陳靈芝，鐘開義，陳立國(guó)

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一，我國(guó)2 型糖尿病患者中有20%～40%合并糖尿病腎病［1］。糖尿病腎病早期癥狀隱匿，臨床診斷主要依靠尿微量白蛋白和腎小球?yàn)V過率估算值（estimated glomerular filtration rate，eGFR），但是僅根據(jù)這兩項(xiàng)診斷并不準(zhǔn)確，并非所有發(fā)生腎功能衰竭的糖尿病患者都有大量蛋白尿和eGFR下降現(xiàn)象［2］?；騿?dòng)子甲基化是一種表觀遺傳機(jī)制。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，某些基因啟動(dòng)子甲基化與糖尿病腎病發(fā)病存在一定關(guān)系，如基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因啟動(dòng)子甲基化與血尿素氮、血肌酐增高有關(guān)，參與糖尿病腎病發(fā)病 過 程［3］。 亞 甲 基 四 氫 葉 酸 還 原 酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）代謝的關(guān)鍵酶，也是基因啟動(dòng)子甲基化的關(guān)鍵催化酶，MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化會(huì)影響MTHFR 的活性，導(dǎo)致Hcy 代謝異常，血清Hcy水平升高［4］；而高Hcy血癥可增加慢性腎臟病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，是2 型糖尿病患者發(fā)生腎功能不全的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［5］。因此，MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化可能與糖尿病腎病有關(guān)。本研究擬檢測(cè)糖尿病腎病患者M(jìn)THFR基因啟動(dòng)子甲基化情況，分析其與糖尿病腎病發(fā)病和病情進(jìn)展的關(guān)系，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019 年6 月—2021 年3 月海南西部中心醫(yī)院收治的糖尿病腎病患者（腎病組）81例，包括男53例，女28 例，年齡55～75 歲，平均（65.12±6.23）歲。根據(jù)慢性腎臟病分期標(biāo)準(zhǔn)將患者分為1～2期組（26例），3a～3b期組（39例），4～5 期組（16 例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：均為2 型糖尿病，符合2017版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》中糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡＞18 周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性腎小球腎炎、原發(fā)性腎病綜合征及先天性多囊腎；狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、高血壓腎病等其他繼發(fā)性腎病；腎細(xì)胞癌、腎盂癌、胚胎瘤；近6個(gè)月曾行腎臟手術(shù)者。另選擇同期收治的139例單純2型糖尿病患者（單純糖尿病組）和51例于我院門診體檢中心體檢的志愿者（對(duì)照組），其中單純糖尿病組患者符合2017 版《中國(guó)2 型糖尿病防治指南》中2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，單純糖尿病組和對(duì)照組均經(jīng)實(shí)驗(yàn)室和影像檢查排除腎臟疾病。單純糖尿病組男94例，女45例，年齡52～77歲，平均（65.79±7.91）歲；對(duì)照組男35例，女16例，年齡53～78歲，平均（65.65±6.19）歲。3組年齡（F=0.164）、性別構(gòu)成（χ2=0.173）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（201812052），患者均簽署知情同意書。

1.2 甲基化特異性實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qMSP）檢測(cè)MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平 所有患者入組后24 h 內(nèi)（對(duì)照組體檢當(dāng)日）采集肘正中靜脈血3 mL，取血清（血標(biāo)本凝固后上層液）3 000 r/min離心5 min，參照文獻(xiàn)［6］采用qMSP法檢測(cè)血清MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化表達(dá)。Wizard?SV Genomic DNA Purification Kit 組織DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega生物公司，EZ DNA Methylation-Gold Kit購(gòu)自美國(guó)Zymo公司，Qsep100 全自動(dòng)核酸蛋白分析儀購(gòu)自中國(guó)臺(tái)灣光鼎科技股份公司。采用甲基化參考百分比（percentage of methylated reference，PMR）量化甲基化水平，PMR=2-（Ct樣本-Ct內(nèi)參）×100%。引物由上海捷瑞公司設(shè)計(jì)合成，引物序列：MTHFR上游5'-TAGATTTAGGTACGTGAAGTAGGGTAGAC-3'，下 游5'-GAAAAACTAATAAAAAACCGACGAA-3'；U6（內(nèi) 參）上 游5'-TTTAGGTATGTGAAGTAGGGTAGATGT-3'，下 游 5'-CAAAAAACTAATAAAAAAAACCAACAAA-3'。

