人員在美國弗吉尼亞州[45]和佐治亞州[46]開展的相關(guān)研究也取得相似的結(jié)論。

然而,另外一些研究也表明,與超細(xì)顆粒物相比,亞微米級(jí)顆粒物具有更高的OPm。 例如,Samara[47]在希臘塞薩洛尼基的研究發(fā)現(xiàn),單位質(zhì)量亞微米級(jí)顆粒物(0.49 ~1.0 μm)的DTT 活性高于超細(xì)顆粒物(＜0.49 μm),這種差異性可能來自于亞微米級(jí)顆粒物上富集了更多具有DTT 活性的化學(xué)組分。此外,一些研究發(fā)現(xiàn),與人類暴露水平密切相關(guān)的OPv,其峰值通常出現(xiàn)在顆粒物粒徑范圍為1 ~10 μm 左右[46,48],其中顆粒物水溶性組分OPv呈單峰態(tài),而非水溶性組分OPv則呈雙峰態(tài)分布,這種分布的差異性主要與顆粒物中金屬元素與含氧有機(jī)物的相對(duì)含量有關(guān)[4]。

4 顆粒物排放源對(duì)OPDTT 的影響(Effects PM emission sources on OPDTT)

近年來流行病學(xué)的研究也發(fā)現(xiàn),大氣顆粒物的健康效應(yīng)與其來源密切相關(guān),并且一些特殊來源的顆粒物具有更高的毒性。 已有研究發(fā)現(xiàn),短期暴露于交通源會(huì)引起哮喘患者肺功能下降,增加過敏源的反應(yīng)[49-50],也會(huì)影響健康人群的血管功能[51]。 木柴燃燒排放的顆粒物會(huì)加劇肺功能惡化[52]。 燃油和燃煤飛灰排放的顆粒物也表現(xiàn)出毒性效應(yīng)[53-54]。Wang 等[55]研究發(fā)現(xiàn),SOA、柴油車尾氣和生物柴油車尾氣產(chǎn)生的顆粒物的ROS 生成水平與環(huán)境大氣顆粒物相當(dāng),甚至高于環(huán)境大氣顆粒物。 Charrier等[56]通過特制的源導(dǎo)向型采樣系統(tǒng)采集不同來源的顆粒,使用DTT 法測定了不同來源顆粒物的ROS生成水平,結(jié)果表明不同來源顆粒物的OPm具有顯著差異:香煙＞焚香＞機(jī)動(dòng)車尾氣＞室外大氣顆粒物樣品＞餐飲源＞室內(nèi)顆粒物樣品。 Daellenbach 等[57]通過評(píng)估瑞士多地大氣顆粒物的化學(xué)組成和OPDTT,并結(jié)合歐洲空氣質(zhì)量模型,提出歐洲大氣顆粒物質(zhì)量濃度來源與OPDTT來源并不相同,即降低顆粒物濃度的政策并不一定能降低顆粒物的氧化潛勢。 因此,對(duì)OPDTT的排放源進(jìn)行識(shí)別和定量是制定區(qū)域和城市人體健康保護(hù)措施的前提。

