王艷，張煜松，劉興麗,2，張艷艷,2，張華,2，王宏偉,2

1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001

0 引言

綠豆(VignaradiataL.)作為重要的食用豆類和傳統(tǒng)功能性食品[1]，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)、黃酮、酚類等營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗腫瘤、降血脂、清熱解毒等功效[2-3]，以綠豆淀粉為原料制作的食品深受人們的喜愛(ài)。綠豆中淀粉含量較高，約占全種子質(zhì)量的54.73%～57.99%，其中較高的直鏈淀粉含量(30%～45%)使綠豆淀粉具有較好的膠凝能力和黏結(jié)性，因此綠豆成為淀粉提取的重要來(lái)源[4-5]。作為一種新型膳食纖維，抗性淀粉(Resistant Starch，RS)特殊的分子結(jié)構(gòu)會(huì)限制其與酶的結(jié)合能力，導(dǎo)致其在腸道中不易被淀粉酶消化、吸收，從而較好地調(diào)控餐后血糖反應(yīng)[4]，可用于開(kāi)發(fā)低熱量的功能性食品。目前，RS已引起業(yè)界的廣泛關(guān)注，并成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。綠豆較高的直鏈淀粉含量使其成為制備RS的重要原料，如何提高綠豆的RS產(chǎn)量及加工適用性成為亟待解決的問(wèn)題。

濕熱處理(Heat-moisture Treatment，HMT)技術(shù)具有工藝簡(jiǎn)單、節(jié)能環(huán)保、快速安全等優(yōu)點(diǎn)，是一種易被消費(fèi)者接受的綠色環(huán)保物理改性技術(shù)。淀粉的濕熱處理是指將淀粉在較低水分含量(10%～30%)、較高溫度(90～130 ℃)條件下處理一定時(shí)間(15 min～6 h)，即通過(guò)水分子和熱的共同作用改變淀粉的結(jié)構(gòu)和理化特性進(jìn)而影響其應(yīng)用特性[6]。濕熱處理能有效增加RS含量，是制備RS較常見(jiàn)的方法[7]。目前，關(guān)于濕熱處理增加RS含量的研究主要集中于玉米、大米、小麥、甘薯、馬鈴薯等谷物及薯類淀粉材料方面[8-10]，如J.L.Chang等[10]研究了濕熱處理對(duì)馬鈴薯淀粉消化性能的影響，發(fā)現(xiàn)濕熱處理能有效增加RS含量。而通過(guò)濕熱處理增加綠豆中RS含量的研究仍較少?；诖?，本文擬采用濕熱處理對(duì)綠豆淀粉進(jìn)行改性，研究濕熱處理對(duì)綠豆淀粉結(jié)構(gòu)及理化特性的影響，以期為研發(fā)綠豆RS增值產(chǎn)品提供思路，也為濕熱處理制備綠豆RS的研究和應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆(豫綠2號(hào))，河南億昌生物技術(shù)有限公司產(chǎn)；KBr、醋酸鈉、豬胰α-淀粉酶(8×USP/g)、淀粉糖苷酶(316 U/mL)，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)；葡萄糖試劑盒，愛(ài)爾蘭Megazyme公司產(chǎn)。以上試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)公司產(chǎn)；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)；250 mL高壓反應(yīng)釜，上海秋佐科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)；D8 advance型X射線衍射儀、Vertex 70型傅里葉變換紅外光譜儀，德國(guó)Bruker公司產(chǎn)；BWS 465-785 S型高性能便攜式激光拉曼光譜儀，美國(guó)Microtrac有限公司產(chǎn)；RVA 4500型快速黏度測(cè)定儀，澳大利亞波通儀器有限公司產(chǎn)；Discovery 型流變儀、DSC Q20型差示掃描量熱儀，美國(guó)TA公司產(chǎn)；TU-1810PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)；AtlasTM25 T型手動(dòng)液壓機(jī)，英國(guó)Specac公司產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 綠豆淀粉的制備將綠豆洗凈后，與去離子水按照m(綠豆/g)∶V(去離子水/mL)=1∶5混合浸泡12 h；磨漿過(guò)100目篩，去除雜質(zhì)和皮渣，將濾液于3500 r/min條件下離心10 min；于下層沉淀中加入5倍體積的去離子水，攪拌后離心，去除上清液，對(duì)下層沉淀進(jìn)行洗滌，重復(fù)上述步驟3次。將洗滌后的下層沉淀于40 ℃烘箱中干燥24 h，粉碎過(guò)100目篩，即得綠豆淀粉。

