陳玉，蘇建軍，韓允，李穎，張倫敏，楊義，黃波

缺血性心臟病已成為嚴(yán)重威脅人類生命和健康的疾病。隨著血液灌注重建，心臟的功能和結(jié)構(gòu)并沒有恢復(fù)，而是發(fā)生了更嚴(yán)重的損傷，稱為心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［1-2］。急性缺血性心臟病最有效的治療方法是盡快恢復(fù)缺血組織的血流。因此，避免I/R損傷的發(fā)生是治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。鐵死亡在心肌I/R 損傷中起重要作用［3］。谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）是一種重要的抗氧化酶，通過感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)氧化應(yīng)激來調(diào)節(jié)鐵死亡，在心肌I/R 損傷中，抑制鐵死亡、恢復(fù)GPX4 水平可保護(hù)心肌免受I/R 損傷［4］。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一種重要的內(nèi)源性抗氧化劑，參與心肌I/R 損傷，其被激活可以減少心肌梗死面積并促進(jìn)心肌I/R損傷后心臟功能的恢復(fù)［5-8］。因此，Nrf2-GPX4介導(dǎo)的鐵死亡可能是防治心肌I/R損傷的重要通路。富馬酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF）可作為Nrf2 通路的調(diào)節(jié)劑在多種疾病中發(fā)揮抗氧化和抗炎作用［9］。有研究顯示，DMF 可能以Nrf2依賴性方式減輕心肌I/R損傷［10-11］。然而，DMF對(duì)心肌I/R 損傷的保護(hù)作用是否與鐵死亡有關(guān)尚不清楚。本研究使用DMF、Nrf2 抑制劑（ML385）和鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 來探究DMF 對(duì)心肌I/R 損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10～12 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量280～300 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0009。飼養(yǎng)在12 h光/暗循環(huán)的溫度控制環(huán)境中。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水。

1.2 主要試劑與儀器 DMF（純度97%，貨號(hào)：D106459）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ML385（純度99.55%，貨號(hào)：HY-100523）、Ferrostatin-1（純度99.59%，貨號(hào)：HY-100579）購自美國(guó)MedChemExpress 公司；肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）、乳酸脫氫酶（LDH）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（產(chǎn)品貨號(hào)分別為ml059111、ml059533、ml059178）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（WST-1法）、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒（TBA 法）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒（微板法）均購自南京建成生物工程研究所（產(chǎn)品貨號(hào)分別為A001-3-2、A003-1-2、A006-2-1）；組織活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（DHE，紅色熒光，HR8821）購自北京百奧萊博科技有限公司；亞鐵離子（Fe2+）檢測(cè)試劑盒（比色法，貨號(hào)：E-BCK304-S）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；兔源一抗GPX4（ab125066）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1，ab84036）、Nrf2（ab137550）、鐵蛋白重鏈1（FTH1，ab183781）、Lamin B1（ab133741）、GAPDH（ab181602）及二抗山羊抗兔IgG H+L（HRP，ab205718）購自英國(guó)Abcam 公司；原位缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒購于Roche公司；DAPI顯色試劑盒購于創(chuàng)為世紀(jì)公司；總蛋白試劑盒及核蛋白提取試劑盒購于中國(guó)江蘇Beyotime公司。

動(dòng)物心電圖系統(tǒng)（美國(guó)Nasiff Associates 公司）；iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置（美國(guó)Bio-Rad 公司）；BX61 電動(dòng)顯微鏡（日本Olympus 公司）；STELLARIS DIVE 激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

1.3 分組、模型制備及給藥 按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、I/R 組、Ferrostatin-1 組（Fer-1 組）、DMF 低劑量組（DMF-L 組）、DMF 高劑量組（DMF-H 組）、DMF+ML385組，每組12只。除Sham組外，其余大鼠通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支（LAD）誘導(dǎo)建立心肌I/R 大鼠模型：大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，仰臥位固定，置于溫控加熱墊上，連接心電圖機(jī)后，打開胸腔暴露LAD，6-0 縫合線穿過LAD，在LAD 周圍打活結(jié)，結(jié)扎LAD 造成缺血；缺血30 min后，松開結(jié)扣以恢復(fù)血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。Sham組大鼠未結(jié)扎LAD，其余操作同上。結(jié)扎成功標(biāo)準(zhǔn)：缺血時(shí)心電圖ST段持續(xù)升高，左心室前壁呈紫色或灰色，再灌注時(shí)心電圖ST段下降50%以上。Fer-1組大鼠腹腔注射Ferrostatin-1（2 mg/kg），連續(xù)7 d，然后構(gòu)建心肌I/R模型；DMF-L組和DMF-H組分別給予25、50 mg/kg的DMF灌胃，連續(xù)7 d，然后構(gòu)建心肌I/R模型；DMF+ML385 組大鼠在給予50 mg/kg DMF 灌胃的同時(shí)腹腔注射ML385（30 mg/kg），連續(xù)7 d，然后構(gòu)建心肌I/R 模型；Sham組和I/R組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃和腹腔注射，然后I/R組構(gòu)建心肌I/R模型；Sham組進(jìn)行假手術(shù)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 血清心肌酶檢測(cè) 再灌注12 h 后，麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，靜置后以2 000×g離心10 min，取血清。ELISA 檢測(cè)大鼠血清LDH、cTnI、CK-MB水平。

