何健華，郭清泉，王雅馨，何露露，袁宇璽，吳少娟，趙海山

1.廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州山海生物科技有限公司，廣東 廣州 510700；3.廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，廣東 廣州 510080

0 引言

根據(jù)《化妝品分類規(guī)則和分類目錄》[1]中的釋義和說明，舒緩是指有助于改善皮膚刺激等狀態(tài)的一種功效。皮膚刺激是指皮膚在受到物理、化學(xué)等外界因素刺激時(shí)出現(xiàn)刺痛、灼熱、瘙癢等主觀癥狀或紅斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張等客觀癥狀[2]。氣候變化、環(huán)境污染、化妝品原料種類多樣化等因素均有誘發(fā)皮膚刺激的可能性，并且隨著人們護(hù)膚意識(shí)的增強(qiáng)，以及對皮膚刺激了解的加深，宣稱舒緩功效的化妝品逐漸受到關(guān)注和重視，但是對于舒緩功效的評(píng)價(jià)，目前尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一的方法。

目前實(shí)驗(yàn)室的舒緩功效評(píng)價(jià)方法多以炎癥為指標(biāo)，如有研究[3]利用脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生巨噬細(xì)胞RAW264.7，通過測定相關(guān)炎癥因子的含量評(píng)價(jià)化妝品原料的舒緩功效；孔雪等[4]認(rèn)為，可將外源刺激作用于皮膚模型上，經(jīng)化妝品原料處理后，通過測定相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況來評(píng)估其舒緩功效。然而皮膚刺激是一個(gè)涉及人體皮膚屏障功能、神經(jīng)因素及炎癥反應(yīng)的復(fù)雜過程[2]，因此抗炎并非是評(píng)估化妝品原料舒緩功效的唯一指標(biāo)。夏高輝等[5]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩、積雪草等植物提取物能有效抑制透明質(zhì)酸酶的活性，從而增強(qiáng)皮膚屏障。J. Roeding等[6]通過人體測試發(fā)現(xiàn)，抑制神經(jīng)末梢感受器的TRPV1受體的活性可以有效舒緩辣椒素激活的皮膚刺激。但是透明質(zhì)酸酶抑制實(shí)驗(yàn)使用的是體外模型，難以貼近人體環(huán)境；而人體測試難以在數(shù)量龐大的化妝品原料初篩中得到廣泛應(yīng)用。

斑馬魚模型是一種成本低、穩(wěn)定性好、適用于大通量的動(dòng)物評(píng)價(jià)模型。作為化妝品原料刺激性評(píng)價(jià)模型，其優(yōu)勢在于：斑馬魚全年產(chǎn)卵且數(shù)量多，樣本量大；胚胎透明，給藥方式簡單，可以直接觀察化妝品原料對魚體內(nèi)臟器官的影響；斑馬魚與人類的基因高度相似，在斑馬魚上得到的評(píng)價(jià)結(jié)果多數(shù)情況下也適用于人體[7-8]。目前應(yīng)用廣泛的斑馬魚炎癥模型，是在熒光顯微鏡下觀察皮膚炎癥部位的中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的分布情況，采用圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)其數(shù)量，進(jìn)而評(píng)估舒緩功效[9]。但是該模型需要長時(shí)間的預(yù)處理，難以在化妝品原料篩選中推廣應(yīng)用，并且抑制皮膚炎癥并不是評(píng)價(jià)化妝品舒緩功效的唯一指標(biāo)。因此，尋找一種可靠、低成本、貼合人體環(huán)境并且適用于化妝品原料高通量篩選的舒緩功效評(píng)價(jià)方法成為迫切需求。

研究[10]表明，斑馬魚胚胎發(fā)育至24 h(24 hours post-fertilization，簡稱“24 hpf”，下同)會(huì)產(chǎn)生自發(fā)的自旋運(yùn)動(dòng)。斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)頻率與其受到的外界刺激直接相關(guān)，曾被用于環(huán)境毒理評(píng)價(jià)[11-13]，但在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用尚未見報(bào)道。因此，本研究擬以斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)頻率為指標(biāo)篩選造模劑，建立斑馬魚刺激模型用于評(píng)價(jià)常用化妝品原料(甘草酸二鉀、黃芩素)的舒緩功效，并使用傳統(tǒng)斑馬魚炎癥模型進(jìn)行驗(yàn)證對比；利用斑馬魚刺激模型篩選丹皮酚、α-紅沒藥醇、積雪草苷、原花青素及4-叔丁基環(huán)己醇5種常見的舒緩原料對斑馬魚胚胎的舒緩功效，以期為化妝品原料的開發(fā)和舒緩功效的提升提供評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

