白桂英，葉淑紅，王琛郴，張 彧

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）屬于茄科枸杞屬多年生植物[1]，它主要分布于我國(guó)的西北地區(qū)，地貌相對(duì)復(fù)雜且干燥[2]，在國(guó)外主要分布于歐洲南部以及地中海沿岸等地區(qū)[3]。類(lèi)胡蘿卜素，維生素C、維生素B1、維生素B2等在黑枸杞的果實(shí)中含量較高，并且黑枸杞中還含有豐富的微量元素，如Fe、Sn、Zn等[4]。黑枸杞中富含花青素和黃酮類(lèi)化合物等功能成分，具有提高免疫力、降血脂、抗疲勞等功能[5]?；ㄇ嗨刈鳛楹阼坭街匾δ艹煞种唬兄A(yù)防心腦血管疾病、抗癌、提高視力、降血脂、消炎、抗輻射以及延緩衰老等一系列作用[6-9]。

雖然黑枸杞在我國(guó)歷史悠久，種植面積廣，但目前在食品行業(yè)中發(fā)展較緩慢，深加工產(chǎn)品很少。食用黑枸杞的主要方式是加水浸泡后飲用，食用方式單一，但黑枸杞在醫(yī)藥以及食品方面都有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)對(duì)于黑枸杞的研究大多是對(duì)于黑枸杞多糖、酚類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的測(cè)定和提取，近幾年興起了對(duì)于黑枸杞飲料的開(kāi)發(fā)。劉艷懷等[10]對(duì)黑枸杞藍(lán)莓復(fù)合飲料的配方進(jìn)行了研究，研制的黑枸杞藍(lán)莓復(fù)合飲料不僅口感細(xì)膩、醇厚濃郁，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，具有較好的市場(chǎng)發(fā)展前景。陳海魁等[11]研究黑枸杞果醋和果酒的發(fā)酵工藝，確定最優(yōu)發(fā)酵條件下制得的黑枸杞果醋風(fēng)味純正，具有水果香味，是一種價(jià)值較高的營(yíng)養(yǎng)保健型果醋。國(guó)外對(duì)黑枸杞研究多集中在花色苷組分含量以及抗氧化降血脂等活性變化，而對(duì)黑枸杞乳酸菌飲料開(kāi)發(fā)卻鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選擇黑枸杞為主要原料，經(jīng)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）發(fā)酵，制備黑枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料。采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。黑枸杞乳酸菌飲料的研制，既可以滿(mǎn)足消費(fèi)者口味的多元化同時(shí)也滿(mǎn)足人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)豐富產(chǎn)品的追求，充分研究和利用其功能成分，從而提高產(chǎn)品的附加值和黑枸杞的利用率，為黑枸杞功能發(fā)酵飲料開(kāi)發(fā)和工業(yè)化發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑枸杞：市售；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：本實(shí)驗(yàn)室保藏；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、冰乙酸、亞硫酸氫鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、氯化鉀、醋酸鈉、苯酚（均為分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-5500PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)：江蘇杰瑞爾電器有限公司；HZQ-F100振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；JYL-CO2DE多功能破壁料理機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；GL-21M冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；QN-30壓蓋機(jī)：湖南省科特包裝檢測(cè)技術(shù)有限公司；LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T10分散機(jī)：廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；WYA-2W雙目數(shù)字阿貝折射儀：上海精科儀電物光儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑枸杞乳酸菌飲料加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料挑選、清洗：選擇大小適中、干凈無(wú)霉的優(yōu)質(zhì)黑枸杞，取適量的水洗滌干凈，備用。

黑枸杞漿液的制備：按所需用量稱(chēng)取處理好的黑枸杞，并按照1∶25（g∶L）固液比加水，打漿。此時(shí)原料打漿后還原糖含量為7.32 mg/mL，可以為菌種后續(xù)發(fā)酵提供足夠的碳源[12]，打漿后的原漿用四層紗布過(guò)濾，得到黑枸杞漿液。

菌種活化：將植物乳桿菌的保藏菌種培養(yǎng)物取出解凍，取100 μL于MRS平板上進(jìn)行活化復(fù)壯后，接種到100 mL的菌液中，并放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

一次滅菌、接種發(fā)酵：將過(guò)濾后的黑枸杞漿液進(jìn)行巴氏殺菌（65 ℃下滅菌30 min），冷卻后的漿液在無(wú)菌條件下接種經(jīng)過(guò)活化后的植物乳桿菌，并在37 ℃恒溫條件下按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間發(fā)酵。

