陳鋼，許永劼，黃昶煜東，林海容，楊婷婷，朱麗英，李興，潘衛(wèi)△

糖尿病腦病（diabetes encephalopathy，DE）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，且無(wú)有效的治療手段［1］。組蛋白乙?；揎椩贒M 及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［2］。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）參與組蛋白乙?；揎?，在一些神經(jīng)退行性疾病中，兩者通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡影響突觸可塑性［3］，這與本課題組在高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡中發(fā)現(xiàn)一致［4］。因此，尋找合適的藥物調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化，改善神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有重要的臨床意義。何首烏是中國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有增強(qiáng)免疫、提高DNA 修復(fù)能力等功效［5-6］，其可用于治療DM［7］。何首烏的主要成分為二苯乙烯苷（TSG）和大黃素（Emodin）［8］，前者可通過抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷［9］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TSG 可以介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶/c-Jun 氨基末端激酶（MAPK/JNK）信號(hào)通路，抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡［10］。然而，在DE 中TSG 和Emodin 是否通過HAT 和HDAC 調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡尚不清楚。本研究旨在觀察TSG 和Emodin 能否通過調(diào)節(jié)HAT和HDAC活性改善高糖誘導(dǎo)下的HT-22細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器 小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT-22 購(gòu)于上海中喬新舟生物科技有限公司。DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)于以色列BI公司；TSG（成分：2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯2-O-β-D-葡萄糖苷；相對(duì)分子質(zhì)量：406.38；規(guī)格：5 mg）和Emodin（成分：6-甲基-1,3,8-三羥基蒽醌；相對(duì)分子質(zhì)量：270.24；規(guī)格：50 mg）均購(gòu)于Merck 公司。CCK-8 試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）；RIPA 高效裂解液、二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）細(xì)胞凋亡測(cè)試試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；HAT和HDAC酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)試試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）多克隆抗體、兔源B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）多克隆抗體、兔源Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）多克隆抗體、兔源胱天蛋白酶3（Caspase-3）多克隆抗體、羊抗兔二抗均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。蛋白免疫印跡（Western blot）電泳儀、IMARK型酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù) 將HT-22 細(xì)胞注入含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)HT-22細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將HT-22細(xì)胞分為4組：對(duì)照培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol/L）組（NC組）、高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度55 mmol/L）組（HG 組）、HG+TSG組和HG+Emodin組。

1.2.2 細(xì)胞活力測(cè)定 用CCK-8檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，均勻鋪于96 孔板中，37 ℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。用高糖培養(yǎng)基將TSG 和Emodin 稀釋至50、100、200 μmol/L，并在37 ℃、5%CO2的環(huán)境下作用12、16、20、24、48 h。在相應(yīng)的作用時(shí)間結(jié)束后，棄去原培養(yǎng)基，加入細(xì)胞活性檢測(cè)試劑（10 μL CCK-8 檢測(cè)試劑，90μL 培養(yǎng)基），避光置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育2.5 h。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)光密度（OD）值。細(xì)胞存活率=（TSG/Emodin 組OD 均值-空白組OD 均值）/（NC/HG 組OD 均值-空白組OD 均值）×100%。選擇最適條件（細(xì)胞存活率為70%左右）后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)藥物作用24 h后，用PBS清洗3 次，加入0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，用培養(yǎng)基終止消化后，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。加入500μL結(jié)合緩沖液（Binding Buffer）將細(xì)胞重懸，并依次加入Annexin VFITC 和Propidium Iodide 各5 μL，室溫避光作用10 min 后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每組重復(fù)3次。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)HDAC 和HAT 活性 在96 孔板中加入每組細(xì)胞裂解液各50μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。每孔加入100μL辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔抗體，孵育、洗滌后加入100μL顯色劑，避光15 min，加入終止液50μL。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)OD值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達(dá) 對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析。用細(xì)胞裂解液RIPA裂解細(xì)胞。蛋白濃度測(cè)定采用BCA 試劑盒。每孔蛋白量為30 μg，通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室溫條件下5%脫脂牛奶封閉2 h。TBST洗滌3次，每次10 min。分別加入相應(yīng)的一抗β-actin 抗體（1∶5 000）、Bax 抗體（1∶1 000）、Bcl-2抗體（1∶1 000）、Caspase-3抗體（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。孵育后，用TBST 洗滌3 次，每次10 min。用羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h。最后通過增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。每組重復(fù)3 次。結(jié)果用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSG和Emodin的最適作用時(shí)間和濃度 CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TSG 和Emodin 在50 μmol/L 作用HT-22 細(xì) 胞12 h 的 條 件 下，HG+TSG 組 和HG+Emodin 組細(xì)胞存活率在85%左右；作用48 h 時(shí)，HG+TSG 組 和HG+Emodin 組 細(xì) 胞 存 活 率＞75%。100μmol/L 的TSG 和Emodin 作用細(xì)胞48 h 時(shí)，HG+TSG 組和HG+Emodin 組細(xì)胞存活率分別為76%和70%。200μmol/L 的TSG 作用細(xì)胞48 h時(shí)，HG+TSG組細(xì)胞存活率在70%左右。因此選擇TSG 以200μmol/L，Emodin 以100 μmol/L 作用HT-22 細(xì)胞48 h為最適條件，見圖1。