主要試劑：甘草酸二鉀(純度98%)、丹皮酚(純度99%)、十二烷基硫酸鈉(SDS，純度99%)，購自上海麥克林生化科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO，分析純)，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；原花青素(純度99%)、4-叔丁基環(huán)己醇(純度98%)，購自前衍化學(xué)科技(武漢)有限公司；黃芩素(純度98%)，購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；積雪草苷(純度99%)，購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；4-丁基間苯二酚(純度99.9%)，購自廣州汀蘭生物科技有限公司。

材料：實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚品種為AB系及Tg[lyz:DsRed]系，成年魚齡為6～12個(gè)月，均購于國家斑馬魚資源中心。

主要儀器：SZ680型體式顯微鏡(帶平板液晶數(shù)碼成像系統(tǒng))，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)；Axio Imager.2型熒光正置顯微鏡，德國Carl ZISSE公司產(chǎn)；LBI-175-N型生化培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚胚胎的獲取Holt-Buffer培養(yǎng)液的配制：量取1900 mL 超純水，置于2 L燒杯中，依次加入7.000 g NaCl，0.400 g NaHCO3，0.100 g KCl和0.235 g CaCl2，超純水定容至2000 mL，過濾，常溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

斑馬魚飼養(yǎng)在斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行，早上和下午定時(shí)喂食豐年蟲。飼養(yǎng)水溫為(28.5±0.5) ℃，pH值為7.5±0.5，光周期為14 h光照、10 h黑暗。收集胚胎的前一天下午，選取健康的成年斑馬魚，按雌雄1∶1配對放入配種缸中，并用隔板將雌雄斑馬魚隔開。次日早上亮燈后，抽離隔板，自由交配1 h后收集胚胎。收集的胚胎經(jīng)清洗、挑選后加入適量的Holt-Buffer培養(yǎng)液，置于(28.5±0.5) ℃生化培養(yǎng)箱中孵育待用。按照C.B.Kimmel等[14]的方法對斑馬魚發(fā)育階段進(jìn)行分期。

1.2.2 斑馬魚刺激模型的建立將4-丁基間苯二酚溶于DMSO配制成母液，使用Holt-Buffer培養(yǎng)液將其稀釋至4-丁基間苯二酚濃度分別為5 μmol/L、20 μmol/L、80 μmol/L(DMSO終體積分?jǐn)?shù)為1%)。隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入上述濃度的4-丁基間苯二酚稀釋液，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對照組(Holt-Buffer培養(yǎng)液處理組，DMSO終體積分?jǐn)?shù)為1%)。將SDS溶于Holt-Buffer培養(yǎng)液，配制成125 μmol/L、250 μmol/L、500 μmol/L的溶液。隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入上述濃度的SDS溶液，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對照組(Holt-Buffer培養(yǎng)液處理組)。

4-丁基間苯二酚處理組和空白對照組，于1 h內(nèi)，每隔20 min，采用體式顯微鏡錄像記錄30 s內(nèi)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)。SDS處理組和空白對照組，于45 min內(nèi)，每隔15 min，同樣記錄30 s內(nèi)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)。根據(jù)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)計(jì)算刺激強(qiáng)度，計(jì)算公式如下：

①

式中，n為處理組斑馬魚胚胎自旋運(yùn)動(dòng)的平均次數(shù)/次；m為空白對照組斑馬魚胚胎自旋運(yùn)動(dòng)的平均次數(shù)/次。

