葉敏倩， 駱曉慧， 吳 洲， 薛加雯， 包佳潔， 吳莎萍， 何志平， 吳峰華

(浙江農林大學食品與健康學院，杭州 311300)

山核桃(CaryaCathayensisSarg)又名小胡桃，屬胡桃科山核桃屬，生長在氣候優(yōu)越、土壤肥沃、植被茂盛的自然環(huán)境中，主要分布于浙江臨安、安吉、淳安以及安徽寧國、績溪等地，是一種我國特有的名優(yōu)干果和木本油料作物[1]。其果仁不僅含有豐富的蛋白質和油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，還富含多種人體必需的氨基酸和礦物質，具有較高的營養(yǎng)價值[2]。除此之外，山核桃仁含有大量的多酚、維生素E、植物甾醇等活性成分[3]，研究表明這些物質對提升人體抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、提高免疫力有益[4-6]。

山核桃仁原料本身風味不足，但烘烤過程中發(fā)生的美拉德反應、蛋白質和氨基酸降解等可產生吡嗪、吡咯等多種揮發(fā)性風味成分[7，8]，賦予其特殊的香味。但烘烤也會使堅果中的不飽和脂肪酸加速氧化，積聚對人體有害的過氧化物[9]。研究表明，溫度和時間是堅果烘烤的最關鍵因素，不僅決定風味品質，還能影響堅果中維生素E、甾醇等功能成分[10]。目前，貯藏與加工過程對山核桃品質的影響已有文獻報道[11，12]，但烘烤條件對山核桃理化品質及風味成分的影響卻鮮有報道[13]。本實驗設計9組溫度和時間組合的烘烤條件對山核桃仁進行加工，探究烘烤條件對生育酚、植物甾醇、色澤等理化指標的影響，同時利用頂空固相微萃取與氣相色譜-質譜聯用技術(SPME-GC-MS)結合偏最小二乘判別分析(partial least square-discrimination analysis, PLS-DA)建立不同烘烤條件的山核桃仁風味物質的判別模型，以期為優(yōu)化山核桃的烘烤條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山核桃于2019年9月中旬采自浙江省杭州市臨安區(qū)的昌化山區(qū)，挑選直徑為1.95～2.05 cm且顆粒飽滿、無病害山核桃，于20～30 ℃下自然晾曬4 d，裝袋備用。

α、β、γ、δ-生育酚和膽甾烷醇標準品為色譜級。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜(配有可變波長紫外檢測器)，GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜-質譜聯用儀，MB45紅外快速水分測定儀，HD-3A智能水分活度測量儀，CR-10色差儀。

1.3 方法

1.3.1 山核桃仁的烘烤

手工剝出山核桃仁后，挑選顆粒完整的核桃仁進行烘烤。在預實驗的基礎上，以感官評價為依據，設計9組烘烤條件：130 ℃(低溫，LT)烤40 min(LT1)、50 min(LT2)、60 min(LT3)；145 ℃(中溫，MT)烤30 min(MT1)、35 min(MT2)、40 min(MT3)；160 ℃(高溫，HT)烤20 min(HT1)、23 min(HT2)、26 min(HT3)。將未烘烤的山核桃仁樣品設置為對照組。

1.3.2 含水量和水分活度的測定

含水量和水分活度分別采用水分活度儀和遠紅外水分測定儀進行測定。

1.3.3 顏色分析

將完整山核桃仁用色差儀進行測量，將未烘烤過的山核桃作為參照(L，a，b=0)，計算得處理組山核桃的ΔL、Δa、Δb值。

1.3.4 甾醇的測定

樣品預處理[14，15]：稱取1.5 g山核桃仁粉末，加入1 mL 0.5 mg/mL膽甾醇內標，在80 ℃下用15 mL 1 mol/L甲醇-氫氧化鉀冷凝回流1 h。冷卻后，將不皂化物用25 mL蒸餾水和150 mL石油醚洗滌。然后，45 ℃減壓濃縮，揮干石油醚，將殘留物溶于8 mL正己烷中并用氮氣吹干。最后，用2 mL正己烷溶解提取物，過0.45 μm濾膜，進行GC-MS分析。