離心、調(diào)配、均質(zhì)：將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液加入6%白砂糖并在8 000 r/min條件下均質(zhì)5 min。

灌裝：均質(zhì)后的發(fā)酵液裝入合適容器內(nèi)并封口。

二次滅菌、冷卻：將灌裝后的發(fā)酵液進(jìn)行二次滅菌（65 ℃、30 min），取出冷卻至常溫即可得到黑枸杞乳酸菌飲料成品。

1.3.2 黑枸杞乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在不同接種量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、固液比（1∶40、1∶35、1∶30、1∶25、1∶20（g∶mL））、發(fā)酵時(shí)間（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）、裝液量（20%、30%、40%、50%、60%）條件下，分別考察上述各因素對(duì)黑枸杞乳酸菌飲料花青素含量和感官評(píng)分的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、固液比（C）、裝液量（D）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，確定最佳工藝參數(shù)。Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析檢測(cè)

可溶性固形物測(cè)定：采用折光計(jì)法[13]；總酸含量測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》；總糖含量測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[14]；花青素含量測(cè)定：采用pH示差法[15]；總黃酮含量測(cè)定：參考程詩(shī)韔等[16]的方法；多酚含量測(cè)定：福林酚比色法[17]，結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示。

微生物指標(biāo)測(cè)定：按照國(guó)標(biāo)GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》、GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》、GB29921—2021《預(yù)包裝食品中致病菌限量》分別檢測(cè)成品的菌落總數(shù)、大腸菌群及致病菌[18-20]。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

以10人組成品嘗小組，對(duì)黑枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料的色澤、風(fēng)味、口感、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)定，滿(mǎn)分10分。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 黑枸杞乳酸菌飲料感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards of black wolfberry Lactobacillus beverage

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin9.5和Design ExpertV8.0.6等軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖以及處理分析，每組試驗(yàn)3次平行，P＜0.01代表差異極顯著，P＜0.05代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑枸杞乳酸菌發(fā)酵飲料工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 接種量的確定

由圖1可知，當(dāng)接種量為1.0%～2.0%時(shí)，感官評(píng)分和花青素含量隨著接種量的增加逐漸上升；當(dāng)接種量為2.0%時(shí)，感官評(píng)分和花青素含量均達(dá)到最高，分別為49.60 mg/L和8.2分；當(dāng)接種量＞2.0%之后，感官評(píng)分和花青素含量逐漸下降。因?yàn)檫^(guò)多的接種量會(huì)使飲料過(guò)度發(fā)酵導(dǎo)致其口感過(guò)酸影響評(píng)分。接種量低時(shí)發(fā)酵初期菌種繁殖慢，發(fā)酵不充分可能會(huì)導(dǎo)致花青素類(lèi)物質(zhì)溶出率低。如果接種量太高，那么乳酸的濃度就會(huì)很高，在發(fā)酵初期乳酸快速增加時(shí)就會(huì)導(dǎo)致乳酸在短暫的一段時(shí)間內(nèi)大量消耗糖分，從而使其增加了發(fā)酵液中的水活性，產(chǎn)生過(guò)多的代謝物也可能會(huì)直接加速其對(duì)花青素的分解，從而降低其含量[21]。同時(shí)過(guò)高或者是過(guò)低的初始接種量均不太合適用于釀制發(fā)酵的飲料。因此，確定最佳接種量為2%。

圖1 不同接種量對(duì)乳酸菌飲料感官評(píng)分和花青素含量的影響Fig.1 Effect of different inoculum on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.1.2 固液比的確定

由圖2可知，當(dāng)固液比在1∶40～1∶25（g∶mL）范圍內(nèi)的增大，花青素含量和感官評(píng)分均隨之有所增高；當(dāng)固液比為1∶25（g∶mL）時(shí)；花青素含量和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為48.04 mg/L和8.5分；隨著固液比的增加，可溶物固形物含量和其他的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也隨之增加，利于乳酸菌生長(zhǎng)；但當(dāng)固液比過(guò)高時(shí)，發(fā)酵液的濃度過(guò)高，水分活度的降低和溶解氧的減少影響了乳酸菌的生長(zhǎng)[21]。隨著固液比的增加，飲料的顏色會(huì)變得越來(lái)越深，當(dāng)深度超過(guò)一定值時(shí)，色澤評(píng)分會(huì)極低，所以感官評(píng)分在達(dá)到最高點(diǎn)之后會(huì)下降。因此，確定最佳固液比為1∶25（g∶mL）。

