陳雪琪， 王夢(mèng)如， 于 航， 楊方威， 郭亞輝， 成玉梁， 謝云飛， 姚衛(wèi)蓉

(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江南大學(xué)食品學(xué)院食品安全與質(zhì)量控制研究所，無(wú)錫 214122)

抗氧化劑在當(dāng)代生活中占有重要地位，如油脂以及含油脂類的食品在儲(chǔ)藏過(guò)程中不飽和脂肪酸會(huì)自動(dòng)氧化導(dǎo)致油脂酸敗，添加抗氧化劑能夠有效地避免油脂類食品在運(yùn)輸、儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)生酸敗、褐變等，在生活、工業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域均有廣泛的應(yīng)用。抗氧化劑按其來(lái)源通?？煞譃樘烊缓秃铣蓛纱箢怺1]，常用的合成抗氧化劑有叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ)、二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)等，合成抗氧化劑憑借其活性高、抗氧化效果強(qiáng)、價(jià)格低廉和性價(jià)比高，在食品中廣泛使用[2]。而天然抗氧化劑作為天然綠色安全抗氧化劑，種類繁多，如維生素C、E等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于油脂和化妝品等領(lǐng)域。但天然抗氧化劑相比來(lái)說(shuō)提取成本高、抗氧化效果不夠理想，食品企業(yè)多選擇前者作為主要的抗氧化劑。

因此很多研究開始考慮抗氧化劑之間協(xié)同作用來(lái)提高整體的抗氧化性能，實(shí)現(xiàn)1+1>2的效果[3]。研究表明茶多酚、維生素E等與TBHQ進(jìn)行復(fù)配時(shí)，可以顯著增強(qiáng)TBHQ的抗氧化能力，且抗氧化效果大于單一的抗氧化劑，能夠有效延長(zhǎng)食物保質(zhì)期[4]。而且，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑TBHQ在抗氧化過(guò)程中的主要降解產(chǎn)物叔丁基對(duì)苯醌具有細(xì)胞毒性[5]，因此，通過(guò)添加天然抗氧化劑產(chǎn)生協(xié)同作用達(dá)到預(yù)想的抗氧化效果，降低TBHQ的使用量、從而降低有毒產(chǎn)物的含量成為研究的關(guān)鍵。

抗氧化劑協(xié)同再生作用的機(jī)理之一是再生作用[6-8]，在同時(shí)含有BHT和α-生育酚的非極性體系內(nèi)，根據(jù)清除DPPH自由基速率發(fā)現(xiàn)BHT可以重生α-生育酚[9]。如在葵花籽油中同時(shí)存在α-生育酚和楊梅酮條件下，追蹤100 ℃條件下的酸價(jià)變化，α-生育酚和楊梅酮可發(fā)生協(xié)同效應(yīng)，并且根據(jù)動(dòng)力學(xué)分析得出α-生育酚能夠再生楊梅酮自由基[10]；在亞油酸基質(zhì)中添加綠茶多酚和維生素E，分析添加抗氧化劑對(duì)亞油酸過(guò)氧化的抑制作用和過(guò)程中維生素E的降解變化，發(fā)現(xiàn)綠茶多酚能夠再生維生素E[11]；在花生油體系中通過(guò)電子自旋共振光譜根據(jù)初期油的氧化速率比較發(fā)現(xiàn)茶多酚和TBHQ的協(xié)同效應(yīng)主要是茶多酚提供氫原子再生TBHQ[12]。目前研究抗氧化劑再生大多是將待研究的兩種抗氧化劑溶解在同一種氧化基質(zhì)中，在同一體系采用加熱或者化學(xué)方式促進(jìn)氧化來(lái)進(jìn)行研究分析，通過(guò)分析在氧化過(guò)程中耗氧量和過(guò)氧化值等指標(biāo)的變化，來(lái)分析抗氧化劑的保護(hù)作用[13,14]。