1.4.2 蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察心肌組織病理學(xué)變化 取血后，每組采用信封法隨機(jī)抽取6 只大鼠，處死后迅速取出心臟，分為兩部分，一部分制備10%的組織勻漿，另一部分心肌組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。切片用二甲苯和乙醇濃度梯度脫蠟、水化后，浸入蘇木精3～4 min，并用伊紅染色1～2 min。之后，切片分別在80%、90%和100%乙醇中脫水3～5 min，然后用中性樹膠密封。從每個(gè)染色切片中隨機(jī)讀取5個(gè)視野，顯微鏡觀察病理變化。

1.4.3 TUNEL 染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 取石蠟包埋的心肌組織，切成5 μm 厚的切片，隨后進(jìn)行脫蠟和水化，采用TUNEL法標(biāo)記凋亡的心肌細(xì)胞。TUNEL反應(yīng)混合液包含50μL酶溶液和450 μL 熒光素標(biāo)記的dUTP 液。切片與50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液在37 ℃下孵育1 h。磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌3次，并用DAPI染色。PBS洗滌3次后，用熒光顯微鏡觀察并拍攝心肌組織。TUNEL 染色可見凋亡細(xì)胞呈綠色熒光，核呈藍(lán)色熒光。從每個(gè)切片中隨機(jī)讀取5個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞凋亡率為凋亡細(xì)胞數(shù)（綠色）/總細(xì)胞數(shù)（藍(lán)色）×100%。

1.4.4 DHE 熒光染色法檢測(cè)心肌組織ROS 水平 取部分新鮮心肌組織（剩余6個(gè)組織標(biāo)本）制成冰凍切片。然后將切片在37 ℃下與10 μmol/L DHE 避光孵育30 min，PBS 洗滌，封片，然后通過激光共聚焦顯微鏡（激發(fā)波長(zhǎng)535 nm，發(fā)射波長(zhǎng)610 nm）觀察DHE染色的熒光強(qiáng)度，并用Image J軟件分析平均熒光強(qiáng)度，熒光越強(qiáng)，表明組織ROS含量越高。

1.4.5 心肌組織MDA、GSH 含量和SOD 活性檢測(cè) 取部分心肌組織，按照1∶9的比例加入生理鹽水研磨后，以16 000×g離心10 min，取上清液為組織勻漿液，生化法檢測(cè)勻漿中MDA、GSH含量和SOD活性。

1.4.6 心肌組織Fe2+含量的測(cè)定 取心肌組織勻漿上清液，BCA 法測(cè)定勻漿上清液中的總蛋白濃度，然后按照Fe2+含量檢測(cè)試劑盒說明書加入相應(yīng)試劑，于593 nm 處測(cè)得吸光度（A）值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算Fe2+濃度。

1.4.7 Western blot 檢測(cè)心肌組織鐵死亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 稱取適量心肌組織，提取總蛋白和核蛋白，在含有蛋白酶抑制劑（PMSF）的RIPA 裂解液中勻漿，12 000×g離心10 min 取上清液，使用CelLyticTMNuCLEARTM提取試劑盒或總蛋白提取試劑盒提取總蛋白或核蛋白（用于檢測(cè)Nrf2的表達(dá)）。使用BCA 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，將等量的蛋白質(zhì)樣品加到8%～12%SDS-PAGE 凝膠上，并在冰上電泳90 min。然后將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉，然后將膜與一抗（Nrf2、GPX4、FTH1、TfR1，1∶1 000；Lamin B1、GAPDH，1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜。然后用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000）在室溫下孵育1 h。ECL試劑顯色，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶的灰度值，并以Lamin B1、GAPDH 為內(nèi)參蛋白，分析膜上目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清CK-MB、cTnI 以及LDH 水平比較 與Sham 組相比，I/R 組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH 水平增高（P＜0.05）；與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L組和DMF-H組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH水平降低（P＜0.05）；與Fer-1 組相比，DMF-H 組大鼠血清上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DMF-L 組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH 水平增高（P＜0.05）；與DMF-H 組相比，DMF+ML385 組大鼠血清上述指標(biāo)水平增高（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of serum levels of CK-MB,cTnI and LDH between the six groups of rats表1 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH水平比較（n=12，±s）