GC條件：SH-Rtx-Wax色譜柱(30.0 m× 0.25 mm, 0.25 μm)，柱溫升溫程序：230 ℃保持2 min，以5 ℃ min/L的速率升至250 ℃，保持74 min；進樣口溫度250 ℃；載氣流速1 mL/min；載氣∶氦氣；分流比為15∶1。MS條件：離子源溫度為230 ℃，接口溫度為250 ℃，掃描質量范圍50～500m/z。

1.3.5 生育酚測定

生育酚測定的前處理參考GB 5009.82—2016[16]的方法。

液相色譜條件：C18-WP色譜柱(4.6 m×250 mm, 5 μm)，等度洗脫(甲醇∶水= 98∶2 )，流速為1.0 mL/min。進樣量10 μL，柱溫25 ℃，檢測波長294 nm。通過外標法，確定生育酚組分與含量。

1.3.6 SPME-GC-MS測定揮發(fā)性成分[17-19]

SPME條件: 分別取0.5 g 山核桃仁粉末置于頂空瓶中，用隔墊密封。將頂空瓶置于 60 ℃平衡 20 min，插入已活化好的SPME萃取頭 ( 270 ℃，30 min) ，在60 ℃ 下吸附40 min，在250 ℃ 下解析5 min。

GC條件：Rxi-5 MS色譜柱(30.0 m×0.25 mm, 0.25 μm)，柱溫升溫程序：初始溫度30 ℃ ，保持1 min，以7 ℃/min升到130 ℃，以3 ℃/min升到180 ℃，保持1 min，最后以10 ℃/min升到 240 ℃，保持5 min; 進樣口溫度250 ℃; 載氣流速 1 mL/min; 載氣：氦氣；進樣方式: 不分流。

MS條件：電子轟擊離子源 ( EI) ，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描質量范圍33～373m/z。

通過GC-MS，利用全掃描模式對各樣品的香氣成分進行測定，得到總離子流圖。采用NIST08和NIST08S標準圖譜庫進行檢索鑒定，篩選匹配度達到90%以上的化合物。根據峰面積歸一法得到各香氣成分的相對含量。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均設3次重復，結果以平均值±標準差表示；采用SPSS 22.0對數據進行差異顯著性分析(P=0.05)；采用SIMCA-P 11.5對山核桃仁揮發(fā)性成分進行PLS-DA。

2 結果與討論

2.1 烘烤條件山核桃仁水分、水分活度和顏色的影響

如表1所示，烘烤前山核桃仁的平均含水量為4.72%，水分活度為0.53。山核桃仁含水量和活度會隨烘烤時間和溫度的增加而降低，但在長時間的烘烤下，含水量和水分活度最終趨于穩(wěn)定且無顯著差異(P>0.05)。顏色是評價堅果品質的一個重要指標[19，20]。山核桃高溫烘烤后顏色由亮紅色變成暗紅色，ΔL、Δa、Δb均為負值，烘烤溫度和時間對山核桃仁亮度有顯著影響。這是因為在烘烤過程中，山核桃易發(fā)生美拉德反應，產生棕色的新化合物[18]。澳洲堅果果仁[21]和波蘭榛子[18]在焙烤過程中也會發(fā)生類似的變化。

表1 烘烤條件對山核桃仁的水分、水分活度和色澤的影響

2.2 山核桃仁的甾醇組成

如表2所示，山核桃仁中共檢測出5種植物甾醇，其中β-谷甾醇含量最高，為117.81 mg/100 g，這與Ryan等[21]對核桃中植物甾醇的研究結果一致。山核桃原料的總甾醇含量為167.71 mg/100 g，高溫烘烤對山核桃的總甾醇含量無顯著影響(P>0.05)。徐貴華等[22]對植物油中甾醇的高溫穩(wěn)定性研究表明，菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇在180 ℃條件下仍具有很強的穩(wěn)定性。

