代熙，郭然，黃厚鈺，耿澤宇，袁皓，翟玉生，郝恩普，李衛(wèi)東*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；2.山東坤和堂藥業(yè)股份有限公司，山東 菏澤 274000；3.通渭縣清涼沅金銀花產(chǎn)業(yè)扶貧開(kāi)發(fā)有限公司，甘肅 通渭 743300；4.巨鹿縣發(fā)展和改革局，河北 巨鹿 055250

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，自古以來(lái)作為對(duì)抗瘟疫流感的上品良藥，具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功能[1]。在抗擊2020 年新型冠狀病毒疫情中，金銀花在預(yù)防期用藥處方中出現(xiàn)頻次較高[2]，在阻止疫情擴(kuò)散中發(fā)揮了較大作用。以綠原酸為代表的酚酸類成分是金銀花中主要的藥效成分，是其抗菌消炎的物質(zhì)基礎(chǔ)；木犀草苷等黃酮類成分具有抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)免疫等作用，也是區(qū)分金銀花和山銀花的標(biāo)志性物質(zhì)[3]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版增加了綠原酸、3,5-二-O-咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸A）和4,5-二-O-咖啡?？鼘幩幔ó惥G原酸C）3 個(gè)酚酸類成分總量的指標(biāo)，對(duì)金銀花藥材質(zhì)量提出了更高的要求，而當(dāng)前缺少對(duì)金銀花中3種酚酸類成分總量指標(biāo)的研究報(bào)道。

金銀花的主產(chǎn)區(qū)為山東省平邑縣、河南省封丘縣和河北省巨鹿縣[4]。隨著國(guó)家脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略的推行，金銀花因其適應(yīng)性好、宜栽種成活并且利潤(rùn)較高，被作為經(jīng)濟(jì)植物在全國(guó)貧困地區(qū)大面積栽種。近些年出現(xiàn)了許多新興產(chǎn)區(qū)，如新疆、甘肅和云南等，目前上述新產(chǎn)區(qū)的金銀花研究報(bào)道較少，缺少對(duì)比評(píng)價(jià)。這些新產(chǎn)區(qū)通常處于高原等偏遠(yuǎn)地帶，當(dāng)?shù)氐墓庹?、土壤、氣候等自然條件可能會(huì)對(duì)金銀花質(zhì)量帶來(lái)影響，隨著《中國(guó)藥典》2020 年版增加了檢測(cè)指標(biāo)，市場(chǎng)對(duì)金銀花的質(zhì)量要求更加嚴(yán)格。因此，通過(guò)對(duì)不同地區(qū)金銀花藥材進(jìn)行調(diào)查分析，了解當(dāng)前金銀花質(zhì)量情況，并以此為依據(jù)制定金銀花藥材等級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)規(guī)范金銀花藥材市場(chǎng)、推動(dòng)未來(lái)金銀花產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料

1.1 試藥

對(duì)照品綠原酸（批號(hào)：Y22M8K36544）、異綠原酸A（批號(hào)：Z05M10X87215）、異綠原酸C（批號(hào)：Z05M10X87215）、木犀草苷（批號(hào)：Y13J10H93050）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%；乙腈（色譜純，美國(guó)賽默飛世爾科技公司），甲醇、乙醇、磷酸、乙酸（分析純，北京化工廠），娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 儀器

LC-20 A 型高效液相色譜儀[配置SPD-M20A型二極管陣列（PDA）檢測(cè)器、SIL-20A 型自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A 型柱溫箱，日本島津公司]；Diamonsil Plus C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，迪馬科技有限公司）；ZORBAX SB-phenyl 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)安捷倫科技公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；QUINTIX65-1CN 型十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 樣品

課題組于2020年5—7月從全國(guó)不同地區(qū)收集各等級(jí)規(guī)格的金銀花，其中道地產(chǎn)區(qū)樣品采集于河北巨鹿、山東平邑和河南封丘，各16 份；新產(chǎn)區(qū)樣品分別采集于甘肅通渭、新疆喀什、云南云龍、陜西蒲城、寧夏中衛(wèi)，各6 份。共計(jì)8 個(gè)地區(qū)78 份樣品，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李衛(wèi)東研究員鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，樣品信息見(jiàn)表1。