Tab.1 Comparison of serum levels of CK-MB,cTnI and LDH between the six groups of rats表1 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH水平比較（n=12，±s）

**P＜0.01；a與Sham組相比，b與I/R組相比，c與Fer-1組相比，d與DMF-H組相比，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Fer-1組DMF-L組DMF-H組DMF+ML385組F CK-MB（U/L）42.37±7.89 135.64±13.25a 78.29±10.56ab 107.40±12.15abc 82.32±9.46ab 101.57±11.81abcd 98.684**cTnI（μg/L）4.06±0.65 18.25±1.23a 7.67±0.81ab 13.99±1.04abc 8.01±0.93ab 13.42±1.17abcd 330.305**LDH（U/L）123.54±16.80 485.61±29.37a 217.42±25.28ab 409.33±31.04abc 226.05±24.83ab 371.46±30.55abcd 487.673**

2.2 各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化比較 Sham 組心肌結(jié)構(gòu)完整，纖維組織排列整齊。I/R組心肌結(jié)構(gòu)受損、心肌纖維紊亂、局部肌纖維橫紋消失、心肌細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L組和DMF-H組心肌組織上述病理學(xué)變化明顯減輕，可見輕度細(xì)胞水腫，少量心肌纖維斷裂，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且DMF-H 組和Fer-1 組心肌損傷改善程度接近；DMF-L組大鼠心肌組織損傷較Fer-1 組明顯加重；DMF+ML385 組大鼠心肌組織損傷較DMF-H組有加重趨勢(shì)，見圖1。

Fig.1 HE staining of rat myocardial tissue(×200)圖1 大鼠心肌組織HE染色（×200）

2.3 各組大鼠心肌組織心肌細(xì)胞凋亡情況比較 與Sham 組相比，I/R 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L 組和DMF-H組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與Fer-1 組相比，DMF-H組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DMF-L 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）；與DMF-H 組相比，DMF+ML385 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05），見表2、圖2。

Tab.2 Comparison of the apoptotic rate and ROS level ofrat cardiomyocytes between the six groups of rats表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和ROS水平比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of the apoptotic rate and ROS level ofrat cardiomyocytes between the six groups of rats表2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和ROS水平比較（n=6，±s）

**P＜0.01；a與Sham組相比，b與I/R組相比，c與Fer-1組相比，d與DMF-H組相比，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Fer-1組DMF-L組DMF-H組DMF+ML385組F細(xì)胞凋亡率（%）4.25±0.56 35.19±2.48a 17.36±2.11ab 28.53±2.62abc 18.05±1.97ab 27.44±2.56abcd 152.644**ROS（平均熒光強(qiáng)度）8.41±1.23 37.28±2.49a 16.20±1.56ab 28.75±2.08abc 17.46±1.92ab 28.03±2.24abcd 171.325**

Fig.2 TUNEL staining of rat myocardial tissue(×400)圖2 大鼠心肌組織TUNEL染色（×400）

2.4 各組大鼠心肌組織ROS 水平 用DHE 作為ROS 的熒光標(biāo)記物對(duì)心肌組織進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，在I/R 組中觀察到較多DHE 陽性細(xì)胞，與Sham組相比，I/R 組大鼠心肌組織中ROS 水平增高（P＜0.05）；與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L 組和DMF-H組大鼠心肌組織中ROS水平降低（P＜0.05）；與Fer-1 組相比，DMF-H 組大鼠心肌組織中ROS 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），DMF-L 組大鼠心肌組織中ROS 水平增高（P＜0.05）；與DMF-H 組相比，DMF+ML385 組大鼠心肌組織中ROS 水平增高（P＜0.05），見表2、圖3。

2.5 各組大鼠心肌組織MDA、GSH含量和SOD活性比較 與Sham 組相比，I/R 組大鼠心肌組織中MDA含量顯著升高，GSH 含量和SOD 活性降低（P＜0.05）；與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L 組和DMF-H組MDA 含量降低，GSH 含量和SOD 活性增高（P＜0.05）；與Fer-1 組相比，DMF-L 組大鼠MDA 含量升高，GSH含量和SOD活性降低（P＜0.05），DMF-H組大鼠心肌組織上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DMF-H 組相比，DMF+ML385 組大鼠心肌組織中MDA 含量增高，GSH 含量和SOD 活性降低（P＜0.05），見表3。

