梁芳 魯衛(wèi)星 周天琪 王胤博

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、冠狀動脈旁路移植術(shù)等冠脈再通技術(shù)是把雙刃劍，在改善缺血的同時往往會造成心肌再灌注損傷，加重病情[1]。減輕血管再通后的心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury, MIRI)成為臨床亟待解決的問題。研究表明，鐵死亡參與了MIRI的發(fā)生過程[2]，抑制鐵死亡可減輕MIRI[3]。細(xì)胞鐵死亡有可能成為心肌缺血再灌注新的治療靶點(diǎn)。

龍牙楤木為五加科楤木屬植物，其味辛、微苦，性平，具有益氣活血、止痛、祛風(fēng)濕等功效。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，龍牙楤木總皂苷或其組分能通過減輕鈣超載、減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等途徑減輕MIRI[4-6]，但其能否通過調(diào)節(jié)鐵死亡減輕MIRI仍不明確。因此，本研究通過觀察龍牙楤木總皂苷及其組分楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧AC16心肌細(xì)胞鐵死亡的影響，探討其是否能夠調(diào)控心肌細(xì)胞鐵死亡，并通過該機(jī)制緩解MIRI。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)

人AC16心肌細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)液)中，在常氧培養(yǎng)箱(5%CO2、21%O2、74%N2)、37℃條件下培養(yǎng)，每1～2日換液一次。取生長良好的對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

龍牙楤木總皂苷由吉林省中醫(yī)藥研究院提供，楤木皂苷A購自上海源葉生物公司(批號：B20219)，用二甲基亞楓溶解，以上藥物均分裝貯存于-80℃冰箱，取用時室溫溶解，用DMEM培養(yǎng)液釋至所需濃度。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司(貨號：SH30022.01)；胎牛血清購自美國Gibco公司(批號：1861242)；PBS緩沖液購于上海碧云天生物公司(貨號：C0221A)；CCK-8試劑盒購于同仁化學(xué)研究所(貨號：CK04)；LDH試劑盒購自上海碧云天生物公司(貨號：C0017)；鐵離子試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)公司(貨號：E1042)；MDA試劑盒(貨號：E-EL-0060c)、GSH試劑盒購于武漢伊萊瑞特公司(貨號：E-EL-0026c)；熒光探針-DHE購于南京凱基生物公司(貨號：KGAF019)；P53、SLC7A11、SAT1、GLS2抗體購于美國CST公司(貨號分別為2524S、12691S、61586S、ab113509)。

1.4 模型制備

將生長良好的人AC16心肌細(xì)胞換成缺氧培養(yǎng)液(氮?dú)忸A(yù)飽和過的無血清無糖DMEM)，并轉(zhuǎn)移至缺氧培養(yǎng)箱(94%N2、5%CO2、1%O2)，此過程為缺氧；缺氧完畢后，換成完全培養(yǎng)液并轉(zhuǎn)移至常氧培養(yǎng)箱中，此過程為復(fù)氧。將細(xì)胞分別缺氧12小時/復(fù)氧12小時、缺氧24小時/復(fù)氧12小時、缺氧48小時/復(fù)氧12小時處理，用CCK-8法測定細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)缺氧24小時/復(fù)氧12小時條件下細(xì)胞存活率下降至50%左右，提示此造模時間適合后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故選擇缺氧24小時/復(fù)氧12小時為造模時間。

1.5 分組及給藥

將AC16細(xì)胞分為正常組、模型組、龍牙楤木總皂苷組、楤木皂苷A組。正常組繼續(xù)使用完全培養(yǎng)液并置于常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不做其他處理；模型組按照上述模型制備方法，缺氧24小時/復(fù)氧12小時；龍牙楤木總皂苷組先給予濃度為0.1 mg/L的龍牙楤木總皂苷預(yù)處理6小時后，再進(jìn)行缺氧24小時/復(fù)氧12小時處理；楤木皂苷A組先給予濃度為50 μg/mL的楤木總皂苷A預(yù)處理6小時后，再進(jìn)行缺氧24小時/復(fù)氧12小時處理。(龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A濃度參照課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報道[7-8])。