1.3 臨床資料收集 收集受試者年齡、性別、體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓、吸煙史（接受治療前10年內(nèi)規(guī)律吸煙史，且吸煙數(shù)量累計(jì)≥100支），有無(wú)基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、高脂血癥），合并癥（冠心病、腦梗死、視網(wǎng)膜病變），糖尿病病程，家族史，以及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、Hcy、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，SCr）、eGFR、尿微量白蛋白、空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG）、空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）、糖化血紅蛋白（hemoglobin A1c，HbA1c）；其中，F(xiàn)PG、TG、TC、Hcy、BUN、SCr檢測(cè)采用東芝40 型全自動(dòng)生化分析儀，F(xiàn)INS 檢測(cè)采用日立h7060全自動(dòng)化學(xué)免疫分析儀，HbA1c檢測(cè)采用HA8160糖化血紅蛋白分析儀，尿微量白蛋白檢測(cè)采用GC-1 200 γ放射免疫計(jì)數(shù)器。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例或例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。影響因素分析采用Logistic回歸分析。受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）分析MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平診斷糖尿病腎病的價(jià)值，三者聯(lián)合采用并聯(lián)方式即滿足各指標(biāo)單獨(dú)截?cái)嚅撝蹬袛酁樘悄虿∧I病。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 與對(duì)照組比較，單純糖尿病組、腎病組的吸煙比例、收縮壓、舒張壓升高（P＜0.05）；與單純糖尿病組比較，腎病組高血壓和高脂血癥比例增加、收縮壓升高，糖尿病病程較長(zhǎng)（P＜0.05），2 組吸煙比例和舒張壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

Tab.1 Comparison of general data between the three groups表1 各組一般資料的比較

2.2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，單純糖尿病組和腎病組TC、TG、FPG、FINS、HbA1c、Hcy、BUN、SCr 及尿微量白蛋白水平升高，eGFR、MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平降低（P＜0.05）。與單純糖尿病組比較，腎病組TG、HbA1c、Hcy、BUN、SCr、尿微量白蛋白水平升高，eGFR、MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平降低（P＜0.05），2組TC、FPG、FINS 比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

Tabl.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 3組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

Tabl.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 3組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 （±s）

**P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與單純糖尿病組比較，P＜0.05。

組別對(duì)照組單純糖尿病組腎病組F n 51 139 81 TC（mmol/L）3.81±0.74 5.28±1.53a 5.31±1.15a 30.325**TG（mmol/L）1.37±0.11 1.70±0.21a 1.85±0.25ab 98.165**FPG（mmol/L）4.35±0.52 7.33±1.05a 8.68±1.25a 32.167**FINS（U/mL）3.69±0.37 8.97±1.93a 9.12±2.33a 43.719**組別對(duì)照組單純糖尿病組腎病組F HbA1c（%）4.21±0.62 6.05±1.33a 8.90±1.72ab 105.352**Hcy（μmol/L）7.71±1.21 13.10±2.92a 18.24±4.17ab 76.287**BUN（mmol/L）6.35±1.09 13.52±2.49a 36.25±6.43ab 153.241**SCr（μmo/L）25.02±5.41 28.35±6.02a 82.43±12.52ab 161.42**組別對(duì)照組單純糖尿病組腎病組F尿微量白蛋白（mg/L）105.62±12.21 140.35±28.49a 351.35±39.41ab 206.352**eGFR［mL/（min·1.73 m2）］129.42±17.09 113.32±13.41a 80.42±6.43ab 173.460**MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化（%）17.65±3.26 12.54±2.43a 8.12±1.35ab 258.574**

2.3 不同慢性腎臟病分期患者M(jìn)THFR基因啟動(dòng)子甲基化差異 1～2 期組、3a～3b 期組、4～5 期組血清MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平分別為（8.72±0.65）%、（8.16±0.54）%、（7.05±0.21）%，呈依次降低趨勢(shì)（F=48.504，P＜0.05）。

2.4 2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的影響因素分析 以2型糖尿病患者是否發(fā)生糖尿病腎病為因變量（否=0，是=1），以高血壓（否=0，是=1）、高脂血癥（否=0，是=1）、糖尿病病程、收縮壓、TG、HbA1c、Hcy、BUN、SCr、尿微量白蛋白、eGFR、MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平為自變量。單因素Logistic 回歸分析顯示，高血壓和HbA1c、BUN、SCr、尿微量白蛋白、eGFR、MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化是2 型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的影響因素（P＜0.05），見表3。將單因素Logistic 回歸分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示，高血壓和尿微量白蛋白升高是2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），eGFR和MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平升高是2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的保護(hù)因素（P＜0.05），見表4。

Tab.3 Univariate Logistic regression results of diabetic nephropathy in type 2 diabetic patients表3 2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的單因素Logistic回歸結(jié)果

2.5 ROC曲線分析 相較于單獨(dú)MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR，三指標(biāo)并聯(lián)檢查的診斷效能較高，敏感度和特異度較好，見圖1、表5。

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致患者死亡和殘疾的主要原因，盡管血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體阻斷劑等藥物可有效減少蛋白尿和減緩糖尿病腎病進(jìn)程，但是糖尿病腎病發(fā)病率仍在不斷增高［7］。高齡、病程較長(zhǎng)、高血壓、肥胖、高血脂、高尿酸、血糖水平控制不佳等是糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素［8］。糖尿病相關(guān)慢性腎臟病位居我國(guó)慢性腎臟病住院人數(shù)的首位，已成為引起終末期腎病的主要原因之一［9］。目前，糖尿病腎病的診斷以尿白蛋白排泄率增加、伴或不伴eGFR 下降、動(dòng)脈壓升高為標(biāo)準(zhǔn)［10］；但是感染、發(fā)熱、心力衰竭、高血壓、高血糖等因素可獨(dú)立于腎臟損害，亦可導(dǎo)致尿白蛋白水平增高［11］。因此，積極探尋與糖尿病腎病相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物十分重要。