表2 烘烤條件對山核桃仁中甾醇的影響

2.3 生育酚

由表3可知，γ-生育酚是山核桃中主要的生育酚，占總量的80%以上，其次為α-生育酚、δ-生育酚、β-生育酚。山核桃經過高溫烘烤，α、β、γ和δ生育酚含量均顯著下降，并且隨烘烤時間的增加，其含量呈下降趨勢。Stuetz等[23]研究也發(fā)現，

表3 烘烤條件對山核桃中生育酚的影響

榛子、杏仁和核桃分別在140 ℃和160～170 ℃進行低溫長時間和高溫短時間烘烤，α和γ-生育酚含量均顯著下降。生育酚是一類熱穩(wěn)定較好的化合物，烘烤過程中生育酚的損失，可能是由于氧化反應引起的[24]。

2.4 多元統計分析山核桃仁揮發(fā)性成分

2.4.1 烘烤后山核桃仁揮發(fā)性成分分析

本研究共檢測出山核桃仁中的111種揮發(fā)性成分，在除去含硅化合物、烷烴類和烯烴類化合物后，對其中主要的65種成分進行分析。如表4所示，生山核桃的揮發(fā)性成分主要是醇、醛和酯類；烘烤后的山核桃主要為酯、酮以及雜環(huán)類化合物。有研究表明，蛋白質中的蘇氨酸、絲氨酸以及含氮的雜環(huán)類化合物在受熱后能降解生成具有特殊風味的揮發(fā)性成分[9]，其中以吡嗪、呋喃和吡咯等最多，而這類揮發(fā)性化合物對烘烤堅果的風味具有較大影響[13]。山核桃仁在烘烤過程中產生的吡嗪類化合物主要為2,5-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2-乙基-5-甲基吡嗪等。隨著烘烤溫度的升高和烘烤時間的增加，烤山核桃的揮發(fā)性成分含量和種類均有顯著的變化，其中MT3和HT3組的吡嗪質量分別占總揮發(fā)性成分質量的8.71%和12.73%，呋喃質量分別占10.79%和18.25%。

2.4.2 偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)模型建立

偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)是在預先分類的條件下，根據樣本信息建立模型的一種有監(jiān)督的分析模式[25]。本研究對9種不同烘烤條件下的山核桃仁樣品的65種主要揮發(fā)性成分進行分析，建立不同烘烤條件山核桃仁的PLS-DA模型，圖1a是以主成分1、2為坐標，各樣本點在該坐標平面的垂直投影的得分圖。圖1b為Hotelling T2分布圖，27個山核桃仁樣品的相似度在95%的置信區(qū)間內且有明顯的分類，說明建立的PLS-DA 模型可對烘烤的山核桃樣品進行分類。

由圖1所示，建立的模型可以將3個溫度烘烤的山核桃樣品明顯區(qū)分，其中低溫烘烤(LT)在主成分1上可以進行有效區(qū)分，而中溫(MT)和高溫(HT)在主成分2上達到了較好的分離效果。建立的PLS-DA 模型具有良好的擬合參數：R2(X)=0.637，R2(Y)=0.936，Q2=0.806，說明該模型十分穩(wěn)定且能夠解釋93.6%的原始數據，并且具有較強的預測能力。

圖1 PLS-DA得分圖和Hotelling T2 分布圖

2.4.3 PLS-DA模型可靠性驗證

對樣本順序進行隨機置換，將建立PLA-DA 模型時定義分類Y的變量順序隨機排列100次，得到的Q2和R2值作為衡量模型是否過擬合的標準[26]。結果表明，該模型的R2和Q2的一元線性回歸曲線在縱軸上的截距分別都小于0.4和0，說明模型均不存在過擬合現象，模型可靠[27]，因此可用于對實驗中不同烘烤條件下山核桃中重要揮發(fā)性成分進行判別分析。