Fig.3 DHE fluorescence staining of rat myocardial tissue（×200）圖3 大鼠心肌組織DHE熒光染色（×200）

Tab.3 Comparison of MDA,GSH content and SOD activity in myocardial tissues between the six groups of rats表3 各組大鼠心肌組織MDA、GSH含量和SOD活性比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of MDA,GSH content and SOD activity in myocardial tissues between the six groups of rats表3 各組大鼠心肌組織MDA、GSH含量和SOD活性比較（n=6，±s）

**P＜0.01；a與Sham組相比，b與I/R組相比，c與Fer-1組相比，d與DMF-H組相比，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Fer-1組DMF-L組DMF-H組DMF+ML385組F MDA（μmol/g）1.25±0.20 4.43±0.51a 2.52±0.34ab 3.55±0.52abc 2.61±0.35ab 3.48±0.47abcd 41.955**GSH（μmol/g）84.30±9.85 31.74±5.16a 62.53±7.28ab 42.42±6.31abc 60.87±7.59ab 45.36±5.80abcd 39.201**SOD（U/mg）53.26±4.13 16.11±2.42a 40.20±3.54ab 25.45±3.07abc 39.87±4.25ab 27.50±3.14abcd 86.926**

2.6 各組大鼠心肌組織Fe2+含量比較 與Sham 組相比，I/R 組大鼠心肌組織中Fe2+含量增高（P＜0.05）；與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L 組和DMF-H組Fe2+含量降低（P＜0.05）；與Fer-1組相比，DMF-L組大鼠心肌組織Fe2+含量增高（P＜0.05），DMF-H組大鼠心肌組織Fe2+含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DMF-H 組相比，DMF+ML385 組大鼠心肌組織Fe2+含量增高（P＜0.05），見圖4。

Fig.4 Comparison of Fe2+content in myocardial tissue between the six groups of rats圖4 各組大鼠心肌組織Fe2+含量比較

2.7 各組大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、TfR1 蛋白的表達(dá)比較 與Sham 組相比，I/R 組大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1 蛋白水平顯著降低，TfR1 蛋白水平增高（P＜0.05）；與I/R組相比，F(xiàn)er-1組、DMF-L組和DMF-H 組Nrf2、GPX4、FTH1 蛋白水平增高，TfR1 蛋白水平降低（P＜0.05）；與Fer-1 組相比，DMF-L 組大鼠Nrf2、GPX4、FTH1 蛋白水平降低，TfR1 蛋白水平增高（P＜0.05），DMF-H 組大鼠心肌組織上述蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與DMF-H 組相比，DMF+ML385組大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1蛋白水平降低，TfR1蛋白水平增高（P＜0.05），見圖5、表4。

Fig.5 Western blot results of Nrf2,GPX4,FTH1 and TfR1 in rat myocardial tissue圖5 大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、TfR1蛋白印跡圖

3 討論

鐵死亡是一種鐵依賴性、非凋亡的細(xì)胞死亡形式，由氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化驅(qū)動(dòng)，以ROS積累為特征。脂質(zhì)ROS 的積累引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸損傷并導(dǎo)致細(xì)胞死亡［12］。因此，鐵死亡的關(guān)鍵因素是Fe2+的積累和脂質(zhì)過氧化，而這可以被鐵螯合劑和抗氧化劑抑制。最近的研究表明，心肌I/R 損傷后可通過激活TfR1 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)ROS 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化并引起鐵積累，且心臟中鐵和MDA 的含量隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，并伴隨GPX4 水平的降低，表明心肌I/R 損傷后鐵死亡被激活［13］。本研究通過結(jié)扎LAD 建立大鼠心肌I/R模型，結(jié)果顯示，與Sham組相比，I/R組大鼠血清CK-MB、cTnI、LDH 水平，心肌細(xì)胞凋亡率，ROS、MDA、Fe2+含量，TfR1 蛋白水平顯著升高，表明心肌I/R 損傷后鐵死亡激活，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］。

Tab.4 Comparison of Nrf2,GPX4,FTH1 and TfR1 protein levels in myocardial tissues between the six groups of rats表4 各組大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、TfR1蛋白水平比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of Nrf2,GPX4,FTH1 and TfR1 protein levels in myocardial tissues between the six groups of rats表4 各組大鼠心肌組織Nrf2、GPX4、FTH1、TfR1蛋白水平比較 （n=6，±s）