Tab.4 Multivariate Logistic regression results of diabeticnephropathy in type 2 diabetic patients表4 2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的多因素Logistic回歸結(jié)果

Fig.1 ROC diagram of MTHFR gene methylation combined with urinary microalbumin and eGFR in the diagnosis of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes圖1 MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR及聯(lián)合檢測(cè)診斷2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的ROC曲線

基因啟動(dòng)子甲基化指對(duì)DNA的直接化學(xué)修飾，其過程由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族催化，該酶將甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉(zhuǎn)移至胞嘧啶殘基的第5 個(gè)碳，形成5-甲基胞嘧啶。DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶可為未修飾的DNA 建立新的甲基化模式，在DNA 復(fù)制、胚胎的發(fā)育、細(xì)胞有絲分裂等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［11］。DNA甲基化還可募集基因調(diào)控相關(guān)蛋白，促使轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在基因轉(zhuǎn)錄、DNA 損傷修復(fù)、遺傳印跡、惡性腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮不可替代的作用［12］。基因啟動(dòng)子甲基化與糖尿病腎病也存在密切關(guān)系，糖尿病腎病患者基因組整體甲基化水平較單純糖尿病患者明顯升高，基因啟動(dòng)子甲基化可能通過引起炎性損傷、氧化應(yīng)激、腎臟纖維化、腎細(xì)胞凋亡等參與糖尿病腎病發(fā)病過程［13］。

Tab.5 Efficacy of MTHFR gene methylation combined with urinary microalbumin and eGFR in the diagnosis of diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes表5 MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)2型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病的診斷效能

MTHFR是一碳代謝過程中葉酸代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR將5,10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，參與DNA 甲基化相關(guān)的葉酸和Hcy 的轉(zhuǎn)化過程，MTHFR酶活性降低會(huì)導(dǎo)致甲基化受損以及葉酸缺乏［14］。MTHFR 在Hcy 轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸過程中必不可少，MTHFR基因編碼Hcy代謝所需的亞甲基四氫葉酸還原酶，MTHFR基因多態(tài)性可導(dǎo)致Hcy水平增加［15］。研究顯示，MTHFR啟動(dòng)子中DNA 甲基化水平與遲發(fā)性阿爾茨海默?。?6］、精神分裂癥、重度抑郁癥、自閉癥和雙相情感障礙［17］、食管癌對(duì)5-氟尿嘧啶化療的敏感性［18］等均有關(guān)。Yang 等［19］研究顯示，健康受試者、單純糖尿病者、早期糖尿病腎病者、晚期糖尿病腎病者M(jìn)THFR基因啟動(dòng)子甲基化水平逐漸降低，非甲基化水平逐漸升高。本研究結(jié)果亦顯示，腎病組MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平低于單純糖尿病組和對(duì)照組，且隨著慢性腎臟病分期增加而降低，MTHFR基因化水平降低是糖尿病腎病發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一，表明糖尿病腎病患者M(jìn)THFR基因呈去甲基化狀態(tài)，MTHFR基因去甲基化與糖尿病腎病發(fā)病有關(guān)。分析MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化參與糖尿病腎病的機(jī)制可能為：MTHFR基因啟動(dòng)子去甲基化改變MTHFR 活性，阻斷5,10-亞甲基四氫葉酸向5-亞甲基四氫葉酸的轉(zhuǎn)移，影響蛋氨酸循環(huán)，誘導(dǎo)Hcy 聚集，Hcy 聚集進(jìn)一步影響蛋氨酸循環(huán)，繼而控制甲基化轉(zhuǎn)移抑制甲基化，形成惡性循環(huán)［19］。Hcy水平升高與尿白蛋白排泄增加有關(guān)，是2型糖尿病患者早期腎損傷的標(biāo)志物［20］。因此，MTHFR基因啟動(dòng)子去甲基化可能通過升高Hcy水平而參與糖尿病腎病發(fā)病過程。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平診斷糖尿病腎病的AUC 與尿微量白蛋白接近，略低于eGFR，表明MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化在糖尿病腎病診斷中具有一定價(jià)值，可能為2 型糖尿病患者早期腎損傷診斷提供參考。聯(lián)合三項(xiàng)指標(biāo)后AUC明顯擴(kuò)大，提示臨床可將MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR 聯(lián)合用于糖尿病腎病診斷，以提高早期診斷率。回歸分析顯示，除尿微量白蛋白升高和MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化、eGFR降低外，高血壓也是糖尿病腎病的危險(xiǎn)因素，提示高血壓合并MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化、尿微量白蛋白、eGFR 異?；颊甙l(fā)生糖尿病腎病風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)做好防范和早期干預(yù)。

綜上所述，糖尿病患者M(jìn)THFR基因啟動(dòng)子甲基化水平降低，MTHFR基因低甲基化可能與2 型糖尿病患者發(fā)生糖尿病腎病以及疾病程度加重有關(guān)。檢測(cè)MTHFR基因啟動(dòng)子甲基化水平有助于糖尿病腎病的診斷。