崔旭輝，尚佳，李喜香*，陳國(guó)華，周婷婷，劉永昌

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫(yī)院 藥學(xué)部，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730000

補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸是清代醫(yī)家錢壽昌經(jīng)驗(yàn)方——補(bǔ)腎壯筋湯隨癥加減而成，目前臨床主要用于治療骨質(zhì)疏松型氟骨癥[1-2]，療效較好。研究表明，氟骨癥已經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間困擾全球大部分貧困地區(qū)的居民[3]，而中醫(yī)認(rèn)為，此類病癥屬于“骨痹”和“筋痹”范疇[4]。故全方由熟地黃、山茱萸、當(dāng)歸等10 味中藥組成，其中熟地黃、山茱萸補(bǔ)益肝腎、益精填髓；杜仲、續(xù)斷、五加皮強(qiáng)筋健骨、療傷續(xù)折；當(dāng)歸、白芍、川牛膝補(bǔ)血活血、柔肝止痛；茯苓、青皮行氣健脾，諸藥合用，共奏補(bǔ)腎強(qiáng)筋功效。

目前，補(bǔ)腎壯筋方以湯劑入藥，但湯劑作為傳統(tǒng)劑型存在煎煮繁瑣、攜帶困難、口感不佳等缺點(diǎn)，故本課題組擬將其開(kāi)發(fā)為穩(wěn)定性高、服藥和攜帶方便的濃縮丸劑。經(jīng)過(guò)前期相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，方中君藥熟地黃中的指標(biāo)成分毛蕊花糖苷已經(jīng)改為地黃苷D，并且測(cè)定地黃苷D 成分含量的文獻(xiàn)較少，在當(dāng)前中藥復(fù)方成分含量測(cè)定成為熱點(diǎn)的前提下，多指標(biāo)、多成分的測(cè)定已成為共識(shí)[5-7]。故本研究將地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸的含量及浸膏得率一同作為考察指標(biāo)，最后采用多指標(biāo)總評(píng)歸一法結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸提取工藝的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)，以期為該濃縮丸劑提取工藝的優(yōu)化提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY ARC 型高效液相色譜儀，配置四元溶劑管理器、FTN-R 型樣品管理器、2998 型二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Waters 公司）；KQ-300DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；98-1-BN 型電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；SECURA125-1CN 型十萬(wàn)分之一天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；Elix Essential 5 型純水機(jī)（德國(guó)默克公司）；RE3000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；ZXFD-A5140 型鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品地黃苷D（批號(hào)：L16J11Y118585，純度：98%）、馬錢苷（批號(hào)：P22F10F81444，純度：98%）、莫諾苷（批號(hào)：P11M11F112846，純度：97%）、阿魏酸（批號(hào)：L03A9D57744，純度：98%）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純（德國(guó)默克公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

藥材熟地黃（批號(hào)：191214）、山萸肉（批號(hào)：200803）、當(dāng)歸（批號(hào)：190812）、杜仲（批號(hào)：190501）、川牛膝（批號(hào)：200101）、茯苓（批號(hào)：200704）、白芍（批號(hào)：191109）、續(xù)斷（批號(hào)：200404）、青皮（批號(hào)：191210）、五加皮（批號(hào)：20200701）均購(gòu)自甘肅康樂(lè)藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)甘肅省中醫(yī)院李喜香主任中藥師鑒定為正品，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版（一部）項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取液的制備

按處方稱取藥材55 g于圓底燒瓶中，加水550 mL，浸泡30 min，加熱回流60 min，提取2 次，4 層紗布濾過(guò)，得水提液，減壓濃縮并定容至55 mL，即得。

2.2 莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Waters Sun Fire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～7 min，5%～6%A；7～8 min，6%～10%A；8～20 min，10%～16%A；20～30 min，16%～20%A；30～36 min，20%～25%A；36～39 min，25%～5%A；39～44 min，5%A）；體積流量：1.0 mL·min–1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：252 nm。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸對(duì)照品適量于5 mL 量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為1.121、1.042、0.560 mg·mL–1的莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取適量，置于同一5 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸質(zhì)量濃度分別為0.448、0.416、0.031 mg·mL–1的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液制備 精密量取2.1 項(xiàng)下提取液5 mL 于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，超聲40 min?；靹蚝笥?.2 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方工藝分別制得缺山茱萸、當(dāng)歸的陰性樣品，按2.1及2.2.3項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，按2.2.1 項(xiàng)下條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，各成分均能達(dá)到基線分離（分離度>1.5），陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸中莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸的HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為4.48、8.96、22.40、35.84、44.80 μg·mL–1的莫諾苷對(duì)照品溶液，4.16、8.32、20.80、33.28、41.60 μg·mL–1的馬錢苷對(duì)照品溶液，0.31、0.62、1.54、2.46、3.10 μg·mL–1的阿魏酸對(duì)照品溶液，分別精密吸取10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸中莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸線性關(guān)系