本實(shí)驗(yàn)基于再生作用學(xué)說(shuō)，構(gòu)建可分離體系，而非在同一體系內(nèi)研究抗壞血酸對(duì)TBHQ抗氧化能力的再生，在固相內(nèi)添加抗壞血酸使液相內(nèi)失去抗氧化能力的TBHQ的抗氧化能力再生。隨后分析添加抗壞血酸前后溫度對(duì)TBHQ抗氧化能力的影響以及TBHQ和氧化產(chǎn)物TQ的含量變化，分析其再生機(jī)理和影響因素，為協(xié)同使用抗氧化劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

叔丁基對(duì)苯二酚(TBHQ，純度≥98%)，抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH，純度98%)自由基標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇(分析純)、β-環(huán)糊精(β-CD)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見光分光光度計(jì)，ZNCL-GS-C型磁力攪拌水浴鍋，DZF-6030A真空干燥箱，TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，e2695高效液相色譜(DAD/熒光)。

1.3 方法

1.3.1 抗壞血酸與β-環(huán)糊精包合物的制備

用重結(jié)晶[15]的方法制備抗壞血酸與β-環(huán)糊精(β-CD)的包合物。稱取 30 g β-環(huán)糊精在60 ℃水浴下溶解于420 g去離子水，充分溶解后得到β-環(huán)糊精溶液。準(zhǔn)確稱取15 g抗壞血酸溶解于150 g去離子水中制備抗壞血酸溶液。向β-環(huán)糊精溶液中恒速滴加抗壞血酸溶液，在60 ℃的磁力水浴攪拌鍋中磁力攪拌6 h。冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱隔夜結(jié)晶。過(guò)濾，漂洗，真空干燥得到固體。稱取相同質(zhì)量比的抗壞血酸與β-環(huán)糊精，渦旋混合器混合5 min得到物理混合物作對(duì)照。

1.3.2 包合物的表征

1.3.2.1 紫外可見光光譜觀察

取抗壞血酸、β-環(huán)糊精以及抗壞血酸與β-環(huán)糊精的物理混合物和包合物，配制成1.0 mg/mL的溶液，稀釋后使用UV-1800型紫外-可見光分光光度計(jì)進(jìn)行掃描。掃描波長(zhǎng)范圍為200～450 nm，記錄數(shù)據(jù)。每次測(cè)量重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 掃描電鏡(SEM)觀察

將抗壞血酸、β-環(huán)糊精以及VC-β-CD樣品放在導(dǎo)電板上，測(cè)量前進(jìn)行表面鍍金。圖像在5.0 kV下通過(guò)掃描電子顯微鏡收集。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

DPPH清除實(shí)驗(yàn)參照Spínola等[16]的方法稍作修改。配制0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液和0.2 mmol/L TBHQ-甲醇溶液。取2.0 mL DPPH-甲醇溶液于5 mL離心管中，加入200 μL的TBHQ-甲醇溶液于室溫下避光反應(yīng)30 min，待反應(yīng)穩(wěn)定后，于517 nm處紫外檢測(cè)記錄吸光度?？寡趸芰?AC)按照式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A0為對(duì)照組吸光度；A1為樣品組吸光度值；Aj為空白組吸光度。

1.3.4 抗壞血酸對(duì)TBHQ和TQ作用后的抗氧化作用

將所需摩爾比的TBHQ和DPPH溶液在黑暗中以300 r/min搖動(dòng)30 min后，梯度按照0、0.2、0.4、0.8、1.0 g添加VC-β-CD于反應(yīng)溶液中進(jìn)行反應(yīng)；梯度添加0、0.2、0.4、0.6、0.8 g包合物于標(biāo)準(zhǔn)TQ溶液中反應(yīng)。將樣品放置黑暗狀態(tài)300 r/min搖動(dòng) 2 h，1 500 r/min 離心15 min收集上清液，測(cè)定其抗氧化值。