隨著近年來機(jī)動(dòng)車保有量的不斷增加,以機(jī)動(dòng)車排放顆粒物為代表的道路交通排放正日益受到全球的普遍關(guān)注。 大量的實(shí)驗(yàn)室模擬和外場觀測表明,柴油機(jī)顆粒(DEP)對(duì)OPDTT具有顯著貢獻(xiàn)(表2)。McWhinney 等[61]基于 DTT 法測定了 DEP 顆粒與城市背景點(diǎn)大氣顆粒物的ROS 生成水平,結(jié)果表明,DEP 顆粒的DTT 消耗速率比環(huán)境顆粒物的DTT 消耗速率高一個(gè)數(shù)量級(jí),且DEP 顆粒上81% ~92%的引發(fā)DTT 反應(yīng)的活性組分存在于水不溶相。 Shinyashiki 等[20]也報(bào)道了DEP 中水不溶性成分貢獻(xiàn)了DTT 活性的90%以上。 DEP 顆粒含有PAHs、硝基-PAHs(NPAHs)及含 S、N、O 雜原子的 PAHs 衍生物,一般認(rèn)為DEP 顆粒的氧化性和毒性來源于此,此外研究還發(fā)現(xiàn),DEP 的顆粒提取物具有致突變性和致癌性[15,63]。 根據(jù) Bates 等[4]的綜述,DEP 顆粒的OPDTT主要與發(fā)動(dòng)機(jī)參數(shù)、行駛工況、尾氣的光化學(xué)老化及燃料類型密切相關(guān)。 Fox 等[64]基于DTT 法對(duì)比了不同發(fā)動(dòng)機(jī)負(fù)荷對(duì)DEP 顆粒的ROS 生成能力的影響,結(jié)果表明降低發(fā)動(dòng)機(jī)負(fù)荷可以顯著降低顆粒的 OPDTT。 Li 等[15]采用 DTT 法對(duì)比了通入臭氧前后煙霧箱中DEP 顆粒的ROS 生成水平,發(fā)現(xiàn)新鮮和老化的顆粒物都具有引發(fā)ROS 生成的能力,且老化的OPDTT更高。 Verma 等[65]研究了美國洛杉磯地區(qū)夏季晝夜變化對(duì)道路交通大氣顆粒物OPDTT的影響,結(jié)果表明,下午(11:00—14:00,太平洋夏季時(shí)間)收集到的顆粒物OPDTT明顯高于早晨(6:00—9:00,太平洋夏季時(shí)間),顆粒物中水溶性有機(jī)碳(WSOC)和OPDTT呈顯著相關(guān),而WSOC 主要來自于大氣的二次反應(yīng)產(chǎn)物或生物質(zhì)燃燒。 Karavalakis等[66]也嘗試探索不同混合燃料對(duì)DEP 顆粒的ROS生成水平的影響,結(jié)果表明使用生物柴油混合燃料可以顯著降低排放顆粒的OPDTT。

表2 不同排放源顆粒物的DTT 活性匯總Table 2 The summary of DTT responses of PM from various emission sources

此外,道路交通排放和汽油車排放也常與OPDTT呈現(xiàn)明顯的相關(guān)關(guān)系。 Shirmohammadi 等[67]在美國洛杉磯盆地(3 條具有代表性的道路上和背景點(diǎn)南加利福尼亞大學(xué)內(nèi))利用移動(dòng)采樣平臺(tái)采集大氣顆粒物,結(jié)果顯示公路上顆粒物的OPDTT最大,高于背景點(diǎn)2.1 倍,且OPDTT與機(jī)動(dòng)車磨損排放的示蹤物具有強(qiáng)相關(guān)性。 Verma 等[68]發(fā)現(xiàn)美國亞特蘭大地區(qū)大氣顆粒物的污染來源與其OPDTT呈線性關(guān)系,并利用正定矩陣因子分解法(PMF)將OPDTT與其他顆粒物的化學(xué)組分濃度相結(jié)合,解析出機(jī)動(dòng)車排放對(duì)全年OPDTT均有貢獻(xiàn),所占比例為12% ~25%。 Yu 等[69]將我國北京市大氣細(xì)顆粒物的PMF源解析結(jié)果與OPDTT以及多元線性回歸模型相結(jié)合,有效地解析出4個(gè)OPDTT的貢獻(xiàn)源和貢獻(xiàn)率,分別為機(jī)動(dòng)車排放(35.4% ~63.7%)、二次硫酸鹽和工業(yè)排放(3.5% ~11.9%)、煤燃燒(13.8% ~32.8%)和揚(yáng)塵(3.5% ~40.6%)。 Bates 等[70]利用化學(xué)質(zhì)量平衡法(CMB)解析出不同來源對(duì)美國亞特蘭大地區(qū)大氣細(xì)顆粒物的貢獻(xiàn),再結(jié)合多元線性統(tǒng)計(jì)分析探討不同來源的顆粒物與OPDTT的相關(guān)性,結(jié)果表明輕型汽油車的OPm最高,其次是生物質(zhì)燃燒和重型柴油車。 以上研究表明,道路交通排放是OPDTT的重要來源,其中不同機(jī)動(dòng)車尾氣排放的OPDTT具有較大差異,因此未來工作可聚焦于機(jī)動(dòng)車燃料類型、道路車輛構(gòu)成及機(jī)動(dòng)車排放標(biāo)準(zhǔn)等方面對(duì)OPDTT影響的綜合評(píng)價(jià)上。