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸峰面積RSD 分別為2.12%、2.65%、1.37%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于2、4、6、8、12、24 h 按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸峰面積RSD 分別為2.01%、2.85%、1.92%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一提取液，按2.2.3 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸含量RSD 分別為1.91%、2.44%、1.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取3 個(gè)成分含量已知的供試品溶液1.0 mL，共9 份，每3 份為一組，分別按低（80%）、中（100%）、高（120%）3 個(gè)水平精密加入2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.2.3 項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸中莫諾苷、馬錢苷、阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 地黃苷D含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Waters Sun Fire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液（5∶95）；體積流量：1.0 mL·min–1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取地黃苷D 對(duì)照品適量于5 mL 量瓶中，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.925 mg·mL–1的地黃苷D 對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密吸取適量，置于同一5 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為0.183 mg·mL–1的地黃苷D 對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 精密量取2.1 項(xiàng)下提取液5 mL 于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干。加甲醇溶解，定容至25 mL，超聲40 min。混勻后用0.2 μm 的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.3.4 陰性樣品溶液制備 按處方工藝，制得缺熟地黃的陰性樣品，按2.1 及2.3.3 項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，各成分均能達(dá)到基線分離（分離度>1.5），表明該方法專屬性良好。

圖2 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸中地黃苷D的HPLC圖

2.3.6 線性關(guān)系考察 精密量取地黃苷D 對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容，制成質(zhì)量濃度分別為1.83、3.66、9.15、14.46、18.30 μg·mL–1的地黃苷D 對(duì)照品溶液，精密吸取10 μL，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，Y=10 191X–3 277.5（r=0.999 7），在1.83～18.30 μg·mL–1線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得地黃苷D 峰面積RSD為2.51%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于2、4、6、8、12、24 h 按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得地黃苷D 峰面積RSD 為2.29%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份提取液，按2.3.3 項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得地黃苷D 含量RSD 為2.66%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取地黃苷D 含量已知的供試品溶液1.0 mL，共9 份，每3 份為一組，分別按低（80%）、中（100%）、高（120%）3 個(gè)水平精密加入2.3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按2.3.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按2.3.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得地黃苷D 平均加樣回收率為100.21%，RSD為1.86%。

2.4 浸膏得率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取2.1 項(xiàng)下提取液5 mL，置已干燥至質(zhì)量恒定的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，烘箱中105 ℃干燥3 h，移至干燥器中冷卻至室溫，迅速精密稱定質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算干浸膏提取率[8]。

2.5 工藝優(yōu)化

2.5.1 單因素試驗(yàn) 通過(guò)前期查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，對(duì)于大多數(shù)苷類成分來(lái)說(shuō)，水提比醇提效果更好[9]，結(jié)合本劑型通常不采用醇提[10]，故本研究采用水提。篩選提取次數(shù)、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、溶劑量，按2.1 項(xiàng)下方法制備提取液，進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知，提取數(shù)為1～2 次時(shí)4 個(gè)成分提取量增長(zhǎng)較為急劇，而2～3次時(shí)較緩，甚至下降，并且提取次數(shù)為非連續(xù)變量，無(wú)法進(jìn)行回歸處理，故將其固定為2次；浸泡時(shí)間為45 min時(shí)4個(gè)成分提取量最高，故選擇30～60 min進(jìn)行考察；提取時(shí)間為30～60 min時(shí)4個(gè)成分提取量增加較緩，60～90 min時(shí)增加較快，隨后又逐漸下降減緩，故選擇60～120 min 進(jìn)行考察；溶劑量為10 倍時(shí)4 個(gè)成分提取量達(dá)到最高并逐漸變緩，故選擇8～12倍水進(jìn)行考察。

圖3 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.2 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，將浸泡時(shí)間（A）、提取時(shí)間（B）、溶劑量（C）作為考察因素[11-12]，以地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸含量和浸膏得率的總評(píng)歸一值（OD值）作為響應(yīng)值進(jìn)行綜合評(píng)分，通過(guò)Hassan 法[13]對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理，由于本研究要求各指標(biāo)成分含量越大越好，故選擇公式（2）計(jì)算各指標(biāo)OD值。

其中，di為各指標(biāo)的OD 值，Yi為指標(biāo)測(cè)定值，Ymax、Ymin分別為各指標(biāo)在20 次實(shí)驗(yàn)中的最大值、最小值；OD=（d1d2……dn）1/n，其中n為所選取的指標(biāo)數(shù)。設(shè)計(jì)三因素五水平試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表3。