1.3.5 不同溫度下TBHQ抗氧化能力的測(cè)定

取10 mL TBHQ-甲醇溶液置于15 mL離心管中，并添加0.6 g VC-β-CD，設(shè)為再生組?？瞻捉M中不含VC-β-CD。在4、25、38、50 ℃下，分別反應(yīng)2、4、6、8、10、12 d，1 500 r/min離心15 min收集上清液，取不同溫度下溶液檢測(cè)抗氧化能力。

1.3.6 TBHQ降解動(dòng)力學(xué)模型

TBHQ的降解動(dòng)反應(yīng)符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，應(yīng)用該模型擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如式(2)所示：

y=-kt+b

(2)

式中：t為反應(yīng)時(shí)間；y為某時(shí)間溶液的抗氧化能力；k為反應(yīng)速率常數(shù)，k值由Origin 8.5通過(guò)線性擬合函數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

1.3.7 樣品的制備

制備166 mg/L的TBHQ溶液，添加0.6 g含抗壞血酸的固相包合物為再生組，不添加的為空白組；制備164 mg/L的TQ標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加0.8 g含抗壞血酸的固相包合物構(gòu)建可分離體系。

1.3.8 HPLC分析

使用2487 紫外檢測(cè)器的 HPLC 系統(tǒng)用于分析：色譜柱為SunFire C18柱(4.6 nm×250 nm，5 μm)；流動(dòng)相比例為甲醇∶含0.5%乙酸的水=65∶35；柱溫為35 ℃，TBHQ或者TQ的進(jìn)樣量為10 μL；UV檢測(cè)器設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，采用SPSS20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間是否具有顯著性差異。若顯著性差異值P<0.05，則表示兩者有顯著性差異。數(shù)據(jù)繪圖采用Origin8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗壞血酸與β-環(huán)糊精固相包合物的表征

將抗壞血酸與β-環(huán)糊精制備成固相包合物(VC-β-CD)，跟蹤了其紫外吸收情況。從圖1抗壞血酸譜圖可知在259 nm處抗壞血酸有最大吸收峰，該峰是由π-π*躍遷產(chǎn)生的吸收帶。從β-環(huán)糊精譜圖中可以看出在225 nm處有較弱吸收峰，是羥基n→σ*躍遷所致。在278 nm處也有一較弱吸收峰，是環(huán)糊精的單氧非共軛生色團(tuán)所致[18]。物理混合物從譜圖看在259 nm出現(xiàn)最大吸收峰，基本與抗壞血酸的紫外吸收一致。抗壞血酸與β-環(huán)糊精固相包合物的紫外表征如圖1所示，可以看出VC-β-CD譜圖中在259 nm處也有最大吸收峰，掩蓋了β-環(huán)糊精在278 nm處的吸收峰[19]。該包合物在225 nm處有吸收峰，與β-CD較為一致，但吸收強(qiáng)度顯著減弱，這有可能是β-CD與抗壞血酸通過(guò)氫鍵相互作用力相互結(jié)合，從而形成包合物。

注：a為抗壞血酸與β-環(huán)糊精物理混合；b為抗壞血酸；c為抗壞血酸與β-環(huán)糊精包合物；d為β-環(huán)糊精。圖1 抗壞血酸與β-環(huán)糊精固相包合物的紫外表征

抗壞血酸與β-環(huán)糊精固相包合物電鏡掃描圖如圖2所示，抗壞血酸呈現(xiàn)規(guī)則塊狀，β-環(huán)糊精表現(xiàn)出不同尺寸表面粗糙的晶體結(jié)構(gòu)，VC-β-CD則呈現(xiàn)表面覆蓋非晶碎片的不規(guī)則晶體形狀，這與單獨(dú)的抗壞血酸和β-CD相比形狀和大小有明顯不同。包合物表面出現(xiàn)粗糙的點(diǎn)蝕區(qū)，純抗壞血酸與β-CD獨(dú)有的形貌消失，說(shuō)明抗壞血酸和β-CD包合之后在形狀顆粒上發(fā)生了變化[20]。SEM圖和紫外圖譜結(jié)合證實(shí)了包合物的形成。