1.3.2 綠豆淀粉的濕熱處理準(zhǔn)確稱量20 g綠豆淀粉(干基)，添加適量去離子水，使淀粉體系中水分含量分別為15%、20%、25%和30%，并于4 ℃條件下平衡24 h。將平衡后的樣品轉(zhuǎn)移至200 mL高壓反應(yīng)釜中，于110 ℃干燥箱中濕熱處理4 h，將反應(yīng)結(jié)束的高壓反應(yīng)釜取出靜置冷卻。冷卻后將樣品取出，于45 ℃烘箱中干燥24 h后，研磨過(guò)篩。將濕熱處理后的綠豆淀粉樣品分別命名為HMT-15、HMT-20、HMT-25和HMT-30，其中15、20、25、30分別代表濕熱處理過(guò)程中相應(yīng)淀粉體系的水分含量，將濕熱處理前的綠豆淀粉樣品作為對(duì)照組。

1.3.3 結(jié)晶結(jié)構(gòu)測(cè)定將濕熱處理前后的綠豆淀粉樣品于室溫下平衡24 h后，將其均勻平鋪在樣品池中，采用X射線衍射儀測(cè)定其結(jié)晶結(jié)構(gòu)。參數(shù)設(shè)置為：工作電壓40 kV，管流30 mA，掃描范圍2θ=4°～40°，步長(zhǎng)0.033°。根據(jù)王宏偉[11]的方法計(jì)算綠豆淀粉樣品的相對(duì)結(jié)晶度(RC)。

1.3.4 傅里葉紅外光譜測(cè)定稱量約2 mg綠豆淀粉樣品(干基)，按照m(綠豆淀粉樣品)∶m(KBr)=1∶100添加KBr粉末，于石英研缽中混合研磨均勻，采用手動(dòng)液壓機(jī)壓制成厚度約0.5 mm的薄片。以4 cm-1的分辨率對(duì)每個(gè)樣品掃描64次，記錄綠豆淀粉樣品在4000～400 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜圖，并對(duì)所得光譜圖進(jìn)行去卷積和分峰處理。

1.3.5 拉曼光譜測(cè)定利用配備785 nm激發(fā)光源的高性能便攜式激光拉曼光譜儀記錄濕熱處理前后綠豆淀粉樣品的拉曼光譜。參數(shù)設(shè)置為：測(cè)試范圍3200～400 cm-1，累計(jì)掃描6次，分辨率4 cm-1，以空氣為背景。記錄480 cm-1處波段的半峰寬(FWHM)。

1.3.6 熱力學(xué)特性測(cè)定采用差示掃描量熱儀測(cè)定濕熱處理前后綠豆淀粉樣品的熱穩(wěn)定性。按照m(綠豆淀粉樣品)∶m(去離子水)=1∶2配制綠豆淀粉乳液，于4 ℃條件下平衡24 h后，準(zhǔn)確稱取10 mg綠豆淀粉乳液于測(cè)試鋁盒中，以10 ℃/min的速率記錄綠豆淀粉樣品從20 ℃升溫至120 ℃的熱流曲線，并以密封的空鋁盒為參照。

1.3.7 糊化特性測(cè)定按照GB/T 24852—2010[12]的方法測(cè)定濕熱處理前后綠豆淀粉樣品的糊化特性。將綠豆淀粉樣品配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%(干基)的淀粉乳液，準(zhǔn)確移取25 g淀粉乳液于鋁罐中，采用快速黏度測(cè)定儀進(jìn)行分析測(cè)定。程序設(shè)置為：以960 r/min的轉(zhuǎn)速于35 ℃條件下保溫1 min，降速至160 r/min并保持恒定，以5 ℃/min升溫至 95 ℃并保溫 10 min，隨后以5 ℃/min降溫至50 ℃并保溫10 min。