表1 金銀花樣品信息

2 方法

2.1 外觀性狀測(cè)定

目前，已有研究中以色澤、花蕾個(gè)數(shù)、花蕾長(zhǎng)度、褐變率、黃條率、開(kāi)花率和枝葉率等外觀性狀作為金銀花等級(jí)區(qū)分指標(biāo)[5-9]。對(duì)于中藥材商品規(guī)格而言，等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的制定應(yīng)盡量遵循可操作性和簡(jiǎn)便易行的原則[10]。在金銀花實(shí)際生產(chǎn)中，色澤、黃條率和枝葉率是最典型的外觀形狀，因此本研究選擇上述3個(gè)外觀指標(biāo)用來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)和等級(jí)區(qū)分。

色澤：觀察金銀花樣品整體顏色進(jìn)行并分類，見(jiàn)圖1。根據(jù)數(shù)量分類學(xué)中多態(tài)性狀的編碼方法分為黃色、黃綠色、綠色3個(gè)等級(jí)[5]，用連續(xù)排列正整數(shù)1～3進(jìn)行編碼，金銀花樣品整體呈黃色者賦值“1”；黃綠色或綠色夾雜較多黃條者賦值“2”；綠色賦值“3”。

圖1 不同等級(jí)金銀花外觀顏色對(duì)比

黃條率和枝葉率：按照五點(diǎn)取樣法，從樣品中選取10 g 金銀花，分離出黃色金銀花和已經(jīng)開(kāi)放的金銀花并稱定質(zhì)量，計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)，得到黃條率；同理分離出枝葉碎屑計(jì)算得到枝葉率。

2.2 指標(biāo)成分含量測(cè)定

按《中國(guó)藥典》2020 年版金銀花【含量測(cè)定】項(xiàng)下方法檢測(cè)樣品中酚酸類和木犀草苷成分含量，其中酚酸類成分包括綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C，并計(jì)算3種酚酸的總含量。

2.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2018 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理；采用SIMCA 14.1軟件對(duì)不同地區(qū)和加工方式的金銀花進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）；采用SPSS 26.0 對(duì)不同等級(jí)金銀花進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和相關(guān)性檢驗(yàn)；采用SPSSAU 20.0 計(jì)算不同等級(jí)金銀花的相關(guān)性權(quán)重（CRITIC）。

3 結(jié)果

3.1 金銀花外觀性狀和指標(biāo)成分分析

金銀花外觀性狀和指標(biāo)成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。本研究共收集了30 份黃色金銀花、28 份黃綠色金銀花、20 份綠色金銀花，其中黃條率的變化范圍較大，為2.67%～97.44%，而枝葉率均小于10%。

表2 78批金銀花的外觀形狀和指標(biāo)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

續(xù)表2

續(xù)表2

3.1.1 不同色澤的金銀花和指標(biāo)成分含量的關(guān)系使用Origin 2018將各指標(biāo)成分的結(jié)果繪制成散點(diǎn)圖，并根據(jù)色澤編碼對(duì)各樣本點(diǎn)進(jìn)行相應(yīng)的顏色標(biāo)注，見(jiàn)圖2，可直觀觀察到綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.17%～3.66%，平均值為2.42%（《中國(guó)藥典》2020 年版要求≥1.5%）；異綠原酸A 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.02%～3.53%，平均值為2.12%；異綠原酸C 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.07%～0.35%，平均值為0.18%；3 種酚酸成分的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.34%～6.59%，平均值為4.72%（《中國(guó)藥典》2020年版要求≥3.8%）；木犀草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.045%～0.185%，平均值為0.084%（《中國(guó)藥典》2020 年版要求≥0.05%），說(shuō)明實(shí)驗(yàn)所用金銀花樣品具有代表性。

圖2 不同顏色金銀花指標(biāo)成分含量分布散點(diǎn)圖（n=78）

3.1.2 不同地區(qū)的金銀花色澤和指標(biāo)成分含量對(duì)比 不同地區(qū)的金銀花色澤和指標(biāo)成分含量對(duì)比見(jiàn)表3。在8個(gè)產(chǎn)區(qū)中，云南云龍地區(qū)的金銀花色澤數(shù)值最低，甘肅通渭的金銀花色澤數(shù)值最高。山東、河南、河北3 個(gè)主產(chǎn)地區(qū)金銀花的指標(biāo)成分含量差別不大，其中河南金銀花綠原酸和木犀草苷含量在3 個(gè)主產(chǎn)區(qū)中最高，但總酚酸含量最低；河北金銀花綠原酸含量最低，但總酚酸含量最高；山東金銀花各成分含量介于兩者之間。而新產(chǎn)區(qū)金銀花指標(biāo)成分含量相差較大，其中通渭金銀花綠原酸、木犀草苷含量和總酚酸含量高于其他5 個(gè)地區(qū)；云南金銀花綠原酸含量最低，但異綠原酸A 和異綠原酸C含量最高；新疆金銀花綠原酸和木犀草苷含量和主產(chǎn)區(qū)類似，然而異綠原酸A、異綠原酸C 及總酚酸含量在6個(gè)地區(qū)中最低。