圖2 抗壞血酸與β-環(huán)糊精固相包合物電鏡掃描圖

2.2 可分離體系中TBHQ抗氧化能力的再生

DPPH是一種氮為中心的穩(wěn)定自由基，其孤對(duì)電子可與抗氧化劑提供的質(zhì)子進(jìn)行配對(duì)，從而造成孤對(duì)電子在紫外波長(zhǎng)517 nm處的吸收峰逐漸降低直至消失[21]。

為確定抗壞血酸對(duì)TBHQ的再生作用，添加適量的DPPH于TBHQ溶液中進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)DPPH自由基剛好全部捕獲TBHQ提供的質(zhì)子，TBHQ溶液完全失去抗氧化能力[22]。TBHQ溶液抗氧化能力的再生如圖3所示，由圖3a可知，隨著溶液中DPPH/TBHQ摩爾比的增加，TBHQ溶液的抗氧化能力逐漸下降。當(dāng)溶液中DPPH與TBHQ摩爾比為1.98時(shí)，溶液沒有抗氧化能力，此時(shí)溶液中TBHQ提供的質(zhì)子恰好被DPPH自由基全部捕獲。

圖3 TBHQ溶液抗氧化能力的再生

對(duì)抗氧化能力被完全猝滅的TBHQ溶液進(jìn)一步

研究，觀察有無(wú)添加VC-β-CD后溶液抗氧化能力的變化。從圖3b可以看出，不添加VC-β-CD時(shí)溶液沒有抗氧化能力；添加質(zhì)量為0.2 g時(shí)，溶液的抗氧化能力就恢復(fù)到原來(lái)的67.78%；且隨著添加量的增加，恢復(fù)的抗氧化能力顯著性增加(P<0.05)。當(dāng)添加質(zhì)量達(dá)到0.6 g時(shí)，溶液抗氧化能力達(dá)到峰值，可恢復(fù)到原來(lái)的92.70%。隨著添加量的繼續(xù)增加，溶液的抗氧化再生能力達(dá)到飽和不再增加。由此可知VC-β-CD能夠使TBHQ抗氧化能力再生，且抗氧化能力再生效果與VC-β-CD添加量有關(guān)，推測(cè)抗壞血酸能夠提供質(zhì)子來(lái)使TBHQ再生。

2.3 可分離體系中溫度對(duì)TBHQ抗氧化能力再生的影響

50 ℃下TBHQ抗氧化能力的變化趨勢(shì)均如圖4所示，其他溫度條件下TBHQ抗氧化能力的變化趨勢(shì)與之相同。TBHQ的抗氧化動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表1。同一溫度下，隨著時(shí)間的增加，再生組和對(duì)照組的TBHQ抗氧化能力都在逐漸降低，且隨時(shí)間變化關(guān)系符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型(R2均大于0.9)，但再生組中TBHQ的抗氧化能力始終高于空白組。不同溫度下，再生組抗氧化能力比空白組的平均下降速率下降了17.60%。由此可知，添加抗壞血酸包合物能夠有效地延緩甲醇溶液中TBHQ的抗氧化能力。

表1 TBHQ的抗氧化動(dòng)力學(xué)參數(shù)

圖4 50 ℃下TBHQ抗氧化能力的變化

隨著溫度的上升，TBHQ抗氧化能力的下降速率更快，且與溫度具有高度相關(guān)性(r=0.912 8)，說(shuō)明高溫會(huì)促進(jìn)TBHQ抗氧化能力的再生。