1.2.3 斑馬魚刺激模型的驗(yàn)證1)甘草酸二鉀和黃芩素的舒緩功效評(píng)價(jià)。將甘草酸二鉀溶于Holt-Buffer培養(yǎng)液，配制成250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的溶液。隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入上述濃度的甘草酸二鉀溶液，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理1 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組(Holt-Buffer培養(yǎng)液處理組)。將黃芩素溶于DMSO配制成母液，使用Holt-Buffer培養(yǎng)液將其稀釋至黃芩素濃度分別為25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L(DMSO終體積分?jǐn)?shù)為1%)。隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入上述濃度的黃芩素稀釋液，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理1 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組(Holt-Buffer培養(yǎng)液處理組，DMSO終體積分?jǐn)?shù)為1%)。處理結(jié)束后，采用體式顯微鏡錄像記錄30 s內(nèi)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)。將斑馬魚胚胎未出現(xiàn)死亡且自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)與空白對照組對比無顯著增加的濃度組別分別確定為甘草酸二鉀和黃芩素的無可觀察效應(yīng)濃度(NOEC)。

隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的甘草酸二鉀溶液或25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L的黃芩素稀釋液，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理1 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組。處理結(jié)束后，除去96孔板中的溶液，按體積比1∶1分別加入甘草酸二鉀與SDS混合液、黃芩素與SDS混合液(甘草酸二鉀、黃芩素的終濃度保持不變，SDS的終濃度為500 μmol/L)，處理15 min，然后采用體式顯微鏡錄像記錄30 s內(nèi)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)。根據(jù)式①計(jì)算刺激強(qiáng)度，并通過比較斑馬魚胚胎刺激強(qiáng)度的變化來評(píng)估甘草酸二鉀和黃芩素的的舒緩功效。

2)甘草酸二鉀和黃芩素的抗炎作用評(píng)價(jià)。隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、48 hpf的Tg[lyz:DsRed]系斑馬魚胚胎置于24孔板中，每孔10枚，分別加入1 mL 250 μmol/L、500 μmol/L、1000 μmol/L的甘草酸二鉀溶液或12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L的黃芩素稀釋液，每孔1 mL，處理24 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組。處理結(jié)束后，除去24孔板中的溶液，按體積比1∶1分別加入甘草酸二鉀與SDS混合液、黃芩素與SDS混合液(甘草酸二鉀、黃芩素的終濃度保持不變，SDS的終濃度為100 μmol/L)，處理3 h。接著用Holt-Buffer培養(yǎng)液將胚胎清洗3次以除去藥液。在載玻片上滴加1滴質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的甲基纖維素溶液，并將胚胎置于其上固定，在體式顯微鏡下調(diào)整胚胎的位置，最后將載玻片置于正置熒光顯微鏡下，選用Rhod通道對胚胎進(jìn)行拍照，每組選取5枚。利用Image J軟件計(jì)算各處理組斑馬魚卵黃末端至尾部的中性粒細(xì)胞數(shù)目與空白組數(shù)目的比值，得到中性粒細(xì)胞相對數(shù)目/%，定量評(píng)價(jià)甘草酸二鉀和黃芩素對斑馬魚炎癥模型的抗炎作用。

1.2.4 斑馬魚刺激模型應(yīng)用于篩選化妝品舒緩原料根據(jù)4-叔丁基環(huán)己醇、積雪草苷、原花青素、α-紅沒藥醇、丹皮酚5種化妝品原料的溶解特性，分別配制成高濃度的溶液(水溶性或易在水中分散的原料使用Holt-Buffer培養(yǎng)液溶解；難溶于水或不溶于水的化妝品原料使用DMSO溶解)。實(shí)驗(yàn)前，分別用Holt-Buffer培養(yǎng)液將不同濃度的溶液等比稀釋10倍，每種化妝品原料設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組。隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入不同濃度的化妝品原料稀釋液，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理1 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組。處理結(jié)束后，采用體式顯微鏡錄像記錄30 s內(nèi)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)。將斑馬魚胚胎未出現(xiàn)死亡、自旋運(yùn)動(dòng)的次數(shù)與空白對照組對比無顯著增加的濃度組別確定為化妝品原料的NOEC。