表3 不同地區(qū)金銀花顏色和成分含量對(duì)比（）

表3 不同地區(qū)金銀花顏色和成分含量對(duì)比（）

3.1.3 不同加工方式的金銀花色澤和指標(biāo)成分含量對(duì)比 不同加工方式的金銀花色澤和指標(biāo)成分含量對(duì)比見(jiàn)表4。不同加工處理的金銀花色澤數(shù)值大小為：烘干>殺青烘干>陰干>曬干。殺青烘干處理的金銀花綠原酸、異綠原酸C 和總酚酸含量最高；烘干處理的金銀花木犀草苷含量最高；曬干處理的金銀花總酚酸含量最低；陰干處理的金銀花異綠原酸A含量最高，但綠原酸和木犀草苷含量最低。

表4 不同加工方式金銀花顏色和成分含量對(duì)比（）

表4 不同加工方式金銀花顏色和成分含量對(duì)比（）

3.2 金銀花等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分

3.2.1 PCA 為了分析金銀花藥材質(zhì)量的差異性規(guī)律，在剔除指標(biāo)含量低于《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定的12 份不合格樣品后，使用SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行PCA，根據(jù)樣品的產(chǎn)地和加工方式對(duì)66 批金銀花進(jìn)行分組，分別得到PCA 得分圖（圖3）。由圖3A可知，3個(gè)主產(chǎn)區(qū)的金銀花分布特征相似，可將3個(gè)主產(chǎn)區(qū)作為一個(gè)整體，并且陜西蒲城、寧夏中衛(wèi)和新疆喀什地區(qū)的金銀花與主產(chǎn)區(qū)特征相近，分布重合。但甘肅通渭和云南云龍地區(qū)的部分樣品與主產(chǎn)區(qū)樣品距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明這2 個(gè)地區(qū)金銀花特征與主產(chǎn)區(qū)差異較大。在圖3B中，PCA模型可以對(duì)不同加工方式的樣品進(jìn)行較好地區(qū)分，其中烘干與殺青烘干分布較為重疊、相似度高，但這2 種加工方式與曬干、陰干區(qū)分界限明顯，說(shuō)明不同加工方式會(huì)對(duì)金銀花質(zhì)量產(chǎn)生較大影響，并且從整體上可以將烘干和殺青烘干歸為一類（機(jī)器加熱干燥）、曬干和陰干歸為一類（自然晾干）。

在主成分因子載荷圖（圖3 C）中，橫縱坐標(biāo)分別為在第1 主成分及第2 主成分中各指標(biāo)對(duì)PCA 模型的貢獻(xiàn)率，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)表明該指標(biāo)對(duì)樣品的差異貢獻(xiàn)率越大[11]?？偡铀岷?、綠原酸含量、色澤及黃條率在第1 主成分上載荷量較大，異綠原酸A、異綠原酸C 和木犀草苷含量在第2 主成分上載荷量較大，說(shuō)明這些指標(biāo)是影響金銀花產(chǎn)生等級(jí)差異的主要因素。

圖3 金銀花PCA（n=66）

3.2.2 HCA 由PCA 結(jié)果可知，54、61、63 號(hào)為離群樣本，將66 批合格樣品中3 個(gè)離群樣本剔除，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，運(yùn)用SPSS 26.0 進(jìn)行HCA，聚類方法為瓦爾德法，利用歐式平方距離法進(jìn)行計(jì)算，聚類結(jié)果見(jiàn)圖4。HCA 將金銀花分為4 類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中Ⅰ類金銀花顏色多為綠色，其綠原酸含量、總酚酸含量、木犀草苷含量最高，異綠原酸A、異綠原酸C 含量、枝葉率和黃條率較低；Ⅱ類金銀花主要為綠色和黃綠色，其綠原酸含量、異綠原酸A、異綠原酸C 含量、總酚酸含量水平次高；Ⅲ類和Ⅳ類之間距離較近，顏色均為黃綠色或黃色，其中Ⅲ類金銀花各含量指標(biāo)較低，Ⅳ類金銀花綠原酸含量最低，但異綠原酸A 和異綠原酸C 含量最高，枝葉率和黃條率最高。因此對(duì)金銀花的質(zhì)量等級(jí)劃分為4類比較合適。