2.4 TBHQ再生機(jī)理分析

TBHQ在加熱情況下接觸氧氣直接被氧化成叔丁基對(duì)苯醌(TQ)，也可以在失去2個(gè)氫質(zhì)子后生成TQ[23]。溶液的液相色譜圖如圖5所示，通過(guò)HPLC方法觀察再生前后溶液中TBHQ和TQ含量的變化，TBHQ的出峰時(shí)間為3.64 min，TQ的出峰時(shí)間為8.24 min。采用外標(biāo)法定量得到，再生組中TBHQ對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為6.692 mg/L，TQ為19.05 mg/L；空白組中TBHQ質(zhì)量濃度為4.83 mg/L；TQ為21.44 mg/L。由此可得再生組TBHQ含量高于空白組，TQ含量低于空白組。由此推測(cè)包合物中的抗壞血酸能夠?qū)Q還原成TBHQ。

圖5 溶液的液相色譜圖

根據(jù)DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)添加固相包合物后TQ溶液的抗氧化能力。TQ溶液中抗氧化能力的變化如圖6所示，TQ溶液的初始抗氧化能力為0，隨著固相包合物添加量的增加，溶液的抗氧化能力顯著增加(P<0.05)；當(dāng)添加質(zhì)量為0.8 g時(shí)，溶液的抗氧化能力達(dá)到19.93%。由TQ的結(jié)構(gòu)可知，TQ本身沒有抗氧化能力，無(wú)法提供游離的質(zhì)子或者轉(zhuǎn)移電子給DPPH自由基。添加固相包合物于溶液中使抗壞血酸與TQ進(jìn)行界面反應(yīng)，從而溶液具有抗氧化能力，由此推斷抗壞血酸能夠與TQ發(fā)生反應(yīng)。

圖6 TQ溶液中抗氧化能力的變化

TQ溶液中TBHQ和TQ含量的變化如圖7所示，初始狀態(tài)時(shí)TQ溶液中沒有TBHQ生成。隨著時(shí)間的增加，溶液中TQ的含量逐漸下降(P<0.05)，TBHQ的含量逐漸增加(P<0.05)。在室溫下使固相包合物中的抗壞血酸與TQ反應(yīng)4、8 d時(shí)，TQ的含量從初始164.2 mg/L分別降低到154.32、128.22 mg/L；TBHQ含量從初始不存在增加到8.12、22.29 mg/L。由此可以確定抗壞血酸可以將TQ還原成TBHQ。

圖7 TQ溶液中TBHQ和TQ含量的變化

擬合方程及相關(guān)系數(shù)見表2，TQ的降低速率高于TBHQ的生成速率，說(shuō)明部分TQ被還原成TBHQ，由此可以證明固相包合物中的抗壞血酸能夠?qū)⒉糠諸Q還原成TBHQ，使得溶液具有抗氧化能力。有研究通過(guò)觀察室溫和熱處理?xiàng)l件下大豆油中的TBHQ和TQ變化，發(fā)現(xiàn)油中的某些具有還原能力的物質(zhì)能夠使TQ還原成TBHQ[24]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

表2 擬合方程及相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選取可分離體系對(duì)TBHQ的抗氧化能力進(jìn)行研究，證明TBHQ的抗氧化能力可被抗壞血酸再生。通過(guò)研究固相包合物中抗壞血酸與甲醇溶液中的TBHQ在界面上的反應(yīng)來(lái)評(píng)估TBHQ的再生效果。研究發(fā)現(xiàn)添加VC-β-CD能使TBHQ抗氧化能力再生，且隨著添加量的增加，TBHQ抗氧化能力再生效果增強(qiáng)。再生組比空白組抗氧化能力的下降速率均明顯減緩，平均下降速率降低17.60%，且下降速率與溫度具有高度相關(guān)性(r=0.912 8)，說(shuō)明在0～50 ℃范圍內(nèi)升高溫度能促進(jìn)TBHQ的再生。追蹤TBHQ和TQ含量變化及TQ溶液的抗氧化能力變化，確定抗壞血酸能夠?qū)⒉糠諸Q還原成TBHQ；由此推測(cè)包合物中的抗壞血酸能夠提供質(zhì)子使TQ還原成TBHQ，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)TBHQ抗氧化能力的再生。