李盼盼，張慶芳，劉春瑩，遲乃玉，

（1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622）

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）多存在于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)[1]，具有增強(qiáng)腸道屏障以及調(diào)節(jié)腸道菌群組成[2]、降糖[3]、降膽固醇[4]、保護(hù)肝臟[5]、輔助降血脂[6]、抑制關(guān)節(jié)疼痛[7]、提高機(jī)體免疫應(yīng)答等功能[8]。以固體或液體形式應(yīng)用于人和動(dòng)物，在功能性食品和飲料（乳制品、非乳制品飲料、嬰兒配方奶粉、谷物、肉類、面包）、膳食補(bǔ)充劑、飼料等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[9]。

新型冠狀病毒導(dǎo)致人們的消費(fèi)模式升級(jí)，并最終影響到消費(fèi)者對(duì)飲食的需求。大多數(shù)消費(fèi)者開始選擇含有營(yíng)養(yǎng)增強(qiáng)劑的產(chǎn)品以提高免疫力，從而增加了對(duì)益生菌的需求。在美國(guó)，益生菌類產(chǎn)品2020年的銷量突然上升了33%。因此對(duì)益生菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)具有很高的科研和商業(yè)價(jià)值[10]。目前高密度培養(yǎng)菌株常用且最有效的方法依然是培養(yǎng)基發(fā)酵優(yōu)化，常用的試驗(yàn)方法有單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面法（response surface method，RSM）[11]。響應(yīng)面法是通過(guò)建立連續(xù)變量曲面模型，對(duì)影響試驗(yàn)指標(biāo)的各因子水平及其交互作用進(jìn)行優(yōu)化和評(píng)價(jià)，可快速有效的確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[12]。鄭柳青等[13]采用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化鼠李糖乳桿菌LR-ZB1107-01培養(yǎng)條件，在最優(yōu)條件下，菌體濃度達(dá)9.08×109CFU/mL。

本實(shí)驗(yàn)室前期從西藏康馬鎮(zhèn)薩馬達(dá)鄉(xiāng)娟珊養(yǎng)殖區(qū)的健康耗牛乳和糞便中篩選得到一株鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LP216。本研究對(duì)菌株LP216進(jìn)行高密度培養(yǎng)，對(duì)MRS培養(yǎng)基成分的添加量進(jìn)行單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳添加量，旨在滿足鼠李糖LP216菌劑工業(yè)化生產(chǎn)需求，解決其產(chǎn)量不足等問(wèn)題提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）LP216：篩選自西藏康馬鎮(zhèn)薩馬達(dá)鄉(xiāng)娟珊養(yǎng)殖區(qū)的健康耗牛乳和糞便，保藏于遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 化學(xué)試劑

蛋白胨、酵母提取物、牛肉膏（均為生化試劑）、乙酸鈉、硫酸鎂、葡萄糖、檸檬酸二銨、磷酸氫二鉀、硫酸錳（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、乙酸鈉（CH3COONa）1.0 g/L、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）0.2 g/L、吐溫80 1.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸二銨2.0 g/L、磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.0 g/L、硫酸錳（MnSO4）0.05 g/L、初始pH 6.5。121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉25 g/L。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：上海愛(ài)朗儀器有限公司；Multiskan GO酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；YXQ-LS-100S立式壓力蒸汽滅菌鍋：弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司；SX-610 pH檢測(cè)筆：上海三信儀表廠；1510紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京昊諾斯科技有限公司；ZWY-21020恒溫振蕩搖床：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株LP216種子液的制備

挑選一環(huán)活化好的固體培養(yǎng)基保藏的單菌落接種在液體MRS中，35 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)24 h至光密度（optical density，OD600nm）值0.5～0.6，得到菌株LP216的種子液。

1.3.2 菌株LP216菌體密度和菌落總數(shù)檢測(cè)

按照比濁法測(cè)定菌體密度，以O(shè)D600nm值表示；稀釋瓊脂平板計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)[11]。