**P＜0.01；a與Sham組相比，b與I/R組相比，c與Fer-1組相比，d與DMF-H組相比，P＜0.05。

組別Sham組I/R組Fer-1組DMF-L組DMF-H組DMF+ML385組F核Nrf2/LaminB1 0.45±0.06 0.18±0.03a 0.37±0.05ab 0.24±0.04abc 0.35±0.06ab 0.26±0.04abcd 25.609**GPX4/GAPDH 0.72±0.08 0.35±0.05a 0.61±0.07ab 0.46±0.06abc 0.59±0.07ab 0.48±0.06abcd 24.167**FTH1/GAPDH 0.38±0.05 0.10±0.02a 0.29±0.04ab 0.18±0.03abc 0.26±0.05ab 0.19±0.03abcd 39.218**TfR1/GAPDH 0.23±0.04 0.69±0.07a 0.45±0.06ab 0.61±0.07abc 0.48±0.05ab 0.57±0.06abcd 45.981**

DMF 多用于治療多發(fā)性硬化癥，目前被認(rèn)為是一種可以調(diào)節(jié)ROS 產(chǎn)生的抗氧化劑［15］。越來越多的證據(jù)表明，DMF可能對(duì)ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡有影響，并且可以對(duì)心臟［10］、肝臟［16］和腎臟［17］的再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用。此外，它還被證明可以激活Nrf2信號(hào)通路，對(duì)心肌I/R損傷發(fā)揮保護(hù)作用［10］。然而，目前尚未見研究報(bào)道DMF 對(duì)心肌I/R 損傷的影響與鐵死亡相關(guān)。GPX4 是一種選擇性中和脂質(zhì)氫過氧化物的硒酶，被認(rèn)為是鐵死亡的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)劑，GSH 耗竭降低了GPX4 的活性，GPX4 催化的還原反應(yīng)不能代謝過氧化脂質(zhì)；最后，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的Fe2+和ROS 的積累導(dǎo)致鐵死亡［18］。FTH1 是鐵代謝的關(guān)鍵成員，是細(xì)胞內(nèi)抗氧化劑之一，能抑制Fe2+氧化反應(yīng)，從而保護(hù)細(xì)胞不受鐵離子過量引起的氧化損害［19］。TfR1負(fù)責(zé)控制Fe3+跨細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)并維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)，敲低TfR1 可抑制心肌細(xì)胞I/R誘導(dǎo)的鐵死亡［20］。本研究結(jié)果提示，DMF可以有效降低心肌I/R 組織中的氧化應(yīng)激水平，并減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，有效降低Fe2+含量，并且下調(diào)TfR1 的表達(dá)，上調(diào)GPX4和FTH1的表達(dá)，證實(shí)DMF可以通過抑制鐵死亡來改善心肌I/R損傷。

Nrf2 是一種應(yīng)激誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子，是氧化應(yīng)激和心臟保護(hù)的核心，其轉(zhuǎn)錄激活與抗鐵死亡和抑制心肌I/R 損傷有關(guān)［5-6］。GPX4、FTH1、TfR1、血紅素氧合酶1（HO-1）等與鐵死亡相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)均受Nrf2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［7］。據(jù)報(bào)道，激活Nrf2 可通過上調(diào)GSH、GPX4 和HO-1 抑制鐵死亡，防止腸道I/R 引起的急性肺損傷［21］；Lv 等［22］的研究顯示，依托咪酯能通過激活Nrf2/HO-1通路，抑制心肌I/R大鼠模型的鐵死亡。與上述研究相比，本研究缺氧復(fù)氧時(shí)間不同，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與I/R 組相比，F(xiàn)er-1 組、DMF-L 組和DMF-H組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低，GSH和SOD活性、Nrf2、GPX4 以及FTH1 蛋白水平顯著升高，提示DMF 可能通過激活Nrf2-GPX4 通路，抑制鐵死亡，進(jìn)而減輕心肌I/R損傷。由此可見，Nrf2、GPX4與鐵死亡在心肌I/R損傷中的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究，如何減少鐵死亡相關(guān)性損傷，發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)功能仍是需要攻克的難題。

綜上所述，DMF 可能通過抑制鐵死亡，減輕心肌I/R損傷，且其作用機(jī)制可能與激活Nrf2-GPX4通路有關(guān)。本研究從鐵死亡的角度發(fā)現(xiàn)了DMF 對(duì)心肌I/R 損傷的保護(hù)作用機(jī)制，豐富了DMF 作為心臟保護(hù)劑的機(jī)制研究，下一步將從體外細(xì)胞水平對(duì)此進(jìn)行深入分析。