郭 放 楊 強

腦膠質(zhì)瘤是老年人神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性腫瘤疾病，浸潤性生長，具有高復發(fā)率、高致殘率以及高死亡率等兇險的臨床特點，已經(jīng)成為我國公共健康問題之一[1]。臨床上人腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段仍為手術(shù)切除，但是其預后較差[2]。目前，由于靶基因藥物治療的研究深入發(fā)展，尋找新的藥物靶點的基因治療也為膠質(zhì)瘤的治療手段開辟了新的路徑。研究證實微小RNA(microRNA，miRNA)可廣泛參與肝癌、胃癌、肺癌以及腦膠質(zhì)瘤等多系統(tǒng)腫瘤疾病的病理過程，已經(jīng)成為近年來腫瘤疾病研究領域的熱點[3-6]。既往研究顯示，miRNA-34a通過作用Wnt信號通路抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長[7]；miRNA-145可抑制膠質(zhì)瘤細胞干性基因的表達從而抑制腫瘤發(fā)展[8]；miRNA-150則可通過靶向TGF-β抑制腦腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[9]。三者均可在分子層面上抑制膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)展，且有成熟的分子機制作為基礎，提示三者為潛在的腦膠質(zhì)瘤臨床診斷標志物，但尚未有詳細報道，故本研究擬采用PCR檢測miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335在不同級別膠質(zhì)瘤患者和正?；颊吣X脊液中的表達，同時采用秩相關分析miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335與不同腫瘤級別的相關性，為探索膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制及治療靶點提供新的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

選取2014年5月至2018年5月我院神經(jīng)外科經(jīng)病理診斷為膠質(zhì)瘤腦脊液63例，年齡20～75歲，男性34例，女性29例；選取同期非顱內(nèi)腫瘤患者腦脊液標本為對照組20例，年齡20～75歲，男性11例，女性9例。根據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類要求將病例組分為：Ⅰ級15例，Ⅱ級17例，Ⅲ級18例，Ⅳ級13例。根據(jù)病理類型分為：星形細胞膠質(zhì)瘤31例，少突膠質(zhì)細胞瘤17例，室管膜瘤15例。排除標準：排除患有類風濕、其他惡性腫瘤疾病、糖尿病及甲亢等疾病的患者。兩組患者腦脊液樣本采集檢測均告知患者及家屬，并且患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 PCR法檢測腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145和miRNA-335的表達

使用Trizol試劑盒(Invitrogen，Waltham，MA USA)從腦脊液中提取總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒(Takara，Otsu，Japan)進行逆轉(zhuǎn)錄以將mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA。用SYBR Green Real-Time PCR Master Mixes(ThermoFisher，Waltham，MA USA)進行實時PCR。將miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達量標準化到GAPDH以獲得相對表達量。使用miScript SYBR Green PCR Kit(Qiagen)對miRNA210進行實時PCR，并將表達量標注化到U6以獲得相對表達量。相關引物如表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計分析

研究結(jié)果分別采用2組獨立樣本t檢驗以及spearman相關性統(tǒng)計方法進行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，研究數(shù)據(jù)應用SPSS 19.0軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335水平的比較

采用PCR檢測不同腫瘤級別的患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平，結(jié)果提示與對照組相比，病例組腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平顯著降低(t=14.605，P<0.001；t=16.447，P<0.001；t=9.822，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 兩組患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335含量比較

2.2 不同級別膠質(zhì)瘤患者的腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平的比較

根據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類要求將病例組分為Ⅰ～Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者，其中Ⅰ～Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤患者，Ⅲ～Ⅳ為高級別膠質(zhì)瘤患者。采用PCR檢測患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平，結(jié)果提示與低級別膠質(zhì)瘤組相比，高級別膠質(zhì)瘤患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的水平顯著降低(t=5.569，P<0.001；t=4.000，P<0.001；t=6.875，P<0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義，具體見表3。