圖4 金銀花樣品HCA

3.2.3 相關(guān)性檢驗(yàn) 使用SPSS 26.0繼續(xù)對(duì)HCA處理的樣品各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表5。除水分外，其他指標(biāo)之間的相關(guān)性較強(qiáng)，適合用作等級(jí)劃分。綠原酸含量與色澤、總酚酸含量及木犀草苷含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與黃條率、枝葉率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），但是與異綠原酸A含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），綠原酸和異綠原酸A均為正向指標(biāo)卻具有負(fù)相關(guān)性，因此兩者不適合同時(shí)用作等級(jí)劃分的指標(biāo)；木犀草苷含量與綠原酸含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與異綠原酸A、異綠原酸C含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），同樣木犀草苷也不適合與異綠原酸A、異綠原酸C 含量一起作為等級(jí)劃分指標(biāo)?？紤]到各指標(biāo)之間的相關(guān)性和沖突性，以及實(shí)際操作的簡(jiǎn)便性，用作等級(jí)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)劃分的指標(biāo)不宜太多，最終選擇3 個(gè)外觀形狀指標(biāo)（色澤、黃條率、枝葉率）和3 個(gè)內(nèi)在成分指標(biāo)（綠原酸含量、總酚酸含量、木犀草苷含量）綜合進(jìn)行等級(jí)劃分。

表5 金銀花各項(xiàng)等級(jí)指標(biāo)相關(guān)性檢驗(yàn)

3.2.4 綜合權(quán)重分析 層次分析法（AHP）是最常用的主觀權(quán)重賦值法，其通過(guò)決策者的經(jīng)驗(yàn)判斷各指標(biāo)的相對(duì)重要程度，來(lái)合理地給出各指標(biāo)權(quán)重，進(jìn)而對(duì)項(xiàng)目進(jìn)行優(yōu)劣排序[12]。將本研究指標(biāo)分為6個(gè)層次，各層次之間的相對(duì)重要程度為總酚酸含量（X5）>綠原酸含量（X4）>顏色（X1）>木犀草苷含量（X6）=黃條率（X2）>枝葉率（X3），所構(gòu)建的判斷矩陣評(píng)分見(jiàn)表6，一致性比率因子（CR）=0.016<0.10，滿足一致性檢驗(yàn)，計(jì)算得到顏色、黃條率、枝葉率、綠原酸含量、總酚酸含量、木犀草苷含量的指標(biāo)權(quán)重分別為0.155 4、0.090 1、0.040 3、0.228 4、0.380 8、0.105 1。指標(biāo)CRITIC 是一種客觀權(quán)重賦值法，其原理是利用數(shù)據(jù)自身波動(dòng)性和相關(guān)性進(jìn)行分析，相較于主觀權(quán)重賦值法更能直觀反映各指標(biāo)權(quán)重的關(guān)系[13]。計(jì)算權(quán)重前需要先將數(shù)據(jù)進(jìn)行極值標(biāo)準(zhǔn)化，再導(dǎo)入SPSSAU 20.0 軟件構(gòu)建判斷矩陣，得出判斷矩陣的對(duì)比強(qiáng)度與沖突性指標(biāo)，確定各指標(biāo)權(quán)重系數(shù)分別為0.239 6、0.221 6、0.115 8、0.098 5、0.126 4、0.188 7。將上述兩種方法結(jié)合，按公式（1）計(jì)算綜合權(quán)重（ω）。

表6 金銀花等級(jí)指標(biāo)AHP優(yōu)先判斷矩陣

式中ωAHP-CRITIC表示6個(gè)指標(biāo)各自的ω，對(duì)各樣本進(jìn)行綜合評(píng)分，能夠基于主觀和客觀兩個(gè)方面進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，其結(jié)果更能反映樣本實(shí)際情況，6 個(gè)指標(biāo)各自的ω分別為0.247 9、0.130 5、0.030 5、0.147 0、0.314 5 和0.1296。最終按公式（2）計(jì)算綜合得分（Q）。

