黨 利 王長爽 王 帥

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也稱為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM)，是最致命和最常見的腦腫瘤形式之一，多發(fā)于40～60歲年齡段的人群[1,2]。大約 80% 的 GBM 腫瘤位于大腦半球，只有不到 5%的GBM腫瘤位于小腦、腦干和脊髓[3]。雖然目前臨床上對于GBM的治療研究已經(jīng)有了大量的進(jìn)展，但是其五年存活率依然令人沮喪。這其中一個重要原因是GBM的高復(fù)發(fā)性和較強(qiáng)的藥物耐受[4,5]。造成GBM的高復(fù)發(fā)和藥物耐受的主要原因是GBM通常以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSCs)的存在為特征[6]。而目前已經(jīng)有很多研究表明GSCs與GBM的復(fù)發(fā)與耐藥有關(guān)，此外由于其存在于血管周圍而難以靶向造成腫瘤細(xì)胞的持續(xù)更新[6-8]。

GSCs細(xì)胞通過多種信號通路維持其干細(xì)胞狀態(tài)[7,9]，這其中越發(fā)引起研究者注意的一條信號通路就是Wnt信號通路。目前已有研究報道Wnt信號通路的失調(diào)與神經(jīng)元來源的體細(xì)胞惡性腫瘤相關(guān)[10]。Wnt信號通路作為細(xì)胞間交流、細(xì)胞命運(yùn)決定和細(xì)胞遷移的重要調(diào)節(jié)因子。Wnt信號失調(diào)通常與其重要的組成原件突變有關(guān)，而Wnt信號的失調(diào)常常與癌癥相關(guān)。異常的Wnt信號在多種癌癥均有發(fā)現(xiàn)，通常表現(xiàn)為Wnt信號的異常激活從而造成其下游基因的大量轉(zhuǎn)錄。

本研究基于臨床病例的表達(dá)量檢測和TCGA數(shù)據(jù)庫分析揭示出ICP22BP在GBM癌組織中的表達(dá)量顯著高于在GBM癌旁組織中的表達(dá)量。此外我們還證明 ICP22BP通過影響Wnt信號通路從而促進(jìn)GBM細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞增殖。這為后續(xù)GBM的治療研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 GBM病例收集

本研究于2018年1月至2020年12月在河南大學(xué)附屬醫(yī)院采集了86例GBM患者的臨床樣本。該GBM患者隊(duì)列的人口統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如表1所示。本試驗(yàn)獲得河南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均獲得書面知情同意。

表1 GBM患者樣本特征

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

將A172細(xì)胞維持在含有10%FBS(GETMHyclone，Utah,U.S)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素(SH30010，GETMHyclone，Utah,U.S)的完全DMEM培養(yǎng)基中，并在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃和 5%CO2)。

A172細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前一天進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以達(dá)到30%～50%的匯合度。使用終濃度為50 nM Lipofect-amine 2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染混合液孵育4 h后，使用完全培養(yǎng)基換液，48 h后檢測基因表達(dá)情況和細(xì)胞增殖。

1.3 實(shí)時熒光定量PCR

采用Trizol(15596018,Life Technologies,USA)法提取全細(xì)胞RNA，然后使用BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒(Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)將RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(D7260,Beyotime Biotechnology,Shanghai,China)試劑盒用于進(jìn)行實(shí)時PCR檢測。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法計(jì)算。引物序列見表2。

表2 不同基因的引物序列

1.4 蛋白質(zhì)印跡分析

應(yīng)用BeyoLyticTM哺乳動物活性蛋白提取試劑(Beyotime Biotechnology，上海，中國)提取細(xì)胞和組織總蛋白。然后用30～40 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白轉(zhuǎn)膜。然后將轉(zhuǎn)移的NC膜與相應(yīng)的一抗：anti-ICP22BP(ab247013，abcam，USA)和anti-GAPDH(ab8245，abcam，USA)(1∶500)在 4℃下孵育過夜。

1.5 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

將消化后各組細(xì)胞鋪96孔板，每孔1×104個細(xì)胞。各時間點(diǎn)(0 h、24 h、48 h、72 h)收集細(xì)胞，加入10 ml CCK8溶液單液細(xì)胞增殖檢測液。孵育4 h后，使用酶標(biāo)儀檢測OD492的吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均采用T檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)分析軟件為GraphPad Prism 6，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ICP22BP基因在GBM腫瘤組織中高表達(dá)

通過對于GBM TGCA和GETX數(shù)據(jù)中ICP22BP的mRNA表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)與正常腦部組織相比，GBM腫瘤組織中ICP22BPmRNA表達(dá)水平顯著升高(圖1A)。為了進(jìn)一步確定，收集的86例GBM患者病例樣本中對比癌旁組織中和GBM腫瘤組織中ICP22BP mRNA表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示，ICP22BP在GBM患者病例樣本的癌旁組織和GBM腫瘤組織中表達(dá)趨勢與數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果一致：GBM腫瘤組織中的ICP22BP mRNA表達(dá)水平要顯著高于癌旁組織(圖1B)。隨機(jī)取3例GBM患者病例樣本的癌旁組織和GBM腫瘤組織進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)，分析ICP22BP蛋白表達(dá)水平趨勢。蛋白質(zhì)印跡分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ICP22BP蛋白表達(dá)水平趨勢與mRNA水平表達(dá)一致(圖1C)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ICP22BP基因在GBM腫瘤組織顯著高表達(dá)。提示，ICP22BP基因可能是作為促癌基因在GBM中存在。