2.4.4 不同烘烤條件下山核桃仁的特征香氣的鑒定

將PLS-DA 模型的因子載荷圖(圖2)與65種香氣成分的變量重要性(VIP)值圖(圖3)相結合，離密集區(qū)越遠，VIP 值越大，該香氣成分的含量在不同烘烤條件下山核桃仁之間的差異越大，對分類起著越關鍵的作用。共有24種香氣成分VIP值大于1，分別為1-羥基-2-丁酮、2-乙基-6-甲基吡嗪、當歸酸、己醛、2-醛基吡咯、2-甲基丁酸、2-乙基吡嗪、2-甲基丁酸乙酯、惕各酸甲酯、1-辛烯-3-醇、桉葉醇、3-甲基-2(5H)-呋喃酮、苯乙醇、辛醇、(E，E)-2,4-癸二烯醛、2(5H)-呋喃酮、苯甲醛、3-呋喃甲醇、2-十一烯醛、DL-泛酰內酯、壬酸、糠醛、2,4,4-三甲基丁-2-烯內酯、十四酸異丙酯。

圖2 PLS-DA 模型因子載荷圖

圖3 65種香氣成分VIP值圖

對于VIP>1 的山核桃仁香氣成分進行差異性分析和風味物質分析，結果如表4所示。不同烘烤條件下山核桃仁的香氣成分均有顯著差異(P<0.05)，與PLS-DA 模型分析結果相同。不同揮發(fā)性物質的風味均有所不同，通過對24種香氣成分進行風味分析，可以看到，中溫烘烤山核桃中1-羥基-2-丁酮(C7)和2-乙基-6-甲基吡嗪(F3)含量較高，具有烤榛子和烤谷物的風味。而高含量的2-醛基吡咯(F7)、2-甲基丁酸(D3)、2-乙基吡嗪(F2)和2-甲基丁酸乙酯(E10)賦予了中溫烘烤山核桃組咖啡、乳脂、可可和果香等風味，使中溫烘烤山核桃仁的風味更豐富。低溫烘烤山核桃中辛醇(A3)、2-十一烯醛(B9)、壬酸(D2)和糠醛(B15)含量較高，具有蠟質味、澀味等氣味。高溫烘烤山核桃仁揮發(fā)性物質含量較少，大多為油脂香氣和木質香。因此，中溫烘烤山核桃仁后，山核桃仁的風味更豐富且具有特征性。

表4 不同烘烤條件下主要揮發(fā)性物質的風味

3 結論

溫度和時間的不同組合能夠顯著影響烘烤山核桃仁的品質。隨烘烤時間和溫度的增加，山核桃仁的含水量、水分活度、亮度指標和生育酚含量均顯著下降，顏色變暗。但高溫烘烤對山核桃仁中甾醇組成和含量無顯著影響。

通過SPME-GC-MS技術對不同溫度和時間烘烤的山核桃仁的揮發(fā)性成分進行定性定量分析，共鑒定出65種揮發(fā)性成分，其中雜環(huán)類成分對烤山核桃仁的風味具有顯著影響。建立基于揮發(fā)性成分判別不同烘烤條件下的山核桃的PLS-DA模型，結果顯示，27個樣品中沒有離群點，可以將烘烤山核桃仁在溫度上進行區(qū)分，且模型可靠。結合PLS-DA 模型中VIP>1 的變量和差異顯著性分析結果，最終鑒定出24種揮發(fā)性成分是不同烘烤條件下山核桃仁風味呈現的關鍵化合物，對關鍵揮發(fā)性成分的風味鑒定實現了對山核桃仁風味的準確客觀的評價。145 ℃烘烤使山核桃仁具有更豐富的果香和烘烤的堅果香，而130、160 ℃的烘烤對香氣的貢獻沒有顯著積極作用。對顏色指標、甾醇含量、生育酚含量和揮發(fā)性成分綜合評價，145 ℃/30 min條件烘烤下的山核桃仁營養(yǎng)成分含量較高，且風味濃郁。