Fig.1 The effects of different action concentrations and time points of TSG and Emodin on HT-22 cell viability圖1 TSG和Emodin不同作用濃度和時(shí)間對(duì)HT-22細(xì)胞活性的影響

2.2 TSG 和Emodin 改善高糖環(huán)境下神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組細(xì)胞凋亡率顯著升高，TSG 和Emodin 可顯著降低高糖條件下的細(xì)胞凋亡率（P＜0.01），見圖2。

Fig.2 Apoptosis rates of HT-22 cells in different groups圖2 不同組間HT-22細(xì)胞凋亡率

2.3 TSG 和Emodin 調(diào)控高糖誘導(dǎo)HAT 和HDAC 的表達(dá) ELISA結(jié)果顯示，與NC組相比，HG組的HAT和HDAC 活性上調(diào)（P＜0.05），經(jīng)過TSG 干預(yù)后，HAT 活性顯著下調(diào)，HDAC 活性上調(diào)；經(jīng)過Emodin干預(yù)后，HAT 和HDAC 活性均顯著下調(diào)（P＜0.05），見表1。

2.4 TSG 和Emodin 調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，與NC 組相比，HG 組Bax、Caspase-3 的表達(dá)升高，Bcl-2 的表達(dá)降低，而HG+TSG組和HG+Emodin組可有效逆轉(zhuǎn)高糖誘導(dǎo)的Bax、Caspase-3升高及Bcl-2的降低（P＜0.01），HG+Emodin組Bax、Caspase-3及Bcl-2的表達(dá)與NC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表2。

Tab.1 Comparison of HAT and HDAC activities in HT-22 cells between the different groups表1 各組間HT-22細(xì)胞HAT和HDAC活性比較（n=4，OD450，±s）

Tab.1 Comparison of HAT and HDAC activities in HT-22 cells between the different groups表1 各組間HT-22細(xì)胞HAT和HDAC活性比較（n=4，OD450，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與HG組比較，P＜0.05。

組別NC組HG組HG+TSG組HG+Emodin組F HAT 0.64±0.02 0.79±0.02a 0.68±0.03ab 0.46±0.02ab 158.140**HDAC 0.61±0.03 1.12±0.06a 1.18±0.02ab 0.74±0.04ab 227.551**

Fig.3 Expression levels of Bax,Bcl-2 and Caspase-3 protein detected by Western blot assay in the four groups圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞Bax、Bcl-2和Caspase-3的蛋白表達(dá)

Tab.2 Comparison of expression levels of apoptosisrelated proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

Tab.2 Comparison of expression levels of apoptosisrelated proteins between the four groups表2 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（n=3，±s）

**P＜0.01；a與NC組比較，b與HG組比較，P＜0.05。

組別NC組HG組HG+TSG組HG+Emodin組F Bax 0.57±0.04 0.93±0.06a 0.71±0.04ab 0.64±0.03b 43.482**Bcl-2 0.61±0.03 0.41±0.02a 0.53±0.04ab 0.60±0.01b 35.912**Caspase-3 0.63±0.00 0.88±0.05a 0.65±0.03b 0.65±0.05b 33.111**