1.3.3 菌株LP216高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[14-16]

（1）培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

蛋白胨添加量分別為0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L；牛肉膏添加量分別為0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L；酵母提取物添加量分別為0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L；葡萄糖添加量分別為10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L；CH3COONa添加量分別為3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L；吐溫80添加量分別為0、0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L；MgSO4·7H2O添加量分別為0.10 g/L、0.15 g/L、0.20 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L；檸檬酸二銨添加量分別為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L；K2HPO4添加量分別為1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L、3.0 g/L；MnSO4添加量分別為0、0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.20g/L、0.25 g/L；接種量3%、溫度35 ℃條件靜置培養(yǎng)48 h，檢測(cè)菌體生長(zhǎng)量（OD600nm值）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

（2）Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置N=20的10因素2水平Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)，PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

（3）最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果選擇影響菌株LP216生長(zhǎng)密度的3個(gè)主要因素，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

（4）Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2，每組試驗(yàn)3個(gè)平行。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.4 菌株LP216生長(zhǎng)曲線測(cè)定

菌株LP216生長(zhǎng)曲線繪制：將待測(cè)鼠李糖乳桿菌LP216種子液轉(zhuǎn)接到裝液量為100 mL/250 mL MRS液體培養(yǎng)基中。搖勻后每支試管準(zhǔn)確移入15 mL菌液，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中按照優(yōu)化后的發(fā)酵條件培養(yǎng)，每隔6 h取出一組試管測(cè)定其OD600nm值，稀釋平板法測(cè)定活菌數(shù)，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，繪制菌株LP216生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Graphpad prism軟件7.0進(jìn)行單因素?cái)?shù)據(jù)分析，Minitab 15軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析；Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析通常采用二次多項(xiàng)式回歸模型。并且當(dāng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)時(shí)模型是擬合和可靠的：①模型顯著（模型P值＜0.05），②失擬項(xiàng)不顯著（失擬項(xiàng)P值＞0.05），③決定系數(shù)R2＞0.9。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株LP216高密度發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，對(duì)培養(yǎng)基10種成分的添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分添加量對(duì)菌株LP216生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of each component addition in fermentation medium on the growth of strain LP216

氮源為細(xì)胞生長(zhǎng)提供氨基酸合成所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其添加量會(huì)影響鼠李糖乳桿菌LP216的生長(zhǎng)[17]。由圖1a可知，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨著蛋白胨添加量在0～15 g/L范圍內(nèi)增加而增大；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿吭?5 g/L時(shí)，菌株LP216的生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為2.09；當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿浚?5 g/L之后，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨之下降。因此，蛋白胨最適添加量為15 g/L。

由圖1b可知，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨著牛肉膏添加量在0～5 g/L范圍內(nèi)增加而增大；當(dāng)牛肉膏添加量為5 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為1.94；當(dāng)牛肉膏添加量＞5 g/L之后，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨之下降。牛肉膏通過(guò)影響蛋白質(zhì)的合成影響菌株的生長(zhǎng)[9]，因此，牛肉膏最適添加量為5 g/L。

由圖1c可知，酵母提取物添加量在0～15 g/L時(shí)，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨之增加；酵母提取物添加量在15 g/L時(shí)，菌株LP216的生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為2.13；當(dāng)酵母提取物添加量＞15 g/L之后，菌株LP216的生長(zhǎng)量受到抑制。因?yàn)槿樗峋?xì)胞酶系簡(jiǎn)單[18]，酵母提取液過(guò)低時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠菌株生長(zhǎng)利用，MRS培養(yǎng)基是一個(gè)復(fù)合氮源培養(yǎng)基，酵母提取液過(guò)高時(shí)，可能會(huì)影響菌株對(duì)其他氮源的利用。因此，酵母提取物最適添加量為15 g/L。