按處方比例稱取藥材共55 g，按表3 參數(shù)加熱回流提取2次，減壓濃縮至55 mL，測(cè)定提取液中各指標(biāo)成分含量及浸膏得率，計(jì)算OD 值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表4數(shù)據(jù)分別進(jìn)行多元線性、二項(xiàng)式回歸擬合分析，分別得到A、B、C 與OD 值之間的回歸模擬方程：OD=–0.858 28+0.006 02A+0.006 83B+0.036 31C（r=0.541 4）、OD=1.129 68+0.016 98A–0.015 84B–0.238 69C–0.000 07AB–0.000 62AC–0.000 59BC+0.000 02A2+0.000 18B2+0.017 80C2（r=0.852 7），結(jié)果表明二項(xiàng)式回歸模型擬合度更好，可用于優(yōu)化工藝。方差分析見(jiàn)表5。

表4 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5 可知，模型F=6.43，P<0.01，表明模型具有極顯著影響；F失擬＝0.26，P=0.914 6>0.05，表明模型失擬項(xiàng)不顯著，可以用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；因素B、B2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），因素A 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而交互項(xiàng)均不顯著；各因素的影響程度依次為B>A>C。

表5 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸提取工藝響應(yīng)面方差分析結(jié)果

利用Design Expert 8.0.6 軟件得到二次回歸方程等高線及響應(yīng)曲面圖，從而確定最佳提取工藝參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4～6。由圖4～6 可知，B 的等高線密度均大于A和C，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)成分提取量的影響最大，與方差分析結(jié)果一致，且指標(biāo)成分隨著3個(gè)因素的增加而有增加的趨勢(shì)；最終確定最佳提取工藝為12倍水，浸泡60 min，提取120 min，提取2次。

圖4 浸泡時(shí)間與溶劑量對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖

再按上述最佳工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證，測(cè)得OD 值分別為0.723 7、0.702 9、0.743 3，平均為0.723 3，RSD 為2.79%，同時(shí)與預(yù)測(cè)值0.745 7 相比偏差為3.0%，表明工藝穩(wěn)定可行、重復(fù)性良好。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸提取工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

補(bǔ)腎強(qiáng)筋方原劑型為湯劑，但因攜帶不便、患者依從性較差，故改為濃縮丸劑。全方以熟地黃、山茱萸為君藥，當(dāng)歸、杜仲為臣藥，續(xù)斷、五加皮、白芍、茯苓、青皮為佐藥，川牛膝為使藥。其中，熟地黃的指標(biāo)成分為地黃苷D[5]，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有提高免疫力、抗骨質(zhì)疏松、抗炎等藥理作用[14]；山茱萸活性成分為馬錢苷和莫諾苷[5]，具有抑制軟骨細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、延緩骨關(guān)節(jié)炎等藥理作用[15-16]；當(dāng)歸的活性成分為阿魏酸[5]，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗成骨細(xì)胞凋亡等藥理作用[17]。這4個(gè)成分的藥理作用與補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸發(fā)揮補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨藥效作用有關(guān)，同時(shí)充分考慮了處方君臣佐使的組方原則、藥物各自的化學(xué)性質(zhì)。臣藥杜仲中的指標(biāo)成分松脂醇二葡萄糖苷[5]在本研究中含量較低，可能與其膠絲有關(guān)[18]，為了減小誤差，本研究未將松脂醇二葡萄糖苷作為指標(biāo)成分。因此，本研究將地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸作為指標(biāo)成分。另外，浸膏得率也常作為中藥復(fù)方提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)[19]，故也將其納入研究。

圖5 浸泡時(shí)間與提取時(shí)間對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖

圖6 提取時(shí)間與溶劑量對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖

本研究采用190～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，經(jīng)查閱文獻(xiàn)，4個(gè)成分的吸收波長(zhǎng)差異較大[5]，本課題組在多次驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，252 nm時(shí)各峰的吸收明顯好于237 nm，且分離度良好，故最終確定203、252 nm 檢測(cè)。在流動(dòng)相方面，本研究考察了甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水，發(fā)現(xiàn)后者峰形更好，各成分分離效果更佳，最后綜合考慮將后者作為流動(dòng)相。

在權(quán)重系數(shù)的選擇上，由于多指標(biāo)評(píng)價(jià)采用打分制時(shí)存在一定主觀性，故本研究對(duì)其進(jìn)行歸一化處理，以地黃苷D、馬錢苷、莫諾苷、阿魏酸含量和浸膏得率的總評(píng)OD 值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸的提取工藝。結(jié)果表明，補(bǔ)腎強(qiáng)筋丸最佳提取工藝為12 倍水提取2次，每次浸泡60 min，提取120 min，所得OD 值與預(yù)測(cè)值相當(dāng)，表明該方法提取效率較高、重復(fù)性較好、工藝穩(wěn)定可行。