生物質(zhì)燃燒是OPDTT的另一類重要來源。 生物質(zhì)是僅次于煤炭、石油和天然氣的第四大能源,其燃燒過程可產(chǎn)生或伴生大量有毒有機(jī)污染物(如PAHs和醛類)[71]。 Verma 等[58]發(fā)現(xiàn)生物質(zhì)燃燒排放的有機(jī)氣溶膠(BBOA)與氧化程度較高的有機(jī)氣溶膠(MO-OOA),與 DTT 活性最相關(guān)。 Saffari 等[72]分別采集了2012年和2013年冬季希臘塞薩洛尼基地區(qū)的細(xì)顆粒物樣品,并分析了顆粒物上的化學(xué)成分與ROS 生成水平的關(guān)系,受2012年希臘經(jīng)濟(jì)危機(jī)影響,當(dāng)?shù)鼐用裨?012年取暖季時(shí)選擇了價(jià)格更為廉價(jià)的木柴來代替燃料油,研究結(jié)果表明,塞薩洛尼基地區(qū)2013年生物質(zhì)燃燒示蹤物(左旋葡聚糖和半乳聚糖)的濃度比2013年升高了2 倍~3 倍,顆粒物的ROS 生成水平與生物質(zhì)燃燒示蹤物線性相關(guān),證實(shí)了大量使用生物質(zhì)燃料會(huì)增加顆粒物的ROS 生成水平。 Verma 等[73]比較了美國南加利福尼亞州山林大火期間和火災(zāi)后大氣顆粒物中生物質(zhì)燃燒示蹤物(鉀離子和左旋葡聚糖)以及OPDTT的差異,也得到了類似的結(jié)論。 然而,Fushimi 等[62]發(fā)現(xiàn)不同生物質(zhì)(稻草、大麥秸稈、小麥秸稈和稻殼)燃燒排放顆粒物的OPm明顯低于機(jī)動(dòng)車排放來源。 此外,Vreeland等[74]發(fā)現(xiàn)路邊垃圾焚燒可顯著增加大氣細(xì)顆粒物的OPv,但該來源對(duì)顆粒物的OPm無明顯影響。