隨機(jī)挑選發(fā)育健康、狀態(tài)一致、24 hpf的AB系斑馬魚胚胎置于96孔板中，每孔7枚，分別加入不同濃度的化妝品原料液，每種化妝品原料設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理1 h，同時(shí)設(shè)置空白對照組。處理結(jié)束后，除去96孔板中的溶液，按體積比為1∶1加入混合液(化妝品原料液的終濃度保持不變，SDS的終濃度為500 μmol/L)，處理15 min，然后采用體式顯微鏡錄像記錄30 s內(nèi)斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)次數(shù)。根據(jù)式①計(jì)算刺激強(qiáng)度，并通過比較斑馬魚胚胎刺激強(qiáng)度的變化評(píng)估5種化妝品原料的舒緩功效。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Excel2016、GraphPad Prism 8對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。使用Origin2018軟件作圖，多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 斑馬魚刺激模型構(gòu)建分析

4-丁基間苯二酚是化妝品中常用的美白原料，SDS是化妝品中常用的表面活性劑，兩者均可能導(dǎo)致皮膚刺激的發(fā)生[15-16]。因此，本文分別以4-丁基間苯二酚和SDS為造模劑建立斑馬魚刺激模型，不同濃度的4-丁基間苯二酚和SDS在不同作用時(shí)間對24 hpf斑馬魚胚胎的影響如圖1所示，其中***表示與空白對照組對比，P<0.001。

從圖1a)可以看出，與空白對照組相比，濃度為80 μmol/L 的4-丁基間苯二酚作用40 min時(shí)，斑馬魚胚胎刺激強(qiáng)度具有極顯著差異(P<0.001)，說明4-丁基間苯二酚在該濃度下表現(xiàn)出較強(qiáng)的刺激性；由圖1b)可以看出，與空白對照組相比，濃度為500 μmol/L的SDS作用15 min時(shí)，斑馬魚胚胎刺激強(qiáng)度具有極顯著差異(P<0.001)，說明SDS在該濃度下表現(xiàn)出較強(qiáng)的刺激性。

圖1 不同濃度的4-丁基間苯二酚和SDS在不同作用時(shí)間對24 hpf斑馬魚胚胎的影響Fig.1 Effects of different concentrations of 4-butylresorcinol and sodium dodecyl sulfate on 24 hpf zebrafish embryos at different functional time

確定4-丁基間苯二酚、SDS作用時(shí)間及濃度后，對斑馬魚刺激模型的穩(wěn)定性進(jìn)行測試：將4-丁基間苯二酚、SDS分別重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)并計(jì)算數(shù)據(jù)的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，結(jié)果見表1。由表1可見，4-丁基間苯二酚的RSD大于SDS的RSD，說明前者對斑馬魚胚胎刺激作用的重復(fù)性(穩(wěn)定性)較差。因此選用作用時(shí)間15 min、濃度500 μmol/L的SDS構(gòu)建斑馬魚刺激模型。

表1 4-丁基間苯二酚和SDS對24 hpf斑馬魚胚胎的影響Table 1 Effects of 4-butylresorcinol and SDS on 24 hpf zebrafish embryos

2.2 斑馬魚刺激模型的驗(yàn)證對比

2.2.1 斑馬魚刺激模型對甘草酸二鉀和黃芩素舒緩功效的評(píng)價(jià)甘草酸二鉀具有顯著的抗炎活性[17]，黃芩素在化妝品中具有較好的舒緩抗敏功效[18]，兩者均對皮膚具有較好的舒緩作用。因此，本文首先確定甘草酸二鉀和黃芩素的NOEC，并使用斑馬魚刺激模型對其進(jìn)行舒緩功效評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證該模型的可行性。

表2為甘草酸二鉀和黃芩素處理對24 hpf斑馬魚胚胎的影響。由表2可知，濃度為1000 μmol/L的甘草酸二鉀和濃度為100 μmol/L的黃芩素分別對斑馬魚胚胎處理1 h后，與空白對照組相比，刺激強(qiáng)度未出現(xiàn)顯著增加,且胚胎未出現(xiàn)死亡。

表2 甘草酸二鉀和黃芩素處理對24 hpf斑馬魚胚胎的影響Table 2 Effects of dipotassium glycyrrhizinate and baicalein on 24 hpf zebrafish embryos

