雷 高，李珊珊，王佰濤，楊文玲，權(quán)淑靜，劉德海

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450008）

β-甘露聚糖酶（β-mannanase）是一類專一性作用于β-1,4-D-甘露糖苷鍵的半纖維素水解酶[1-2]，能夠以內(nèi)切的方式將甘露聚糖水解為甘露低聚糖，而甘露低聚糖作為一種新型的功能性食品添加劑，可以有效改善動(dòng)物和人的腸道菌群結(jié)構(gòu)、提高機(jī)體機(jī)能[3-5]。目前甘露低聚糖已逐漸應(yīng)用于食品工業(yè)，前景十分廣闊。β-甘露聚糖酶除了在食品方面有著廣闊的應(yīng)用前景，其在造紙、洗滌、飼料、醫(yī)藥和石油開采等方面也具有較大的應(yīng)用價(jià)值[6-8]。

β-甘露聚糖酶來源非常廣泛，存在于植物、動(dòng)物和微生物中[9]。植物來源的β-甘露聚糖酶多來自豆類等發(fā)芽的種子、槐豆膠及魔芋塊莖中，動(dòng)物來源的β-甘露聚糖酶多發(fā)現(xiàn)于一些海洋軟體動(dòng)物及蝸牛等[10]。而微生物來源的β-甘露聚糖酶是目前報(bào)道最多的，也是最豐富的[11-12]。常見產(chǎn)β-甘露聚糖酶的細(xì)菌有芽孢桿菌（Bacillussp.）、假單胞菌（Pseudomonassp.）、產(chǎn)酸細(xì)菌等[13-14]；常見的產(chǎn)β-甘露聚糖酶的真菌主要有青霉屬（Penicilliumsp.）、曲霉屬（Aspergillussp.）等[15-16]。微生物來源的β-甘露聚糖酶相比于動(dòng)植物，有著資源更加廣泛、活性高、pH和溫度作用范圍廣、培養(yǎng)條件簡單、酶分子改造便利的優(yōu)點(diǎn)[17-18]。此外，微生物來源的β-甘露聚糖酶可以在極端環(huán)境條件下（低pH、高溫等）篩選得到耐受度更好的酶。LV J N等[19]報(bào)道的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）MAFIC-S11來源的β-甘露聚糖酶室溫下在pH 2.2的緩沖液中處理60 min后，仍保持60%以上的活性。

本研究擬以常年種植魔芋的土樣為實(shí)驗(yàn)材料，以魔芋粉為唯一碳源，篩選出高產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株，并通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行初步優(yōu)化，為后續(xù)的魔芋開發(fā)和工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

土壤樣品：取自西峽縣西坪鎮(zhèn)后塘溝村多年種植魔芋地；梅里埃VITEK芽孢桿菌鑒定卡：上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸氫二銨、氯化鈣、甘露聚糖、乳糖、蔗糖（均為分析純或生化試劑）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；魔芋粉、大豆粉（均為食品級(jí)）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：魔芋粉10.0 g/L，酵母粉2.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，調(diào)pH至7.0。121 ℃滅菌15 min。

選擇培養(yǎng)基：魔芋粉10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，K2HPO41.0 g/L，瓊脂粉20 g/L，調(diào)pH至7.0。121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：魔芋粉10g/L，蛋白胨5.0g/L，酵母粉5.0g/L，NaCl 10.0 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，調(diào)pH至7.0。121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，蒸餾水1 000 mL。121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9025型恒溫培養(yǎng)箱：上海森信儀器有限責(zé)任公司；DK-S11數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；TCYQ全溫?fù)u瓶柜：太倉市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；MiniAmp型基因擴(kuò)增儀：美國ABI公司；Axio Imager.M2型全電動(dòng)正置熒光顯微鏡：德國蔡司公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；DChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)：美國Bio-Bad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的篩選

（1）富集培養(yǎng)

稱取土樣2.0 g加入富集培養(yǎng)基中，在200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)24 h。按照2%（V/V）的接種量吸取富集到的菌液接種至新的富集培養(yǎng)基中，相同的條件培養(yǎng)16 h。

（2）初篩

將富集培養(yǎng)得到的菌液用無菌水稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5后，取100 μL在以魔芋粉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基上涂布，于30 ℃恒溫培養(yǎng)培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)得到的單菌落經(jīng)2次平板劃線純化后用于后續(xù)透明圈測(cè)定和產(chǎn)酶測(cè)定。