1.3.8 消化特性測(cè)定參照H.N.Englyst等[13]的方法測(cè)定濕熱處理前后綠豆淀粉的體外消化率，并稍加改動(dòng)。具體方法為：將1 g綠豆淀粉樣品和15 mL醋酸鈉緩沖液(0.1 mol/L ，pH值為5.2)于50 mL錐形瓶中混合均勻，分別加入5顆玻璃珠后，放入100 ℃水浴鍋中煮制30 min，制得煮熟的綠豆淀粉糊，取出后冷卻至37 ℃；將綠豆淀粉糊放入37 ℃、190 r/min的振蕩水浴鍋中，加入5 mL淀粉酶混合液進(jìn)行水解；分別在水解20 min和120 min時(shí)取0.5 mL水解液，于100倍體積乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)為70%)中滅酶活；將滅酶活的樣品于4000 r/min條件下離心10 min，取0.1 mL離心后的上清液，利用葡萄糖試劑盒測(cè)定水解過(guò)程中的葡萄糖含量，根據(jù)不同時(shí)間酶解葡萄糖含量計(jì)算樣品的快消化淀粉(Rapidly Digestible Starch，RDS)、慢消化淀粉(Slowly Digestible Starch,SDS)和RS含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

上述所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。采用SPSS16.0和Origin 2018分析處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 濕熱處理對(duì)綠豆淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的影響分析

淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)是由淀粉雙螺旋結(jié)構(gòu)的排列、堆積和取向構(gòu)成的[14]。圖1為濕熱處理前后綠豆淀粉的X射線衍射曲線。由圖1可知，綠豆淀粉樣品分別在2θ為15°、17°、18°和23°處顯示特征衍射峰，其中在15°和23°處表現(xiàn)為單峰衍射峰，而在17°和18°處表現(xiàn)為雙峰衍射峰，這表明綠豆淀粉為典型的A型結(jié)晶類型，這與王立東等[15]的研究結(jié)果一致。濕熱處理后，綠豆淀粉的特征衍射峰無(wú)明顯變化，這表明濕熱處理未改變綠豆淀粉的結(jié)晶類型。根據(jù)淀粉結(jié)晶區(qū)和無(wú)定形區(qū)在X射線衍射曲線中不同特征衍射峰的表現(xiàn)形式可計(jì)算淀粉的RC[16]。濕熱處理前后綠豆淀粉的RC如表1所示。由表1可知，濕熱處理前綠豆淀粉的RC為31.6%，濕熱處理后綠豆淀粉的RC明顯降低(P<0.05)，且RC隨著體系水分含量的增加進(jìn)一步降低。這可能是由于在水分子和熱的共同作用下，淀粉分子內(nèi)或分子間的氫鍵斷裂，由氫鍵構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度的解旋，阻礙了雙螺旋結(jié)構(gòu)間的定向取向和緊密排列，導(dǎo)致綠豆淀粉的RC明顯降低。

圖1 濕熱處理前后綠豆淀粉的X射線衍射曲線Fig.1 X-ray diffraction patterns of native and HMT treated mung bean starch

2.2 濕熱處理對(duì)綠豆淀粉短程有序化結(jié)構(gòu)的影響分析

在傅里葉紅外光譜圖中，由于1045 cm-1和1022 cm-1處的特征衍射峰分別與淀粉微觀結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無(wú)定形結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此可通過(guò)計(jì)算1045 cm-1與1022 cm-1處峰強(qiáng)度的比值(R1045/1022)研究濕熱處理過(guò)程中綠豆淀粉聚集結(jié)構(gòu)表面的短程有序化程度[17]。R1045/1022與淀粉短程有序化程度成正比，即R1045/1022越小，淀粉的短程有序化程度越低。圖2為濕熱處理前后綠豆淀粉的傅里葉去卷積圖譜，根據(jù)該圖計(jì)算的R1045/1022見(jiàn)表1。由表1可知，濕熱處理顯著降低了綠豆淀粉的R1045/1022(P<0.05)，且隨著綠豆淀粉水分含量的增加，R1045/1022下降趨勢(shì)更顯著，由未處理前的1.52降至1.15。這表明濕熱處理導(dǎo)致綠豆淀粉顆粒的短程有序化程度降低，結(jié)構(gòu)趨于無(wú)序，且水分含量越高，濕熱處理對(duì)綠豆淀粉的短程有序化程度破壞越大。這是由于濕熱處理導(dǎo)致綠豆淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)比重降低，且隨著反應(yīng)過(guò)程中淀粉體系水分含量的增加，更多的水分子給予了淀粉鏈或其鏈段更大的自由體積，使淀粉分子鏈之間原有的氫鍵被破壞得更徹底，進(jìn)而使淀粉分子的短程有序化程度降低。