表3 不同級別膠質(zhì)瘤患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335含量比較

2.3 腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335與膠質(zhì)瘤分級的相關性

將腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達與不同膠質(zhì)瘤腫瘤級別進行Spearman相關分析，結(jié)果顯示，腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335均與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤級別呈顯著負相關(γs=-0.539，P<0.001；γs=-0.571，P<0.001；γs=-0.603，P<0.001)。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計，惡性膠質(zhì)瘤約占原發(fā)性惡性腦腫瘤的70%，年發(fā)病率約為5/10萬，惡性腦膠質(zhì)瘤5年生存率不足10%[10]。腦膠質(zhì)瘤多呈浸潤性生長，手術(shù)全切難度大，術(shù)后放、化療效果差。因此如何早期診斷、判斷腫瘤分級對于膠質(zhì)瘤預后有著至關重要的作用。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，可與靶mRNA的3'-UTR端配對結(jié)合，從而可顯著抑制靶mRNA的翻譯，最終可廣泛參與機體內(nèi)的生理活動[11]。研究證實，多種miRNAs的表達水平可在腫瘤疾病中發(fā)生顯著的改變，可在膠質(zhì)瘤細胞的生長、增殖、凋亡和侵襲等生理活動中起到重要的作用[12-14],并可調(diào)節(jié)替莫唑胺化療敏感性[15]。其中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335為研究報道與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的3種miRNA，研究證實在膠質(zhì)瘤中，miRNA-34a可通過阻滯細胞周期有G1向S期轉(zhuǎn)化從而顯著抑制U251膠質(zhì)瘤細胞的過度增殖[16]，腫瘤細胞內(nèi)miRNA-34a的表達異常與細胞增殖及凋亡相關。在神經(jīng)母細胞瘤中，染色體1p的雜合缺失導致miRNA-34a表達減少，進而引起腫瘤異常增殖及侵襲能力減弱,miRNA-34a可以通過AKT和Wnt信號通路抑制腦膠質(zhì)瘤細胞增殖[17]。涂其武等研究顯示，在膠質(zhì)瘤細胞中miRNA-34a下調(diào)MMP2(中基質(zhì)金屬蛋白酶2,matrix metalloproteinase 2),進而抑制細胞侵襲和遷移能力[18]。miRNA-145在人體多種腫瘤中低表達，如結(jié)直腸癌、肝癌、胃癌和神經(jīng)母細胞瘤等[19]，上調(diào)miRNA-145可顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[20]，韓鋮琛等[21]研究表明，膠質(zhì)瘤組織miRNA-145呈低表達，上調(diào)miRNA-145表達能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞系U251細胞增殖能力并誘導U251細胞凋亡。這提示miRNA-145有可能成為膠質(zhì)瘤治療的靶點。miRNA-335同樣在抑制膠質(zhì)瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[9]，提示三者為人膠質(zhì)瘤患者的潛在診斷標志物，但尚未由詳細的臨床診斷研究報道。既往多數(shù)研究集中于血漿miRNA檢測，但血漿中所含蛋白種類和濃度相對較高，雖然腦脊液標本來源不易，但正是由于標本的特殊性，腦脊液中所含蛋白的模式比血液簡單得多，miRNA檢測的干擾因素相對較少，能更好篩選標志物，便于重復和統(tǒng)一。袁平等[22]采用熒光定量PCR檢測20例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者和20例非膠質(zhì)瘤患者的腦脊液候選標志物水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-21在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達顯著高于健康人群，而miRNA-128在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達顯著低于健康對照組，miRNA-21和miRNA-128聯(lián)合診斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靈敏度和特異度均為100%，認為腦脊液中miRNA-21和miRNA-128可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤潛在的早期診斷標志物。而張青等研究顯示膠質(zhì)瘤患者腦脊液miRNA-221、miRNA-222表達明顯高于健康人群，高級別膠質(zhì)瘤患者其表達水平同樣也高于低級別膠質(zhì)瘤患者，且兩者聯(lián)合診斷腦膠質(zhì)瘤的特異度和敏感度均較高[23]。陳欣等也得出類似結(jié)論[24]。

本研究采用PCR技術(shù)檢測兩組患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335，并且通過相關統(tǒng)計分析進一步驗證miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335在膠質(zhì)瘤患者中的表達與腫瘤級別相關性，以期為膠質(zhì)瘤患者的診斷及藥物靶點治療提供新的方向。研究顯示3種miRNA分子的研究基礎主要集中在腫瘤細胞或組織標本中，但既往研究提示miRNA的表達水平在疾病患者腦脊液和腦組織標本中的表達趨勢基本一致，如阿爾茲海默癥[25]，再者考慮此次研究的初衷是探討三者作為人腦膠質(zhì)患者的診斷標志物的可能性，二腦脊液的診斷在臨床中較為成熟，故在本次研究中，筆者收集的標本為腦膠質(zhì)瘤患者、良性腫瘤的腦脊液以及健康對照組的腦脊液。我們研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤患者腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達水平顯著低于正?；颊?，其在腦脊液中的表達水平可能可以作為診斷膠質(zhì)瘤的輔助手段。且不同級別膠質(zhì)瘤患者腦脊液miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335存在差異，且膠質(zhì)瘤級別越高，miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335表達水平越低，提示三者在腫瘤發(fā)生發(fā)展的抑制作用以及作為臨床人腦膠質(zhì)瘤患者的潛在診斷標志物可能性，并有助于術(shù)中進一步判斷切除范圍及術(shù)后放化療的輔助指導。其中miRNA-145的變化與先前研究在膠質(zhì)瘤細胞中的表達變化是一致的[21]，既往研究已提示miRNA-335作為診斷急性腦卒血患者的潛在血清標志物[26]，而我們的研究為miRNA-335提供了一個新的靶點身份，擴充了miRNA-335的診斷功能；同時我們通過秩相關分析檢測腦脊液中miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335的表達，發(fā)現(xiàn)其分別與膠質(zhì)瘤級別呈負相關。這些結(jié)果也進一步說明下調(diào)的miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA335可參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生及浸潤過程，并且可能與膠質(zhì)瘤的病理級別有關，同時也為膠質(zhì)瘤的診療標記物提供了新的思路。

然而，本次的研究仍有一定的局限性，由于樣本來源不易，導致樣本數(shù)偏少，樣本例數(shù)有待進一步擴充，尤其是顱內(nèi)良性腫瘤；此外由于獲取患者腦脊液樣本的風險較大，臨床志愿者人數(shù)較少，尚未能進行統(tǒng)計學意義的隨訪比較，有待在后續(xù)工作進行討論；下一步我們將納入其他miRNA檢測研究，綜合分析，全面了解腦膠質(zhì)瘤患者組織及腦脊液miRNA的差異；進一步分析miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335與腦膠質(zhì)瘤具體的作用機制；選取相同疾病的不同來源(腦膠質(zhì)瘤病理組織、血液)檢測miRNA表達水平，并與腦脊液miRNA表達水平進行比較，進行相關性分析，橫向?qū)Ρ龋瑸槟X脊液miRNA判斷術(shù)前膠質(zhì)瘤病理分級提供確切依據(jù)。綜上所述，miRNA-34a、miRNA-145以及miRNA-335水平在膠質(zhì)瘤患者腦脊液中顯著下降，且膠質(zhì)瘤級別越高，miRNA-34a、miRNA-145、miRNA-335表達水平越低，可能可以作為診斷腦膠質(zhì)瘤及術(shù)前判斷病理分級的輔助方法。