注：A為對于TCGA數(shù)據(jù)庫中GBM腫瘤組織樣本和GETX數(shù)據(jù)樣本中ICP22BP的mRNA 表達(dá)水平；B為收取的86例GBM病例樣本中癌旁組織和腫瘤組織中ICP22BP的mRNA 表達(dá)水平；C為收取的86例GBM病例樣本中隨機(jī)取3例的癌旁組織(P-1,P-2,P-3)和腫瘤組織(T-1,T-2,T-3)中ICP22BP的蛋白表達(dá)水平。圖1 ICP22BP的mRNA表達(dá)水平

2.2 敲低ICP22BP表達(dá)顯著抑制GBM細(xì)胞的細(xì)胞增殖

ICP22BP在GBM腫瘤組織中呈顯著高表達(dá)，推測ICP22BP基因可能是作為促癌基因在GBM中存在。為了驗(yàn)證這個猜想，在GBM細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞中通過siRNA敲低ICP22BP的表達(dá)。如圖2A&B所示，通過siRNA成功敲低了ICP22BP的表達(dá)。隨后細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ICP22BP的表達(dá)減少會顯著抑制A172細(xì)胞的細(xì)胞增殖(圖2C)。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，ICP22BP基因可以促進(jìn)A172細(xì)胞的增殖。這與：“ICP22BP基因可能是作為促癌基因在GBM中存在”一致。

注：A&B為A172細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP處理48 h后，ICP22BP的蛋白(A)和mRNA(B)表達(dá)水平；C為A172細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP處理細(xì)胞增殖速率；D為A172細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-NC和siRNA-ICP22BP處理48 h后,wnt信號通路下游相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平。圖2 ICP22BP表達(dá)對GBM細(xì)胞增殖的影響

2.3 ICP22BP基因與wnt信號通路在A172細(xì)胞中的相互作用

之前研究報道，wnt信號通路的失調(diào)在GBM發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。具體表現(xiàn)特征是wnt信號通路在GBM腫瘤組織中異常激活。由于ICP22BP在GBM腫瘤組織中高表達(dá)，猜測ICP22BP可能與wnt信號通路在ICP22BP中出現(xiàn)互作。為了驗(yàn)證這個猜想，在A172細(xì)胞中敲低ICP22BP的表達(dá)，觀察ICP22BP基因表達(dá)量下降對于wnt信號通路下游相關(guān)基因表達(dá)的影響。qPCR結(jié)果顯示，在A172細(xì)胞中敲低ICP22BP的表達(dá)可以顯著抑制wnt信號通路下游相關(guān)基因(cMYC，c-JUN,WISP1和PPARD)表達(dá)。這表明，ICP22BP基因與wnt信號通路在GBM細(xì)胞中存在相互作用。

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM)，作為最致命和最常見的腦腫瘤形式之一，目前臨床上有效的治療手段還十分有限。究其原因，主要還是我們對于GBM發(fā)病機(jī)理和發(fā)生發(fā)展過程中相關(guān)分子機(jī)制了解十分有限?；诖宋覀兺ㄟ^對于TCGA和GETX數(shù)據(jù)中GBM相關(guān)基因表達(dá)信息進(jìn)行分析，以期能夠找到新的線索。我們發(fā)現(xiàn)ICP22BP這一基因在GBM腫瘤組織中的異常高表達(dá)，提示我們這一基因可能在GBM中行駛促癌基因功能。同時我們在對于GBM患者相關(guān)臨床樣本驗(yàn)證中也證明了，ICP22BP這一基因在GBM腫瘤組織中的異常高表達(dá)。同時在敲低ICP22BP基因時發(fā)現(xiàn)會顯著抑制GBM細(xì)胞系A(chǔ)172細(xì)胞的細(xì)胞增殖。這些數(shù)據(jù)表明，ICP22BP這一基因可能在GBM中行駛促癌基因功能。

wnt信號通路分為經(jīng)典wnt信號通路和非經(jīng)典wnt信號通路，其中經(jīng)典wnt信號通路轉(zhuǎn)錄的相關(guān)下游基因：cMYC，c-JUN,WISP1和PPARD等，常常與癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)[11-14]。這與我們的發(fā)現(xiàn)一致：下調(diào)ICP22BP基因的表達(dá)可以顯著抑制經(jīng)典wnt信號通路下游基因的轉(zhuǎn)錄。這也從側(cè)面驗(yàn)證ICP22BP基因是通過調(diào)節(jié)經(jīng)典wnt信號通路從而影響GBM細(xì)胞A172細(xì)胞的細(xì)胞增殖。這其中相關(guān)具體的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究中并沒有研究。這也是我們后續(xù)的研究重點(diǎn)：找出ICP22BP基因調(diào)節(jié)經(jīng)典wnt信號通路潛在分子機(jī)制。

綜上所述，本研究證明了ICP22BP基因在GBM腫瘤組織中高表達(dá)。同時ICP22BP基因通過調(diào)節(jié)經(jīng)典wnt信號通路從而影響GBM細(xì)胞A172細(xì)胞的細(xì)胞增殖。這為GBM的后續(xù)病理機(jī)制相關(guān)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。