確定甘草酸二鉀和黃芩素的NOEC后，使用前述建立的斑馬魚刺激模型對其進(jìn)行舒緩功效評(píng)價(jià)。甘草酸二鉀和黃芩素對24 hpf斑馬魚胚胎刺激的舒緩功效如圖2所示。其中，*表示與模型組對比，P<0.05；** 表示與模型組對比，P<0.01；*** 表示與模型組對比，P<0.001；**** 表示與模型組對比，P<0.000 1，下同。與模型組相比，甘草酸二鉀在低、中、高濃度的3個(gè)給藥組中，胚胎的刺激強(qiáng)度明顯下降(P<0.05)，具有顯著性差異(圖2a))；黃芩素在低、中、高濃度的3個(gè)給藥組中，胚胎的刺激強(qiáng)度明顯下降(P<0.01、P<0.000 1)，具有顯著差異(圖2b))。

圖2 甘草酸二鉀和黃芩素對24 hpf斑馬魚胚胎刺激的舒緩功效Fig.2 Soothing efficacy of dipotassium glycyrrhizinate and baicalin on 24 hpf zebrafish embryos

以上結(jié)果表明，甘草酸二鉀和黃芩素均能有效抑制SDS引起的斑馬魚胚胎刺激強(qiáng)度增強(qiáng)的現(xiàn)象，兩者在斑馬魚刺激模型中的舒緩作用分別與施米麗等[19]和區(qū)梓聰?shù)萚18]的研究結(jié)果一致，表明該模型可用于評(píng)價(jià)化妝品原料的舒緩功效。

2.2.2 傳統(tǒng)斑馬魚炎癥模型對甘草酸二鉀和黃芩素抗炎作用的評(píng)價(jià)抗炎作用是目前評(píng)價(jià)舒緩皮膚

刺激功效的重要指標(biāo)之一。斑馬魚與人的皮膚結(jié)構(gòu)高度相似[20]，可以通過目前廣泛應(yīng)用的斑馬魚炎癥模型評(píng)價(jià)甘草酸二鉀、黃芩素的抗炎作用，從而評(píng)估其舒緩功效。中性粒細(xì)胞的激活、遷移、募集是炎癥反應(yīng)的顯著特征，可以反映機(jī)體的炎癥程度[21]，因此通過計(jì)算斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的數(shù)量即可評(píng)估原料的抗炎作用。

選用Tg[lyz:DsRed]系斑馬魚作為研究對象，將其中性粒細(xì)胞標(biāo)記為紅色，甘草酸二鉀和黃芩素分別處理后，斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的分布情況與相對數(shù)目如圖3、圖4所示，其中，ns表示與模型組相比，P>0.05，下同。由圖3可以看出，與模型組相比，濃度為250 μmol/L的甘草酸二鉀處理后，斑馬魚尾部的中性粒細(xì)胞數(shù)目無顯著變化(P>0.05)；濃度為500 μmol/L、1000 μmol/L的甘草酸二鉀分別處理后，斑馬魚尾部的中性粒細(xì)胞的募集均得到有效抑制(P<0.05、P<0.01)。由圖4可以看出，與模型組相比，濃度為12.5 μmol/L、25 μmol/L的黃芩素分別處理后，斑馬魚尾部的中性粒細(xì)胞數(shù)目無顯著變化(P>0.05)；濃度為50 μmol/L的黃芩素處理后，斑馬魚尾部的中性粒細(xì)胞數(shù)目的募集得到有效抑制(P<0.001)。這說明甘草酸二鉀與黃芩素在安全濃度范圍內(nèi)均能有效抑制斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的募集，從而有效抑制SDS誘導(dǎo)的皮膚炎癥。

圖3 甘草酸二鉀處理后斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的分布情況與相對數(shù)目Fig.3 The distribution and the number of neutrophils in vivo of zebrafish by dipotassium glycyrrhizate

圖4 黃芩素處理后斑馬魚體內(nèi)中性粒細(xì)胞的分布情況與相對數(shù)目Fig.4 The distribution and the number of neutrophils in vivo of zebrafish by baicalein

由此可知，甘草酸二鉀和黃芩素在斑馬魚刺激模型中的舒緩功效與在傳統(tǒng)斑馬魚炎癥模型中的舒緩功效基本一致，也與大多數(shù)已有的評(píng)價(jià)方法研究結(jié)果吻合[18-19,22]。因此推論基于斑馬魚胚胎行為學(xué)構(gòu)建的斑馬魚刺激模型亦可用于化妝品原料舒緩功效評(píng)價(jià)。