圖2 濕熱處理前后綠豆淀粉的傅里葉去卷積圖譜Fig.2 Deconvoluted FTIR spectra of native and HMT-treated mung bean starch

表1 濕熱處理前后綠豆淀粉的RC和短程有序化結(jié)構(gòu)Table 1 RC and short-range ordered molecular structure of native and HMT-treated mung bean starch

拉曼光譜可以用來(lái)分析淀粉分子基團(tuán)和化學(xué)鍵的伸縮振動(dòng)[18]。圖3為濕熱處理前后綠豆淀粉的拉曼光譜曲線。由圖3可知，濕熱處理前后綠豆淀粉的特征基團(tuán)振動(dòng)峰的位置無(wú)明顯變化，表明濕熱處理未改變綠豆淀粉的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成。有研究[19]表明，淀粉的拉曼光譜位移在480 cm-1處特征峰的FWHM與其短程有序結(jié)構(gòu)相關(guān)，即FWHM越大，短程有序化程度越低。由表1可知，濕熱處理后淀粉的FWHM增加，且隨著處理體系中水分含量的增加，F(xiàn)WHM呈上升趨勢(shì)，表明綠豆淀粉分子的短程有序化程度降低，這與紅外光譜的分析結(jié)果一致。

圖3 濕熱處理前后綠豆淀粉的拉曼光譜曲線Fig.3 Raman spectra of native and HMT-treated mung bean starch

2.3 濕熱處理對(duì)綠豆淀粉熱力學(xué)特性的影響分析

表2為濕熱處理前后綠豆淀粉的熱力學(xué)參數(shù)。由表2可知，與濕熱處理前的綠豆淀粉相比，濕熱處理明顯提高了綠豆淀粉糊化過(guò)程中的熱轉(zhuǎn)變溫度，即起糊溫度(To)、峰值溫度(Tp)和終止溫度(Tc)均升高(P<0.05)，且上述溫度均隨體系水分含量的增加而逐漸升高。熱轉(zhuǎn)變溫度的升高是由于濕熱處理在破壞淀粉結(jié)晶結(jié)構(gòu)的同時(shí)，增強(qiáng)了分子間的相互作用，使淀粉分子重排形成熱穩(wěn)定性較高、結(jié)構(gòu)更完善的有序結(jié)構(gòu)(雙螺旋和結(jié)晶結(jié)構(gòu))。隨著綠豆淀粉處理體系水分含量的增加，這種現(xiàn)象更加明顯，這主要是因?yàn)樗趾康脑黾佑欣谠鰪?qiáng)淀粉分子鏈在濕熱處理過(guò)程中的活性，使分子間更易相互作用生成具有更高熱穩(wěn)定性的有序結(jié)構(gòu)[20]。有研究[21]表明，糊化焓(ΔH)代表淀粉顆粒在糊化過(guò)程中破壞其內(nèi)部結(jié)晶結(jié)構(gòu)和無(wú)定形結(jié)構(gòu)所需要的能量。濕熱處理導(dǎo)致綠豆淀粉ΔH顯著降低(P<0.05)，表明濕熱處理破壞了綠豆淀粉顆粒的有序結(jié)構(gòu)，且破壞程度隨濕熱處理過(guò)程中體系水分含量的增加而增強(qiáng)。

表2 濕熱處理前后綠豆淀粉的熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Thermal behavior parameters of native and HMT-treated mung bean starch