將選擇培養(yǎng)基的配方中加入0.05%的剛果紅，滅菌后倒置固體培養(yǎng)基。挑取選擇培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行分區(qū)點(diǎn)布后，于30 ℃恒溫培養(yǎng)。觀察透明圈出現(xiàn)的時(shí)間以及大小，記錄透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值（D/d）。

（3）復(fù)篩

選擇D/d值較大即產(chǎn)β-甘露聚糖酶能力較強(qiáng)的菌株，接入種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，按3%（V/V）接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下振蕩培養(yǎng)24 h，在4 ℃、10 000 r/min條件離心10 min，上清液即粗酶液，測(cè)定β-甘露聚糖酶酶活，復(fù)篩菌株。

1.3.2β-甘露聚糖酶活性測(cè)定[20]

采用DNS法測(cè)定β-甘露聚糖酶的活性。以滅活的酶液作為空白對(duì)照，分別取0.1 mL適當(dāng)稀釋的兩種粗酶液與0.5%的甘露聚糖溶液0.9 mL（由pH7.0，0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制）混合均勻，每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，置于50 ℃水浴中反應(yīng)10 min，加入200 μL DNS，煮沸5 min終止反應(yīng)，吸取200 μL顯色液在波長540 nm處測(cè)吸光度值。β-甘露聚糖酶活力的計(jì)算公式如下：

式中：U為β-甘露聚糖酶活力，U/mL；C為甘露聚糖質(zhì)量濃度，μg/mL；V1為加入的底物體積，mL；V為所用粗酶液體積，mL；T為反應(yīng)時(shí)間，min；n為稀釋倍數(shù)。

β-甘露聚糖酶酶活定義[21]：在37 ℃、pH值為5.5反應(yīng)條件下，以每分鐘從質(zhì)量濃度為3 mg/mL甘露聚糖溶液中釋放生成1 μmol甘露聚糖所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.3.3 產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌株的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)觀察

選擇培養(yǎng)基篩選得到的單菌落重新在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，30 ℃培養(yǎng)16 h，觀察菌落形態(tài)特征，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察并記錄菌株形態(tài)。

（2）生理生化試驗(yàn)

依照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》對(duì)菌株進(jìn)行生化鑒定[22]。實(shí)驗(yàn)采用VITEK 芽孢菌鑒定卡進(jìn)行。按照試劑盒說明書操作，記錄、分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（3）分子生物學(xué)鑒定[23]

將菌株接種于LB液體培養(yǎng)基上，在30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h，采用Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒提取篩選菌株的基因組DNA，以其為模板，采用16S rDNA通用引物27F和1492R、gyrB基因通用引物UP-1和UP-2r擴(kuò)增目標(biāo)菌株的16S rDNA序列和gyrB基因序列。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：TaqPCR mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水（ddH2O）23 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。將所得序列結(jié)果提交至美國國家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行基本局部比對(duì)工具（basic local alignment search tool，BLAST）檢索，選取同源性最高的已知菌種的16S rDNA序列和gyrB基因，采用MEGA 6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 種子液的制備

挑取純化后的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，在200 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng)16 h，用于菌株HKS018的產(chǎn)酶條件優(yōu)化。

1.3.5 菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間的確定：在30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量1%，裝液量50 mL/250 mL的條件下，對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，期間每4 h取樣測(cè)定發(fā)酵液β-甘露聚糖酶活性，考察發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

發(fā)酵溫度的確定：在轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量1%，裝液量50 mL/250 mL的條件下，考察發(fā)酵溫度25 ℃、28 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃、48 ℃、51 ℃、54 ℃、57 ℃、60 ℃對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

接種量的確定：在30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0、接種量1%，裝液量50 mL/250 mL的條件下，考察接種量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（V/V）對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

初始pH的確定：在30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量1%，裝液量50 mL/250 mL的條件下，考察初始pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

裝液量的確定：在30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH7.0、發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量1%的條件下，考察裝液量為25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/250mL、100mL/250mL、125 mL/250 mL對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

發(fā)酵轉(zhuǎn)速的確定：在30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH 7.0、發(fā)酵時(shí)間48 h、接種量1%，裝液量50 mL/250 mL的條件下，考察轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min、220 r/min對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

通過富集培養(yǎng)和透明圈篩選從西峽縣西坪鎮(zhèn)后塘溝村多年種植魔芋地土壤樣品中得到6株不同形態(tài)的單菌落，分別標(biāo)記為2號(hào)、3號(hào)、6號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)。挑取代表菌株單菌落接種至含有剛果紅的選擇培養(yǎng)基上，30 ℃過夜培養(yǎng)24 h透明圈見圖1，β-甘露聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果見表1。由圖1可知，6號(hào)菌株具有明顯的水解透明圈，D/d值最大。由表1可知，6號(hào)菌株的發(fā)酵液β-甘露聚糖酶的活性最高，將其命名為HKS018，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行鑒定。