一些研究顯示揚(yáng)塵源也可能是OPDTT的重要來源。 Verma 等[68]發(fā)現(xiàn)夏季和秋季道路揚(yáng)塵對(duì)美國東南部地區(qū)大氣細(xì)顆粒物OPDTT的貢獻(xiàn)約為12%。Liu 等[75]對(duì)中國北京市沙塵天氣前后大氣顆粒物OPDTT對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),沙塵天氣發(fā)生時(shí)顆粒物中水溶性金屬元素增加,從而導(dǎo)致顆粒物的OPDTT顯著增加。 Secrest 等[76]研究了中國內(nèi)蒙古和四川地區(qū)使用家庭固體燃料排放的大氣細(xì)顆粒物對(duì)農(nóng)村婦女顆粒物暴露的影響,結(jié)果顯示揚(yáng)塵、生物質(zhì)燃燒和煤炭燃燒是室內(nèi)細(xì)顆粒物的主要來源,其中僅有揚(yáng)塵與OPm呈顯著正相關(guān),而后兩者則與OPm無相關(guān)性。 然而,Chirizzi 等[77]研究發(fā)現(xiàn)撒哈拉沙漠沙塵爆發(fā)對(duì)意大利東南部城市背景點(diǎn)(萊切環(huán)境氣候觀測站)大氣顆粒物OPDTT無顯著貢獻(xiàn)。 上述研究中,揚(yáng)塵源對(duì)顆粒物OPDTT影響的差異性主要與顆粒物的化學(xué)組成和老化程度有關(guān),首先撒哈拉沙漠沙塵對(duì)大氣顆粒物質(zhì)量濃度的貢獻(xiàn)可能主要集中于地殼元素、海鹽和胺類等不易產(chǎn)生氧化性的化學(xué)物質(zhì),因此不會(huì)對(duì)OPDTT產(chǎn)生顯著貢獻(xiàn)[6];其次,顆粒物老化會(huì)有助于硫酸銨等酸性物質(zhì)的形成,進(jìn)而加速金屬元素的溶解度增加 OPDTT[48],因此,Chirizzi 等[77]收集到的這次顆粒物可能較之于其他研究較為特殊。 此外,一些采樣點(diǎn)因其獨(dú)特的地理位置及產(chǎn)業(yè)模式,也會(huì)有一些顯著影響 OPDTT的其他排放源。 Wang等[13]基于PMF 法和多元線性回歸模型解析出泰國曼谷地區(qū)不同來源的顆粒物對(duì)OPDTT的貢獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)船舶排放對(duì)OPDTT的貢獻(xiàn)最高可達(dá)28%。 值得注意的是,Samake 等[78]發(fā)現(xiàn)生物氣溶膠也能夠顯著影響粗顆粒物的OPDTT,其中真菌孢子的ROS 生成水平是細(xì)菌的10 倍。 但考慮生物氣溶膠中包含來自化石燃料燃燒所產(chǎn)生的黑碳(BC)[4],且研究已證實(shí)黑碳具有較高的氧化還原活性[63],因此這種生物氣溶膠的源分擔(dān)可能并不準(zhǔn)確。

5 OPDTT 與健康效應(yīng)的關(guān)系(Relationship between health effect and OPDTT)

研究者發(fā)現(xiàn)利用模型估算的和實(shí)測的大氣顆粒物OPDTT,均與心肺系統(tǒng)健康效應(yīng)終點(diǎn)相關(guān)[1,3,70]。同時(shí)研究者也指出,相同健康效應(yīng)終點(diǎn)下,OPDTT表現(xiàn)出的相關(guān)性比顆粒物質(zhì)量濃度的相關(guān)性更強(qiáng)[1,3,70,79],且有研究發(fā)現(xiàn)顆粒物質(zhì)量濃度未表現(xiàn)出與效應(yīng)終點(diǎn)的相關(guān)性[70]。 這佐證了氧化應(yīng)激是大氣顆粒物導(dǎo)致人體健康效應(yīng)的核心機(jī)制假說[4]。 目前在流行病學(xué)中,使用呼出氣NO(fractional exhaled nitric oxide, FENO)作為OPDTT生物標(biāo)記物的研究越來越多,FENO通常作為臨床上判斷呼吸系統(tǒng)炎性效應(yīng)以及急性呼吸系統(tǒng)疾病(如哮喘)診斷的輔助指標(biāo)[2,79-80]。