2.3 常見化妝品舒緩原料的篩選

α-紅沒藥醇[23]、丹皮酚[24]、積雪草苷[25]、原花青素[26]、4-叔丁基環(huán)己醇[27]在化妝品中均具有一定的舒緩功效及抗炎作用。表3為5種化妝品原料處理對24 hpf斑馬魚胚胎的影響。由表3可知，與空白對照組相比，5種化妝品原料對斑馬魚胚胎處理1 h后，刺激強(qiáng)度未出現(xiàn)顯著性增加且未造成胚胎死亡。

表3 5種化妝品原料處理對24 hpf斑馬魚胚胎的影響Table 3 Effects of 5 cosmetic raw materials on 24 hpf zebrafish embryos

確定5種化妝品原料的NOEC后，使用斑馬魚刺激模型對其進(jìn)行舒緩功效評(píng)價(jià)。5種化妝品原料對24 hpf斑馬魚胚胎刺激的舒緩功效如圖5所示。由圖5可以看出，與模型組相比，α-紅沒藥醇在中、高濃度的2個(gè)給藥組中，胚胎的刺激強(qiáng)度明顯下降(P<0.05、P<0.000 1)，具有顯著差異，而低濃度下胚胎的刺激強(qiáng)度沒有明顯下降(P>0.05)(圖5a))；丹皮酚、積雪草苷和原花青素在高濃度的給藥組中，胚胎的刺激強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降(P<0.000 1、P<0.001、P<0.000 1)，具有極顯著差異(圖5b)、c)、d))；4-叔丁基環(huán)己醇在各個(gè)濃度下，胚胎的刺激強(qiáng)度與模型組相比均無明顯改變(P>0.05)(圖5e))。

圖5 5種化妝品原料對24 hpf斑馬魚胚胎刺激的舒緩功效Fig.5 Soothing efficacy of 5 cosmetic ingredients on zebrafish embryos

利用斑馬魚刺激模型對5種常見的化妝品舒緩原料的篩選結(jié)果表明，中、高濃度α-紅沒藥醇對斑馬魚胚胎具有較好的舒緩功效，高濃度丹皮酚、積雪草苷和原花青素對斑馬魚胚胎具有較好的舒緩功效而4-叔丁基環(huán)己醇對斑馬魚胚胎不具有舒緩功效。其原因可能是4-叔丁基環(huán)己醇是環(huán)己醇類化合物，具有一定的麻醉作用[28]，會(huì)抑制斑馬魚胚胎本身的自旋運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致4-叔丁基環(huán)己醇的NOEC過低，在此模型中表現(xiàn)的舒緩效果不佳。

3 結(jié)論

本文以斑馬魚胚胎的自旋運(yùn)動(dòng)頻率為指標(biāo)，利用SDS作為造模劑構(gòu)建斑馬魚刺激模型；分別采用該模型和傳統(tǒng)斑馬魚炎癥模型對甘草酸二鉀和黃芩素的舒緩功效和抗炎作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以驗(yàn)證斑馬魚刺激模型的可行性。同時(shí)利用斑馬魚刺激模型對α-紅沒藥醇、丹皮酚、積雪草苷、原花青素和4-叔丁基環(huán)己醇5種原料進(jìn)行舒緩功效的評(píng)價(jià)篩選。結(jié)果表明：SDS濃度500 μmol/L、對24 hpf斑馬魚胚胎作用時(shí)間15 min的斑馬魚刺激模型，刺激性最強(qiáng)且重復(fù)性較好；應(yīng)用該模型評(píng)價(jià)甘草酸二鉀和黃芩素的舒緩功效，與斑馬魚炎癥模型的評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致；α-紅沒藥醇、丹皮酚、積雪草苷及原花青素在斑馬魚刺激模型中表現(xiàn)出一定的舒緩功效。本文建立的舒緩功效評(píng)價(jià)方法可通過斑馬魚胚胎行為學(xué)直觀地反映化妝品原料的舒緩功效，為化妝品原料的開發(fā)和舒緩功效評(píng)價(jià)提供了一種較好的方法。而化妝品舒緩原料在斑馬魚胚胎模型中的作用機(jī)制是否與傳統(tǒng)模型一致，目前尚不明確，還需進(jìn)一步深入研究。