1.6 指標(biāo)檢測

1.6.1 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將AC16心肌細(xì)胞接種于96孔板，分組處理后，每孔加入10 mL CCK-8溶液，孵育2～4小時，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔吸光度值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.2 乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒檢測LDH漏出率 LDH漏出率可反應(yīng)心肌細(xì)胞損傷程度。檢測步驟：心肌細(xì)胞按分組進(jìn)行不同處理后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)400 g離心5分鐘。盡量吸除上清，加入150 μL用PBS稀釋10倍的LDH釋放試劑，搖晃混勻，孵育1小時。隨后將細(xì)胞培養(yǎng)板400 g離心5分鐘。分別取各孔的上清液120 μL，加入到新的96孔板相應(yīng)孔中。加入60 μL LDH檢測工作液，避光孵育30分鐘，酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔吸光度值。LDH漏出率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-對照孔吸光度)/(空白孔吸光度-對照孔吸光度)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.3 透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 將AC16細(xì)胞按2×105個/孔密度接種于6孔板，經(jīng)分組處理后，將其消化并吸收在PBS中。隨后用2.5%戊二醛固定2小時。按以下步驟制備：修整、制備半薄切片、定位、制備超薄切片及用鉛酸染色。最后，使用透射電鏡觀察并拍照。

1.6.4 鐵離子比色法試劑盒檢測胞內(nèi)Fe2+水平 將AC16心肌細(xì)胞接種于24孔板，經(jīng)分組處理后，去除培養(yǎng)基，用冷的PBS洗滌2次，將PBS吸棄。每孔加入200 μL裂解液裂解細(xì)胞，置于搖床裂解2小時后，加入200 μL混液A(按說明書配置)，混勻，60℃水孵育1小時，再加入30 μL鐵離子檢測劑，混勻，室溫孵育30分鐘，取上述混合液體200 μL于96孔板，在550 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算鐵離子濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6.5 DHE-熒光探針檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平 分組處理后按照使用說明，以DMSO溶解熒光探針DHE為5 mmol/L的儲存液，用無血清培養(yǎng)液稀釋儲存液至終濃度為5 μmol/L的工作液。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL稀釋好的工作液，37℃避光孵育20～30分鐘，用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DHE。孵育后用新鮮培養(yǎng)液清洗細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀觀察，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6.6 酶聯(lián)免疫吸附法檢測丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平 細(xì)胞經(jīng)分組處理后，去除培養(yǎng)基，用冷的PBS洗滌1次，離心收集細(xì)胞，加入200 μL PBS重懸并通過反復(fù)冰融使細(xì)胞破碎，4℃下1 500 g離心10分鐘，取上清于96孔板。每孔加入150 μL GSH工作液或MDA工作液，室溫孵育5分鐘后加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算GSH、MDA含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.6.7 蛋白免疫印跡法檢測鐵死亡相關(guān)蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2的表達(dá) 分組處理后，收集各組心肌細(xì)胞加入適量PMSF裂解液于冰上裂解45分鐘，裂解完于4℃下12 000 r/min離心15分鐘，采用碧云天BCA法測定各組蛋白質(zhì)濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合后于100℃處理5分鐘。通過丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2小時，加入p53、SLC7A11、SAT1、GLS2抗體(1∶500)4℃孵育過夜，用TBST洗滌，二抗(1∶1000)37℃孵育2小時，TBST洗滌4次，用ECL化學(xué)發(fā)光發(fā)檢測各組蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧損傷AC16細(xì)胞存活率及LDH漏出率的影響

與正常組相比，模型組細(xì)胞存活率明顯降低、LDH漏出率明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A預(yù)處理后細(xì)胞存活率明顯升高，LDH漏出率明顯降低(P<0.05)，且龍牙楤木總皂苷的作用更明顯(P<0.05)。見表1。

表1 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對AC16細(xì)胞存活率及LDH漏出率的影響

2.2 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧損傷后AC16細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