由圖1d可知，隨著葡萄糖添加量在10～25 g/L范圍內(nèi)的增加，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨之增加；當(dāng)葡萄糖添加量為25 g/L時(shí)，菌株LP216的生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為2.20；當(dāng)葡萄糖添加量＞25 g/L之后，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨之下降。因?yàn)楦淖兤咸烟堑奶砑恿?，?huì)改變培養(yǎng)基的碳氮比[19]。培養(yǎng)基中碳氮比過(guò)低，菌株生長(zhǎng)過(guò)快，會(huì)發(fā)生提前自溶的現(xiàn)象；碳氮比過(guò)高會(huì)使培養(yǎng)基過(guò)快酸化，從而導(dǎo)致菌體過(guò)早死亡，同樣不利于菌體LP216生長(zhǎng)繁殖。因此，葡萄糖最適添加量為25 g/L。

由圖1e可知，菌株LP216生長(zhǎng)量隨著CH3COONa添加量在3～4 g/L范圍內(nèi)的增加而增大；當(dāng)CH3COONa添加量為4 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為1.95；當(dāng)CH3COONa＞4 g/L之后，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨之下降。因此，CH3COONa的最適添加量為4 g/L。

由圖1f可知，菌株LP216的生長(zhǎng)量隨著吐溫80添加量在0～1.5 g/L范圍內(nèi)的增加而增大；當(dāng)吐溫80添加量為1.5 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為2.05；當(dāng)吐溫80添加量＞1.5 g/L之后，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之下降。因?yàn)橥聹?0作為親水的表面活性劑，其添加量改變會(huì)影響菌株對(duì)自身生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此，吐溫80的最適添加量為1.5 g/L。

由圖1g可知，當(dāng)MgSO4·7H2O添加量在0.10～0.25 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之增長(zhǎng)；當(dāng)MgSO4·7H2O為0.25 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為2.06；MgSO4·7H2O＞0.25 g/L之后，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之減小。因?yàn)檫m量Mg2+在發(fā)酵過(guò)程會(huì)被菌體利用促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平，過(guò)量時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平從而抑制菌株的生長(zhǎng)。因此，MgSO4·7H2O的最適添加量為0.25 g/L。

由圖1h可知，檸檬酸二胺添加量在1.0～2.0 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之增加；當(dāng)檸檬酸二胺添加量為2.0 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為1.95；當(dāng)檸檬酸二胺添加量＞2.0 g/L之后，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之下降。因?yàn)闄幟仕釟涠窞榫彌_鹽，緩沖鹽與菌株LP216生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸結(jié)合，生成乳酸鹽從而降低或消除乳酸對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖的抑制作用[20]。因此，檸檬酸氫二胺的最適添加量為2.0 g/L。

由圖1i可知，當(dāng)K2HPO4添加量為1～2 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之增加；當(dāng)K2HPO4添加量為2 g/L，菌株LP216生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為1.95；當(dāng)K2HPO4添加量＞2 g/L之后，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之下降。乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生某些有機(jī)酸（乳酸、乙酸等），發(fā)酵過(guò)程中pH值會(huì)逐漸降低。K2HPO4作為緩沖劑，可以在菌株發(fā)酵過(guò)程中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，在發(fā)酵過(guò)程中維持適宜的pH對(duì)菌株的生長(zhǎng)十分有利。因此，K2HPO4的最適添加量為2 g/L。

由圖1j可知，菌株LP216生長(zhǎng)量隨著MnSO4的添加量在0～0.2 g/L范圍內(nèi)增加而增大；當(dāng)MnSO4添加量為0.2 g/L，菌體生長(zhǎng)量最大，OD600nm值為2.2；當(dāng)K2HPO4添加量＞0.2 g/L之后，菌株LP216生長(zhǎng)量隨之下降。金屬離子會(huì)通過(guò)影響酶活性，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，MnSO4的最適添加量為0.2 g/L。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)表1影響細(xì)菌發(fā)酵的各因素和水平，采用Minitab 15軟件設(shè)置N=20的Plackett-Burman試驗(yàn)，發(fā)酵48 h后測(cè)其OD600nm值，每組試驗(yàn)3個(gè)平行，結(jié)果見(jiàn)表3，Plackett-Burman試驗(yàn)回歸分析見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)回歸分析Table 4 Regression analysis of Plackett-Burman experiments