在流行病學(xué)中,通常使用土地回歸模型和源-效應(yīng)多元回歸模型來估算大尺度和長時(shí)間的OPDTT。其估算過程如下:假設(shè)研究區(qū)域內(nèi)OPm(區(qū)域內(nèi)某一點(diǎn)測量值)在時(shí)間或空間上無顯著變化,該研究OPDTT即為該區(qū)域內(nèi)大氣顆粒物質(zhì)量濃度均值與OPm的乘積[4]。 Janssen 等[79]利用土地回歸模型估計(jì)了荷蘭境內(nèi)OPDTT,并選擇31 名健康成年人于境內(nèi)不同區(qū)域大氣顆粒物中暴露4 h,結(jié)果顯示4 h 內(nèi)OPDTT與 FENO存在顯著正相關(guān)性。 Yang 等[2]利用2009—2010年荷蘭與比利時(shí)的顆粒物組分觀測數(shù)據(jù)及土地回歸模型估算的OPDTT建立時(shí)間序列分析模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),OPDTT與哮喘發(fā)病率、哮喘患病率和鼻炎發(fā)病率呈顯著相關(guān),且對(duì)上述健康效應(yīng)終點(diǎn)來說,顆粒物每增加一個(gè)四分位距(μg·m-3)對(duì)應(yīng)的發(fā)病率分別增加1.10%、1.08%和1.15%,在多污染物模型中OPDTT與上述健康終點(diǎn)的相關(guān)性依然存在。 Bates 等[70]利用1998—2009年美國亞特蘭大的顆粒物組分連續(xù)觀測數(shù)據(jù)與相應(yīng)OPDTT及具體疾病效應(yīng)終點(diǎn)建立時(shí)間序列分析模型,發(fā)現(xiàn)OPDTT與呼吸醫(yī)院就診率、心血管疾病醫(yī)院就診率密切相關(guān),且這種相關(guān)性也體現(xiàn)在雙污染物模型中。

6 使用OPDTT 評(píng)估顆粒物健康效應(yīng)的局限性與挑戰(zhàn)(Limitations and challenges of OPDTT to evaluate PM health effects)

顆粒物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是顆粒物驅(qū)動(dòng)下游一系列信號(hào)途徑的起始事件,是其引發(fā)健康效應(yīng)的源頭。OPDTT僅體現(xiàn)了一種ROS 生成的化學(xué)機(jī)理,代表了顆粒物的化學(xué)氧化潛勢,并不能代表總的胞內(nèi)或胞外 ROS 生成量[81]。

顆粒物進(jìn)入呼吸系統(tǒng)后,對(duì)人體ROS 累積的貢獻(xiàn)可分為內(nèi)源性ROS(PM-induced ROS)和外源性ROS(PM-bound ROS)[82]。 其中內(nèi)源性 ROS 是指顆粒物沉積在呼吸系統(tǒng)中,進(jìn)入人體后通過參與機(jī)體內(nèi)的生物化學(xué)反應(yīng)(即酶促反應(yīng)或免疫反應(yīng)),誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過量ROS,其濃度水平反映了顆粒物的生物氧化性[11,83],因此該部分ROS 的評(píng)估通?；趧?dòng)物細(xì)胞模型開展,目前3 種最常見的細(xì)胞模型包括生長在氣管和肺泡部分的表皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹狀細(xì)胞。 但基于細(xì)胞模型的氧化潛勢測定方法通常表現(xiàn)出周期長、穩(wěn)定性差、測定結(jié)果易受細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型的影響等缺點(diǎn),受環(huán)境影響不可控。