圖2 不同固液比對(duì)乳酸菌飲料感官評(píng)分和花青素含量的影響Fig.2 Effect of different solid and liquid ratio on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間的確定

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為4～6 h時(shí)，花青素含量和感官評(píng)分均隨之增高；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 h時(shí)，花青素含量和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為50.77 mg/L和8.8分；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞6 h之后，花青素含量和感官評(píng)分均有所下降。這些菌種不斷利用發(fā)酵底物中的糖產(chǎn)生酸，積累乳酸并繼續(xù)產(chǎn)生酸，從而提高產(chǎn)品的酸度。乳酸菌的發(fā)酵不僅可以增加產(chǎn)品的酸度，而且對(duì)產(chǎn)品的風(fēng)味和花青素的溶出也有很好的促進(jìn)作用，因此感官評(píng)分和花青素含量也有所提高。發(fā)酵6 h后產(chǎn)酸過(guò)多口感變差感官評(píng)分開(kāi)始逐漸下降，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)多的代謝產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致其花青素分解含量降低。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為6 h。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌飲料感官評(píng)分和花青素含量的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.1.4 裝液量的確定

由圖4可知，當(dāng)裝液量為20%～40%時(shí)，花青素含量和感官評(píng)分均隨之增高；當(dāng)裝液量為40%時(shí)，花青素含量和感官評(píng)分均達(dá)到最大值，分別為48.43 mg/L和8.9分；當(dāng)裝液量＞40%之后，花青素含量以及感官評(píng)分均開(kāi)始下降。這是因?yàn)檠b液量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致飲料口感過(guò)于寡淡，同時(shí)菌種的發(fā)酵與環(huán)境有著密切的關(guān)系。植物乳桿菌是一種異養(yǎng)厭氧型微生物，當(dāng)瓶子里的氧氣耗盡時(shí)，它開(kāi)始進(jìn)行厭氧呼吸，水分活度和溶解氧的多少會(huì)影響乳酸菌的生長(zhǎng)進(jìn)而影響感官評(píng)分及花青素的含量[22]。因此，確定最佳裝液量為40%。

圖4 不同裝液量對(duì)乳酸菌飲料感官評(píng)分和花青素含量的影響Fig.4 Effect of different liquid loading volume on sensory score and anthocyanin contents of lactic acid bacteria beverage

2.2 黑枸杞乳酸菌飲料發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及方差分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、固液比（C）和裝液量（D）為自變量，感官評(píng)分（Y）為因變量進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

續(xù)表

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸方程擬合，二次多項(xiàng)回歸方程：

由表4可知，回歸方程模型的P值＜0.000 1，極顯著；失擬項(xiàng)P值為0.561 3＞0.05，不顯著，說(shuō)明建立的回歸方程擬合良好。決定系數(shù)R2=0.994 3，表明99.43%的變化可以由這個(gè)模型來(lái)解釋。由F值可以看出，對(duì)感官評(píng)分的影響順序?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間＞裝液量＞固液比＞接種量。由P值可知，一次項(xiàng)B、C、D，交互項(xiàng)AC、AD、BD，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 各因素交互作用響應(yīng)面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)影響黑枸杞乳酸菌飲料發(fā)酵工藝的4個(gè)因素進(jìn)行交互分析，各因素交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)乳酸菌飲料感官評(píng)分影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of lactic acid bacteria beverage

該模型可用于擬合兩個(gè)因素之間相互作用的響應(yīng)面圖，并且能夠進(jìn)一步研究各因素之間的相互作用強(qiáng)度。由圖5可知，AC、AD和BD因素之間的相互作用是顯著的，這表現(xiàn)為橢圓的等高線形狀。AB、BC和CD因素之間的相互作用不顯著，等高線形狀為圓形。接種量與固液比、接種量與裝液量以及發(fā)酵時(shí)間與裝液量的響應(yīng)面曲線比較陡峭，因此，對(duì)感官的影響最顯著，而接種量和發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間與固液比以及固液比與裝液量的響應(yīng)面曲線比較平緩，響應(yīng)值的變化隨其數(shù)值的變化較小，所以對(duì)感官評(píng)價(jià)的影響也較小。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用Design ExpertV8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，得到最佳發(fā)酵工藝條件為：接種量1.98%，發(fā)酵時(shí)間5.7 h，固液比1∶25.26（g∶mL），裝液量40.16%。在此條件下，感官評(píng)分的理論值為9.28分。為了便于實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝條件修正為：接種量2%，固液比1∶25（g∶mL），發(fā)酵時(shí)間6 h，裝液量40%。在上述條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，黑枸杞發(fā)酵飲料的感官評(píng)分實(shí)際值為9.3分，與理論預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明該模型與實(shí)際情況有較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以用于優(yōu)化黑枸杞發(fā)酵飲料的發(fā)酵工藝參數(shù)。