綜合得分結(jié)果見(jiàn)圖5、表7，分值越高說(shuō)明金銀花質(zhì)量越好，其分布符合正態(tài)分布（P=0.200>0.05），進(jìn)一步將樣品分為4 個(gè)區(qū)間[14]，參考4 個(gè)區(qū)間各指標(biāo)范圍進(jìn)行等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的劃分，得到最終等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，見(jiàn)表8。

表7 金銀花樣品綜合得分結(jié)果

表8 金銀花等級(jí)質(zhì)量劃分標(biāo)準(zhǔn)

圖5 金銀花樣品綜合得分分布直方圖

4 討論

《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定金銀花中綠原酸含量不得低于1.5%，酚酸類總量不得低于3.8%，木犀草苷含量不得低于0.05%?？偡铀岷繛椤吨袊?guó)藥典》2020 年版新增指標(biāo)，規(guī)定為金銀花中3 個(gè)咖啡?？鼘幩岬目偤?，用來(lái)總體評(píng)價(jià)金銀花中酚酸類成分的含量特征。本研究共計(jì)12 份樣品含量不達(dá)標(biāo)，其中綠原酸不達(dá)標(biāo)的樣品數(shù)量最少，僅有2 份；有3 份樣品的木犀草苷含量不達(dá)標(biāo)；總酚酸含量不合格的樣品最多，共8 份，說(shuō)明目前金銀花生產(chǎn)不能僅僅關(guān)注綠原酸含量，還應(yīng)重視總體酚酸類成分水平的提高。

通過(guò)對(duì)比不同產(chǎn)地金銀花成分含量和PCA 得分圖發(fā)現(xiàn)，主產(chǎn)區(qū)金銀花質(zhì)量相對(duì)比較穩(wěn)定，3 大產(chǎn)區(qū)金銀花特征比較類似。而新產(chǎn)區(qū)金銀花含量相差較大，可能是處于不同土壤地理?xiàng)l件和氣候環(huán)境的原因。山東、河南、河北3 個(gè)主產(chǎn)區(qū)同為溫帶季風(fēng)氣候，地理氣候條件類似。甘肅通渭處于黃土高原，海拔較高，紫外線輻射強(qiáng)，氣候干旱；新疆地區(qū)位于溫帶大陸性氣候區(qū)，晝夜溫差大，光照充足；云南云龍位于云貴高原，當(dāng)?shù)貧夂驖駶?rùn)，水資源豐富。這些新產(chǎn)區(qū)的地理氣候環(huán)境同主產(chǎn)區(qū)有很大的不同。金銀花是適應(yīng)性很強(qiáng)的植物，耐干旱耐貧瘠，如果生產(chǎn)種植管理得當(dāng)，這些脅迫環(huán)境可能會(huì)有利于金銀花有機(jī)酸、黃酮等次生代謝物質(zhì)的積累，促進(jìn)藥效成分含量的提升[15]。本研究?jī)H限于《中國(guó)藥典》2020年版限定的檢測(cè)指標(biāo)，新產(chǎn)區(qū)金銀花其他化學(xué)成分和藥理藥效是否同主產(chǎn)區(qū)存在差異還有待研究驗(yàn)證。

目前，市場(chǎng)上金銀花加工方式主要為烘干、曬干，少數(shù)為殺青烘干，偶有陰干。本研究通過(guò)對(duì)不同加工方式的金銀花樣品進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)不同加工方式得到的金銀花顏色不同。烘干處理的金銀花顏色偏綠，而曬干金銀花顏色偏黃[7]，殺青烘干得到的金銀花顏色多為黃綠色，但殺青烘干金銀花綠原酸含量和總酚酸含量最高。雖然傳統(tǒng)認(rèn)為“金銀花色青者佳”[16]，但不能僅通過(guò)顏色來(lái)判斷金銀花質(zhì)量，還需結(jié)合藥效成分含量的高低進(jìn)行分級(jí)定類。本研究通過(guò)聚類分析和相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行等級(jí)劃分驗(yàn)證，再利用綜合評(píng)分法確定權(quán)重，最終將金銀花劃分為4 個(gè)等級(jí)。該分級(jí)方法通過(guò)結(jié)合外觀形狀和內(nèi)在成分進(jìn)行等級(jí)劃分，既保證一定的科學(xué)性，符合目前市場(chǎng)通用的分類習(xí)慣和實(shí)際情況，對(duì)金銀花生產(chǎn)和市場(chǎng)流通具有一定的參考意義。