外源性ROS 主要是指具有氧化活性的成分(如過渡金屬及醌類等物質(zhì))隨顆粒物直接進(jìn)入機(jī)體靶器官,在O2存在下通過Fenton 反應(yīng)及半醌自由基的氧化還原過程而產(chǎn)生過量的ROS,其濃度水平反映了顆粒物的化學(xué)氧化性。 而DTT 法正是基于非細(xì)胞體系評(píng)價(jià)顆粒物化學(xué)氧化潛勢的方法,它的出現(xiàn)使得研究者能夠快速靈敏地檢測顆粒物組分的氧化性能[6]。 此外顆粒物本身還可能攜帶一定量的ROS,該部分ROS 也屬于外源性ROS,如木材燃燒與機(jī)動(dòng)車尾氣等一次排放以及烴類前體物發(fā)生的光化學(xué)氧化反應(yīng)等二次排放均能產(chǎn)生一定量的ROS[83-84],最近瑞士保羅謝勒研究所的研究者利用高分辨率X 射線顯微鏡觀察到這些ROS 可以在干燥環(huán)境下(相對(duì)濕度低于60%,20 ℃)穩(wěn)定沉積于顆粒物中,加劇大氣顆粒物暴露風(fēng)險(xiǎn)[85]。 但由于大部分ROS的反應(yīng)活性極強(qiáng),半衰期非常短,直接測定較為困難,通常采用熒光探針對(duì)該部分ROS(顆粒物本身攜帶的ROS)進(jìn)行捕獲,并通過測定氧化副產(chǎn)物的光譜實(shí)現(xiàn)對(duì)ROS 濃度的估測,常見的熒光探針主要有二氯二氫熒光素(DCFH)探針、氨基苯基熒光胺(APF)探針和10-乙?；?3,7-二羥基吩嗪(Amplex Red)探針等[4,86]。

因此,OPDTT與生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)(如細(xì)胞毒性、炎癥響應(yīng)和氧化應(yīng)激標(biāo)志物等)之間的關(guān)系存在不太統(tǒng)一甚至完全對(duì)立的觀點(diǎn)。 例如,Akhtar 等[81]采用DTT 法評(píng)估了加拿大多倫多市區(qū)大氣顆粒物的ROS 生成水平,并分別進(jìn)行了人肺泡上皮細(xì)胞(A549)的細(xì)胞存活率和白細(xì)胞介素-8(IL-8)含量測試,結(jié)果顯示OPDTT與上述2個(gè)生物學(xué)效應(yīng)指標(biāo)之間相關(guān)性較差。 然而,Velali 等[87]通過對(duì)希臘塞薩洛尼基地區(qū)大氣顆粒物的氧化性及細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)OPDTT與細(xì)胞存活率及乳酸脫氫酶(LDH)活性呈顯著相關(guān)性。 顆粒物在細(xì)胞水平上產(chǎn)生的毒性和人體健康的負(fù)面效應(yīng)在一定程度上是由于顆粒物上存在較強(qiáng)的催化生成ROS 的能力。 然而OPDTT僅代表大氣顆粒物與硫醇之間的孤立化學(xué)反應(yīng),而細(xì)胞測定法則更多涉及顆粒物暴露后的生理過程。

可以預(yù)見,未來顆粒物氧化潛勢的評(píng)估將會(huì)從內(nèi)源性ROS 和外源性ROS 整體出發(fā),集合細(xì)胞及非細(xì)胞方法(DTT 法、熒光探針等),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)顆粒物健康效應(yīng)的源頭把控,因此在我國開展大氣顆粒物氧化潛勢的研究,定量不同排放源的OPDTT及其對(duì)環(huán)境大氣顆粒物OPDTT的貢獻(xiàn),對(duì)于制定保護(hù)人體健康的源頭減排政策,具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 目前國內(nèi)外DTT 標(biāo)準(zhǔn)化流程尚不統(tǒng)一(反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和顆粒物萃取方式等),難以對(duì)全球范圍內(nèi)不同研究獲得大氣顆粒物OPDTT觀測結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)比較,因此未來亟需制定標(biāo)準(zhǔn)化方法,保證OPDTT數(shù)據(jù)的可比性[11]。 此外,OPDTT指標(biāo)對(duì)顆粒物的健康效應(yīng)解釋遠(yuǎn)比顆粒物質(zhì)量濃度更直接,但是在大尺度區(qū)域及長時(shí)間序列的調(diào)查背景下,往往需要相應(yīng)的模型來估算OPDTT,而該類相關(guān)研究在國內(nèi)開展較少[4]。