2.4 濕熱處理對(duì)綠豆淀粉糊化特性的影響分析

圖4和表3分別為濕熱處理前后綠豆淀粉的成糊曲線及對(duì)應(yīng)的糊化特性參數(shù)。由圖4和表3可知，濕熱處理顯著增加了綠豆淀粉的起始糊化溫度(PT)，并導(dǎo)致峰值黏度(PV)、終值黏度(FV)、崩解值(BD)、回生值(SB)及整體糊化黏度降低。糊化溫度的升高是由于在濕熱處理過(guò)程中，水分子的存在促進(jìn)了淀粉分子鏈的遷移，增強(qiáng)了淀粉分子間的相互作用，使熱處理過(guò)程中破壞淀粉分子間相互作用所需的能量增加。且有研究[22]表明，濕熱處理會(huì)破壞淀粉結(jié)構(gòu)中不完美的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使原有的結(jié)晶結(jié)構(gòu)更趨于完美，而破壞這些結(jié)晶結(jié)構(gòu)需要的更多熱量使淀粉成糊溫度升高。上述現(xiàn)象隨著濕熱處理過(guò)程中體系水分含量的增加不斷增強(qiáng)，這是由于濕熱處理過(guò)程中水分含量越多，對(duì)淀粉顆粒內(nèi)部分子鏈間的促進(jìn)作用越強(qiáng)。淀粉糊黏度的降低說(shuō)明改性淀粉的溶脹能力降低，這可能是由于濕熱處理增強(qiáng)了淀粉分子的相互作用。而SB的降低則進(jìn)一步說(shuō)明了在加熱過(guò)程中淀粉的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)，導(dǎo)致直鏈淀粉浸出和重排減少。

表3 濕熱處理前后綠豆淀粉的糊化特性參數(shù)Table 3 Pasting property parameters of native and HMT-treated mung bean starch

圖4 濕熱處理前后綠豆淀粉的成糊曲線Fig.4 Pasting curve of native and HMT-treated mung bean starch

2.5 濕熱處理對(duì)綠豆淀粉消化特性的影響分析

表4為濕熱處理前后綠豆淀粉的消化特性參數(shù)。由表4可知，濕熱處理前綠豆淀粉的RDS、SDS和RS含量分別為74.1%、10.3%和15.6%，而濕熱處理后綠豆淀粉的RDS含量降低，SDS和RS含量分別增加，且這種趨勢(shì)隨著處理體系中水分含量的增加而不斷增強(qiáng)。該結(jié)果表明濕熱處理降低了淀粉的消化速率。這是由于濕熱處理促進(jìn)了淀粉分子內(nèi)和分子間氫鍵的斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致晶體結(jié)構(gòu)非晶化(相對(duì)結(jié)晶度降低)和短程有序化結(jié)構(gòu)降低。但分散的淀粉分子鏈又會(huì)重新排列，增強(qiáng)淀粉分子的熱穩(wěn)定性，降低淀粉分子對(duì)酶的敏感性，導(dǎo)致淀粉的消化速率減慢。而隨著樣品體系中水分含量的增加，更多的水分子給予了淀粉鏈或其鏈段更大的自由體積，促進(jìn)了淀粉分子相互結(jié)合形成氫鍵，促使新的有序化結(jié)構(gòu)形成，進(jìn)而阻礙了酶的結(jié)合位點(diǎn)。

表4 濕熱處理前后綠豆淀粉的消化特性參數(shù)Table 4 Digestion property parameters of native and HMT-treated mung bean starch %

3 結(jié)論

本文研究了濕熱處理過(guò)程中不同水分含量綠豆淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)、短程有序化結(jié)構(gòu)、熱力學(xué)特性、糊化特性及消化特性。結(jié)果表明，濕熱處理不改變綠豆淀粉的結(jié)晶類型，但水分子和熱的共同作用改變了綠豆淀粉的聚集結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其相對(duì)結(jié)晶度和短程有序化程度降低；聚集結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變?cè)鰪?qiáng)了綠豆淀粉的糊化穩(wěn)定性，提高了體系的熱轉(zhuǎn)變溫度，降低了綠豆淀粉糊的黏度，即濕熱處理在降解淀粉分子鏈的同時(shí)也會(huì)使淀粉鏈的自由運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，促進(jìn)淀粉鏈的重排和取向；上述結(jié)果也導(dǎo)致了濕熱處理后綠豆淀粉的RS含量顯著增加。本研究可為濕熱處理制備RS的研究提供理論依據(jù)，并為綠豆增值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。