圖1 篩選菌株的水解透明圈Fig.1 Hydrolytic transparent circles of screened strains

表1 篩選菌株的β-甘露聚糖酶酶活測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of β-mannanase activities of screened strains

2.2 菌株HKS018的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)

對(duì)菌株HKS018進(jìn)行劃線培養(yǎng)和革蘭氏染色，其菌落及細(xì)胞形態(tài)分別見圖2。由圖2A可知，其菌落呈淺黃色，近圓形，表面干燥，不透明，邊緣不整齊。由圖2B可知，革蘭氏染色為紫色，為革蘭氏陽性，菌體呈桿狀，（0.7～0.9）μm×（1.5～2.7）μm，單個(gè)或成對(duì)排列。

圖2 菌株HKS018的菌落（A）及細(xì)胞（B）形態(tài)Fig.2 Morphology of colony (A) and cell (B) of strain HKS018

2.3 菌株HKS018的生理生化試驗(yàn)

使用VITEK 芽孢菌鑒定卡對(duì)菌株HKS018的生理生化特性進(jìn)行鑒定，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株HKS018可以D-甘露糖、D-甘露醇、古老糖作為碳源生長，但不能利用環(huán)糊精、D-半乳糖、糖原、肌醇、甲基-D-木糖苷、麥芽三糖、D-松三糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、D-塔格糖、D-海藻糖、D-葡萄糖、D-核糖等。菌株HKS018可在β-木糖苷酶、苯丙氨酸芳胺酶、α-半乳糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、β-半乳糖苷酶、L-吡咯烷酮芳胺酶等酶中生長。菌株HKS018還可水解七葉苷，耐受6.5%的NaCl、多粘菌素B，但對(duì)卡那霉素和竹桃霉素不耐受。將以上生理生化鑒定結(jié)果輸入梅里埃API 50 CHB鑒定系統(tǒng)中，初步鑒定菌株HKS018為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表2 菌株HKS018的生理生化特性測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of physiological and biochemical characteristics of strain HKS018

2.4 菌株HKS018的分子生物學(xué)鑒定

將測(cè)序得到的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果表明與菌株HKS018的同源性達(dá)99.57%以上的菌株有10株，其中同源性最高的菌株有Bacillus cabrialesiiTE3T（MK462260）、Bacillus inaquosorumKCTC 13429T（AMXN01000021）、Bacillus tequilensisKCTC 13622T（AYTO01000043），為99.93%。對(duì)此比對(duì)結(jié)果，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株HKS018的16S rDNA序列與多個(gè)菌株的同源性都非常接近，因此僅依靠16S rDNA序列的同源性比對(duì)無法確定菌株HKS018的種屬。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株HKS018的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain HKS018 based on 16S rDNA gene sequences

gyrB基因編碼DNA促旋酶的B亞單位，序列相對(duì)保守，廣泛存在于細(xì)菌中，目前已應(yīng)用于細(xì)菌鑒定中[23]。對(duì)菌株HKS018的gyrB基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析，其與Bacillus subtilisBCRC 10255T（DQ309293）的同源性最高，為100%。而MEGA軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，與HKS018菌株親緣關(guān)系最近的菌株為Bacillus subtilisBCRC 10255T（DQ309293）。結(jié)合菌株菌落和細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA、gyrB基因序列的比對(duì)分析結(jié)果，鑒定菌株HKS018為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖4 基于gyrB基因序列菌株HKS018的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain HKS018 based on gyrB gene sequences

2.5 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間是決定微生物產(chǎn)酶活性高低的一個(gè)重要因素。由圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在0～48 h內(nèi)的延長，β-甘露聚糖酶活性隨之逐漸升高；發(fā)酵時(shí)間為48 h，β-甘露聚糖酶活性達(dá)到最高，為9.18 U/mL；發(fā)酵時(shí)間＞48 h之后，酶活隨著時(shí)間的延長呈迅速下降趨勢(shì)。推測(cè)可能由于搖瓶發(fā)酵后期營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，菌株進(jìn)入衰亡期導(dǎo)致。因此，菌株HKS018的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間為48 h。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.5 Effect of fermentation time on β-mannanase activity