透射電鏡下觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)學(xué)變化是評價鐵死亡的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)。正常組細(xì)胞核呈橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體呈短桿狀，結(jié)構(gòu)完整、內(nèi)嵴清晰，細(xì)胞表面可見少量突起。缺氧/復(fù)氧處理后，細(xì)胞核呈不規(guī)則狀，胞質(zhì)內(nèi)線粒體皺縮、內(nèi)嵴粗厚、膜電子密度高，細(xì)胞表面可見少量突起。與模型組相比，經(jīng)龍牙楤木總皂苷預(yù)處理后，細(xì)胞核呈橢圓形，胞質(zhì)內(nèi)線粒體體積稍小、內(nèi)嵴大多清晰，細(xì)胞表面可見少量突起；而楤木皂苷A預(yù)處理后，細(xì)胞核稍不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)線粒體輕微皺縮、內(nèi)嵴稍厚、膜電子密度偏高，細(xì)胞表面可見少量突起?？梢?，經(jīng)龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A處理后，可改善線粒體形態(tài)的損傷變化。見圖1。

注: N 細(xì)胞核；M 胞質(zhì)內(nèi)線粒體。

2.3 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞內(nèi)Fe2+、ROS、MDA、GSH水平的影響

與正常組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，龍牙楤木總皂苷組和楤木總皂苷A組胞內(nèi)Fe2+水平均顯著下降，且龍牙楤木總皂苷組下降更明顯(P<0.05)。見表2。

與正常組相比，模型組細(xì)胞ROS、MDA水平明顯升高，GSH水平降低(P<0.05)；與模型組相比，龍牙楤木總皂苷組及楤木總皂苷A組ROS、MDA水平下降，GSH水平升高，且龍牙楤木總皂苷的作用更明顯(P<0.05)。見表2、表3，圖2。

表2 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧損傷后胞內(nèi)Fe2+、MDA、GSH水平的影響

表3 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧損傷后胞內(nèi)ROS水平的影響

2.4 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對鐵死亡相關(guān)蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組損傷后p53、SAT1、GLS2蛋白表達(dá)水平升高，SLC7A11蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組相比，龍牙楤木總皂苷組及楤木總皂苷A組p53、SAT1、GLS2蛋白表達(dá)水平明顯降低，SLC7A11蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；但龍牙楤木總皂苷組與楤木總皂苷A組之間無明顯差異(P>0.05)。見表4，圖3。

表4 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對鐵死亡相關(guān)蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2表達(dá)的影響

注: 橫坐標(biāo)代表熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)代表細(xì)胞數(shù)目或比例；圖左上數(shù)字代表ROS陰性表達(dá)量，圖右上數(shù)字代表ROS陽性表達(dá)量。

圖3 各組缺氧/復(fù)氧損傷AC16細(xì)胞胞內(nèi)鐵死亡相關(guān)蛋白p53、SLC7A11、SAT1、GLS2表達(dá)情況

3 討論

鐵死亡是與Fe2+過載及脂質(zhì)過氧化損傷有關(guān)的新型細(xì)胞死亡方式，主要生化特征為Fe2+水平升高、ROS聚積、GSH合成下降、過氧化產(chǎn)物MDA堆積[9]。p53是一種抑癌基因，在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡方面發(fā)揮了重要作用[10]。p53可通過抑制SLC7A11的表達(dá)，影響GSH合成，降低抗氧化能力，誘導(dǎo)鐵死亡[11]，或通過上調(diào)其某些靶基因如GLS2、SAT1，減少GSH合成、促進(jìn)膜脂質(zhì)過氧化，誘導(dǎo)鐵死亡[12-13]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)龍牙楤木總皂苷可通過提高GSH活力、增加超氧化物歧化酶活力、降低MDA水平，減輕氧化應(yīng)激損傷，降低細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax的表達(dá)，發(fā)揮抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用[14-16]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步從細(xì)胞鐵死亡角度探討龍牙楤木總皂苷抗心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

研究結(jié)果表明，龍牙楤木中皂苷及其組分楤木皂苷A能夠降低缺氧/復(fù)氧后AC16心肌細(xì)胞內(nèi)Fe2+水平、增加GSH活力、降低ROS、MDA水平，并降低鐵死亡相關(guān)蛋白p53、GLS2、SAT1的蛋白表達(dá)、上調(diào)SLC7A11的蛋白表達(dá)。上述結(jié)果提示龍牙楤木總皂苷及其組分楤木皂苷A可減輕缺氧/復(fù)氧過程中的鐵離子過載及過氧化損傷，抑制細(xì)胞鐵死亡，保護(hù)心肌細(xì)胞。其機(jī)制可能與抑制p53、GLS2、SAT1的表達(dá)及上調(diào)SLC7A11表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步明確。