續(xù)表

由表4可知，酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖、MnSO4、吐溫80添加量對(duì)菌株LP216生長(zhǎng)量的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中酵母提取物、蛋白胨、葡萄糖這3個(gè)因素的影響效果最為顯著，因此選這3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

最陡爬坡試驗(yàn)可以快速確定最佳中心點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，3個(gè)顯著影響因素的最佳組合因子在第3 組試驗(yàn)附近，因此，以第3組的數(shù)據(jù)作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，即酵母提取物添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）、葡萄糖添加量（X3）分別為16 g/L、13 g/L、30 g/L。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert.V8.0.5b軟件以酵母提取物添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）、葡萄糖添加量（X3）為自變量，以菌株LP216生長(zhǎng)量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)N=17的3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表6試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

由表7可知，該回歸方程模型P＜0.01，表示對(duì)結(jié)果影響極顯著；失擬項(xiàng)P=0.135 3＞0.1證明該模型擬合較好，對(duì)本試驗(yàn)的優(yōu)化分析有意義[21-22]；回歸方程決定系數(shù)R2=0.969 5＞0.9，校正決定系數(shù)R2Adj=0.930 4＞0.9，信噪比＞4，說(shuō)明試驗(yàn)誤差較小，模型相關(guān)性較好[23-25]。該模型一次項(xiàng)X2、X3，交互項(xiàng)X2X3，二次項(xiàng)X22、X32對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)X1X2、X1X3對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

通過(guò)回歸方程分析，得到最佳酵母提取物添加量X1、蛋白胨添加量X2、葡萄糖添加量X3分別為16.25 g/L、13.42 g/L、30.28 g/L時(shí)，菌株LP216生長(zhǎng)量理論OD600nm值為4.83。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)操作情況，將最優(yōu)培養(yǎng)基組分調(diào)整為酵母粉添加量16 g/L、蛋白胨添加量13 g/L、葡萄糖添加量30 g/L。在此最優(yōu)培養(yǎng)基組分條件下，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株LP216生長(zhǎng)量實(shí)際OD600nm值為4.85，與響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的理論值相近，證明該響應(yīng)面優(yōu)化模型可行。

2.5 菌株LP216生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖2可知，優(yōu)化培養(yǎng)基及發(fā)酵條件后菌株LP216，發(fā)酵時(shí)間0～18 h為延滯期，相比對(duì)照組優(yōu)化前活菌數(shù)延滯期縮短了6 h；發(fā)酵時(shí)間18～32 h為指數(shù)增長(zhǎng)期；發(fā)酵時(shí)間32～42 h為平穩(wěn)期。在優(yōu)化后培養(yǎng)基組分中培養(yǎng)42 h后，菌株LP216的最大菌體數(shù)達(dá)到8.9×109CFU/mL，是優(yōu)化前活菌數(shù)的2.71倍，證明本試驗(yàn)提高了發(fā)酵效率。

圖2 菌株LP216的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of strain LP216

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)菌株LP21培養(yǎng)基組分進(jìn)行單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基為酵母粉16 g/L、蛋白胨13 g/L、葡萄糖30 g/L、牛肉膏5 g/L、CH3COONa 4 g/L、吐溫80 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、檸檬酸二胺2.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、MnSO40.2 g/L在此優(yōu)化條件下，菌株LP21活菌數(shù)達(dá)8.9×109CFU/mL，是未優(yōu)化MRS培養(yǎng)基的2.71倍。本研究進(jìn)行高密度菌株LP216發(fā)酵優(yōu)化，提高了發(fā)酵效率，為后續(xù)的鼠李糖乳酸菌產(chǎn)品的工業(yè)化發(fā)展提供參考。