2.5.2 發(fā)酵溫度的確定

由圖6可知，發(fā)酵溫度為25～30 ℃時(shí)，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活性隨著溫度的升高而升高；發(fā)酵溫度在30 ℃時(shí)，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活性最高；當(dāng)發(fā)酵溫度超過30 ℃之后，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活性隨著溫度的升高而逐漸降低，并且發(fā)酵溫度在超過45 ℃后，活性迅速下降。因此，菌株HKS018的最優(yōu)發(fā)酵溫度為30 ℃。

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on β-mannanase activity

2.5.3 接種量的確定

由圖7可知，接種量在0.25%～1.00%時(shí)，β-甘露聚糖酶活隨著接種量的增加而升高；接種量為1.0%時(shí)，發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活性最高；接種量＞1.0%之后，β-甘露聚糖酶活隨著接種量的增加而下降。說明低接種量造成了發(fā)酵液中生物量過低，酶活水平偏低，但過高的接種量也導(dǎo)致了菌株生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，造成菌株過早進(jìn)入衰亡期，不利于產(chǎn)酶及酶蛋白保持穩(wěn)定。因此，菌株HKS018的最優(yōu)接種量為1.0%。

圖7 接種量對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.7 Effect of inoculum on β-mannanase activity

2.5.4 初始pH的確定

由圖8可知，當(dāng)初始pH在4.0～7.0時(shí)，酶活隨著pH的升高而升高；當(dāng)初始pH在7.0時(shí)，酶活達(dá)到最高；當(dāng)初始pH＞7.0之后，酶活隨著pH的升高而迅速下降。說明過酸、過堿的環(huán)境對(duì)菌株產(chǎn)酶有一定的影響[24]。因此，菌株最優(yōu)初始pH為7.0。

圖8 初始pH對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.8 Effect of initial pH on β-mannanase activity

2.5.5 裝液量的確定

由圖9可知，當(dāng)裝液量為20～50 mL/250 mL時(shí)，發(fā)酵液β-甘露聚糖酶活性隨之增高；當(dāng)裝液量為50 mL/250 mL時(shí)，發(fā)酵液β-甘露聚糖酶活性最高；當(dāng)裝液量＞50 mL/250 mL之后，酶活隨裝液量的增加而迅速降低。因此，菌株發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)裝液量為50 mL/250 mL。

圖9 裝液量對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.9 Effect of liquid volume on β-mannanase activity

2.5.6 轉(zhuǎn)速的確定

由圖10可知，當(dāng)轉(zhuǎn)速在100～180 r/min時(shí)，發(fā)酵液β-甘露聚糖酶活性隨著轉(zhuǎn)速的增加而升高；當(dāng)轉(zhuǎn)速在180 r/min時(shí)，發(fā)酵液β-甘露聚糖酶活性最高；當(dāng)轉(zhuǎn)速＞180 r/min之后，酶活隨著轉(zhuǎn)速的增加而下降。推測(cè)可能由于過高的轉(zhuǎn)速增加了三角瓶對(duì)菌體的剪切力，進(jìn)而導(dǎo)致菌體產(chǎn)酶能力下降。因此，最優(yōu)發(fā)酵轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖10 轉(zhuǎn)速對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響Fig.10 Effect of rotating speed on β-mannanase activity

2.5.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，在單因素試驗(yàn)的最優(yōu)條件下對(duì)菌株HKS018進(jìn)行產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵試驗(yàn)。結(jié)果表明，在發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、初始pH值為7.0、接種量1.0%、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下，菌株HKS018發(fā)酵液中β-甘露聚糖酶活力為68.28 U/mL，比優(yōu)化前酶活力提高了5.29倍。雖然通過發(fā)酵條件優(yōu)化，酶活力有明顯提高，但與已報(bào)道的菌株HDYM-04[25]來源的β-甘露聚糖酶酶活力（4 890 U/mL）差距很大。后續(xù)可考慮將菌株HKS018發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化與發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)合起來進(jìn)一步提高酶活。

3 結(jié)論

本研究從常年種植魔芋的土壤中，通過透明圈法分離到一株可以以魔芋粉為唯一碳源生長的菌株HKS018。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)分析，鑒定菌株HKS018為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。其最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間48 h、初始pH值為7.0、接種量1.0%、裝液量50 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速180 r/min。在此最佳條件下，β-甘露聚糖酶酶活為68.28 U/mL，比優(yōu)化前酶活力提高了5.29倍。本研究為后續(xù)β-甘露聚糖酶在食品和飼料工業(yè)上的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。