2.3 產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

感官指標(biāo)：該產(chǎn)品無(wú)沉淀、呈均勻的紫色、酸甜細(xì)膩的口感、乳酸菌發(fā)酵的濃郁香氣；理化指標(biāo)：成品中總糖含量為0.17 mg/mL，總酸含量為1.69 g/L，可溶性固形物含量為7%；微生物指標(biāo)：細(xì)菌總數(shù)＜100 CFU/mL；大腸菌群＜3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。

2.4 功能性成分分析

由圖6可知，黑枸杞汁經(jīng)過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵后的總酚含量高達(dá)0.988 mg/mL，較未經(jīng)發(fā)酵的黑枸杞汁中總酚含量提升了11.34%，可能是因?yàn)榉宇?lèi)物質(zhì)有兩種狀態(tài)形式分別為游離和結(jié)合狀態(tài)，結(jié)合狀態(tài)又分為不溶性共價(jià)結(jié)合酚和可溶性共價(jià)結(jié)合酚[23]，可溶性共價(jià)結(jié)合酚可與長(zhǎng)鏈脂肪酸、長(zhǎng)鏈醇等物質(zhì)相連[24]，在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中，各種酶作用于底物，可使黑枸杞汁中的可溶性結(jié)合酚釋放，從而使總酚含量增加。接種乳酸菌發(fā)酵的產(chǎn)品中花青素含量要高于未接種的黑枸杞汁，這與高辰哲等[25]的結(jié)果一致，可能是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵促進(jìn)了花青素的溶出同時(shí)產(chǎn)生酸性環(huán)境使花青素更加穩(wěn)定，具體機(jī)理還需進(jìn)一步深入研究。未接菌的黑枸杞汁中總黃酮含量為0.066 mg/mL。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后，黑枸杞汁的總黃酮含量有所增加，但與未發(fā)酵相比含量增加不顯著（P＞0.05）。賴(lài)婷等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌的發(fā)酵可以將結(jié)合的類(lèi)黃酮釋放為游離的類(lèi)黃酮，從而增加總的類(lèi)黃酮含量，這可能是導(dǎo)致本研究總黃酮含量增加的原因之一，具體變化的原因可能與酶的復(fù)雜作用和黃酮類(lèi)本身的不穩(wěn)定性有關(guān)。

圖6 黑枸杞汁發(fā)酵前后總酚、總黃酮及花青素含量測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of total phenols,total flavonoids and anthocyanin contents of black wolfberry juice before and after fermentation

3 結(jié)論

本研究選用黑枸杞作為試驗(yàn)主要原料，通過(guò)植物乳桿菌發(fā)酵，采用單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面法優(yōu)化得到黑枸杞乳酸菌飲料的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為：固液比為1∶25（g∶mL），植物乳桿菌接種量2.0%，溫度37 ℃下發(fā)酵6 h，裝液量40%。在此優(yōu)化條件下，黑枸杞乳酸菌飲料感官評(píng)分為9.3分，色澤均勻，酸甜可口，口感細(xì)膩柔和。功能性成分含量分析結(jié)果顯示，黑枸杞汁經(jīng)接種發(fā)酵后得到的飲料中總酚、總黃酮和花青素含量均比未接種的黑枸杞汁有所上升，由此可知，通過(guò)工藝優(yōu)化后不僅可以增加黑枸杞發(fā)酵飲料中的功能性成分含量并且使其擁有了較高的感官品質(zhì)和乳酸菌的益生作用，提高了黑枸杞利用率的同時(shí)也滿(mǎn)足了人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)豐富、具有保健功效產(chǎn)品的追求，說(shuō)明此優(yōu)化后的產(chǎn)品可以為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)黑枸杞發(fā)酵飲料提供參考依據(jù)。