3 討論

目前，DE 的發(fā)病機(jī)制不明，且尚未找到有效的治療靶點(diǎn)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)何首烏對(duì)DE 認(rèn)知功能障礙具有預(yù)防和治療作用［11］。本研究采用何首烏有效成分TSG和Emodin進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)兩者可以調(diào)節(jié)HAT 及HDAC 的表達(dá)，改善高糖誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

3.1 TSG 和Emodin 作用神經(jīng)元細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間 盡管有文獻(xiàn)報(bào)道了TSG作用于大腸癌細(xì)胞的最適藥物濃度［12］，但對(duì)于不同的細(xì)胞，最佳的藥物作用濃度和時(shí)間不盡相同。陳素領(lǐng)等［13］采用1、10、20、50、100μmol/L 的Emodin 處理HT-22 細(xì)胞，但未對(duì)時(shí)間進(jìn)行確定。本研究通過CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活性，篩選出TSG 和Emodin 作用HT-22 細(xì)胞的最佳濃度和時(shí)間，推薦作用濃度和時(shí)間分別為TSG 200μmol/L 48 h和Emodin 100μmol/L 48 h。

3.2 TSG 和Emodin 改善高糖誘導(dǎo)下神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 海馬神經(jīng)元凋亡導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙是DE 的重要發(fā)病機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元受線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路和死亡受體通路的調(diào)控，最終影響認(rèn)知功能障礙［14-15］。TSG和Emodin在改善神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)退行性疾病中起到重要的作用。Lee 等［16］以HT-22 細(xì)胞為研究對(duì)象，以何首烏主要活性成分TSG 作用于氧化應(yīng)激后的細(xì)胞，結(jié)果顯示TSG可以通過減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。近期研究表明，Emodin可以通過抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性和Caspase-3、-8、-9 的激活來抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而改善阿爾茨海默病小鼠的空間記憶和學(xué)習(xí)能力［17］。但是TSG 和Emodin 能否有效改善高糖所致的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡卻少見報(bào)道。本研究顯示，在高糖環(huán)境下HT-22 細(xì)胞凋亡率升高，經(jīng)TSG 和Emodin 干預(yù)后，HT-22 細(xì)胞凋亡率下降；在蛋白水平上，Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)得到恢復(fù)。這些結(jié)果表明TSG和Emodin可以改善高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

3.3 TSG 和Emodin 通過調(diào)節(jié)HAT 和HDAC 活性改善高糖誘導(dǎo)下神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡與組蛋白乙?；芮邢嚓P(guān)，而組蛋白乙?；揎検艿紿AT 和HDAC 的調(diào)控［18］。Wu 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡受HAT 和HDAC 的動(dòng)態(tài)調(diào)控。一般控制核苷酸合成5（GCN5）是組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶，當(dāng)GCN5失活時(shí)，導(dǎo)致Bcl-2相互作用細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子（Bim）轉(zhuǎn)錄上調(diào)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而抑制HDAC 后可以顯著挽救GCN5 失活誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高糖作用下的HT-22神經(jīng)元細(xì)胞HAT 和HDAC 表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡增加，且抑制HDAC 后加劇了HT-22 細(xì)胞凋亡［4］。因此，在DE 的發(fā)生發(fā)展中，神經(jīng)元細(xì)胞組蛋白乙?；{(diào)控異常是導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖條件下，TSG 和Emodin 可以調(diào)控HAT 和HDAC，且兩者均能下調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率和改善神經(jīng)元細(xì)胞中凋亡蛋白的表達(dá)，這些結(jié)果表明TSG 和Emodin 可能通過調(diào)節(jié)組蛋白乙?；?，從而減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。本研究或許可為將來DE的新藥開發(fā)提供一定的理論支撐。然而，本研究未從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明TSG和Emodin在DE大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的調(diào)控關(guān)系，這是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

綜上所述，在高糖環(huán)境下，海馬神經(jīng)元細(xì)胞組蛋白乙?；甘д{(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，而TSG 和Emodin可以改善這一過程，因此TSG和Emodin可能在調(diào)控DE 中的組蛋白乙?；甘д{(diào)及減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡方面具有較好的應(yīng)用前景，為進(jìn)一步開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。