張婧，孫輝，朱禮軍，馮子人，杜琳，孟愛國

2020 年我國40歲以上人群中卒中患者約1 780萬人，其中新發(fā)腦卒中患者高達(dá)340萬人［1］。臨床上針對缺血性腦卒中的治療主要為藥物溶栓療法和手術(shù)取栓治療［2］，因時間窗等因素限制，只有少數(shù)患者可從中獲益。鐵死亡（Ferroptosis）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種非細(xì)胞凋亡性的程序性細(xì)胞死亡方式，是鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化物積累的結(jié)果［3］。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡在神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控細(xì)胞鐵死亡可能會成為預(yù)防和治療腦卒中的新方法［4-5］。微小RNA（miRNA，miR）主要與靶基因mRNA的3'-非編碼區(qū)結(jié)合，通過降解靶基因mRNA或抑制其翻譯來控制靶基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)［6］。本課題組前期研究表明，miRNA 參與調(diào)節(jié)了缺血性腦損傷的進(jìn)展，且miRNA表達(dá)的動態(tài)變化與腦組織損傷進(jìn)展密切相關(guān)［7-8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠腦皮層神經(jīng)元擬缺血損傷模型中，miR-27a 參與缺血性腦血管疾病發(fā)病過程［9］。然而miR-27a在其中具體的作用機制尚不清楚。本研究采用大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，觀察miR-27a 表達(dá)及鐵死亡變化情況，探討兩者間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雄性SD 大鼠88 只，體質(zhì)量250～280 g，購自北京華阜康科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2020-0004；大鼠飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)實驗動物中心，使用許可編號：SYXK（冀）2015-0038。

1.2 試劑與儀器 線栓（L0000）購自廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；ago-miR-27a 以及antago-miR-27a 購自廣州銳博生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，鐵死亡特異性抑制劑Ferrostatin-1（純度≥90%，17729）購自美國Cayman Chemical公司；TTC溶液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）一抗購自武漢ABclonal 公司；β-actin 一抗購自北京博奧森；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG 二抗購自北京中杉金橋；超敏ExPlus ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）、組織鐵和丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒購自北京金百特生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ZR102-1）、2×SYBR qPCR Mix（熒光定量）試劑盒（ZF102-2）購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.3 分組及給藥 將88只大鼠按隨機數(shù)字表法分成以下11組，每組8 只。實驗1 設(shè)正常（control）組、假手術(shù)（Sham）組、模型組（按照缺血時間不同，分為6 h組、12 h組、24 h組、48 h組）。實驗2設(shè)缺血48 h組（I 48 h組）、缺血48 h+Ferrostatin-1 組（I 48 h+Fer-1 組，于手 術(shù) 前2 h 腹腔注射0.5 mL 的Ferrostatin-1，按2 mg/kg 給藥）、缺血48 h+DMSO 組（I 48 h+DMSO組，于手術(shù)前2 h腹腔注射0.5 mL DMSO）。實驗3設(shè)缺血48 h 組（I 48 h 組）、I 48 h+陰性對照（NC）組、缺血48 h+miR-27a激動劑組（I 48 h+ago-miR-27a組）、缺血48 h+miR-27a抑制劑組（I 48 h+antago-miR-27a組）；于術(shù)前7 d開始向側(cè)腦室分別注射陰性對照試劑（20 μmol/L）、ago-miR-27a（20 μmol/L）、antago-miR-27a（20 μmol/L），每日1 次，連續(xù)5 d，給藥量為5μL。術(shù)后48 h處死大鼠并取材。

1.4 大鼠造模 利用2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉動物。麻醉滿意后行頸正中切口，充分暴露頸動脈后，小心將迷走神經(jīng)與頸總動脈分離，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈，線栓經(jīng)頸內(nèi)動脈至大腦中動脈，形成大鼠半腦缺血。所有手術(shù)均為左側(cè)大腦中動脈栓塞，模型組的缺血時間分別為6、12、24、48 h，經(jīng)藥物干預(yù)的大鼠缺血時間為48 h。假手術(shù)組只經(jīng)頸正中切口，不栓塞大腦中動脈。成功造模標(biāo)志：術(shù)后清醒但不能直線行走，出現(xiàn)右側(cè)偏癱，神經(jīng)功能學(xué)評分1～4分。

1.5 腦組織TTC染色 大鼠在腦缺血后相應(yīng)時間點，立即處死并于冰上取腦組織，迅速放入-20 ℃冰箱冷凍30 min，其后將冷凍的大鼠腦組織切成2 mm 厚的5個冠狀切片。隨后將腦片置于TTC 溶液中，37 ℃放置15 min，翻面繼續(xù)于TTC 染液中避光浸染15 min。染色完成后，腦組織通過4%多聚甲醛固定1 d，后拍照留存。使用Image J 軟件進(jìn)行分析以計算大鼠的腦梗死面積，用梗死面積的百分比（%）表示。缺血區(qū)面積比=（腦切片白色缺血區(qū)域面積）/（腦切片總面積）×100%。

1.6 Western blot檢測GPX4蛋白表達(dá) 稱取凍存的腦組織，每50 mg加入0.2 mL組織裂解液（每1 mL組織裂解液中加入0.01 mL 的蛋白酶抑制劑）進(jìn)行組織蛋白提取。待蛋白提取完成后，對其進(jìn)行SDS-PAGE，后將膠中蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，洗膜后于GPX4 抗體（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜。加入含有辣根過氧化物酶的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，滴加配置好的ECL顯色液，后通過全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析儀掃描并保存結(jié)果圖像。經(jīng)Image J 軟件分析所顯出的蛋白圖像灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算出目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.7 腦組織GSH、組織鐵和MDA 含量檢測 稱取0.1 g腦組織，加入0.9 mL 的勻漿介質(zhì)，冰水浴中剪碎、研磨，制成10%的勻漿液，2 500 r/min離心15 min，吸取上清液。嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明進(jìn)行相應(yīng)操作，計算GSH、組織鐵和MDA含量。

1.8 qPCR 檢測miR-27a 的相對表達(dá)量 根據(jù)RNA 提取試劑盒說明書，嚴(yán)格進(jìn)行大鼠腦組織中總RNA的提取，在波長為260 nm 和280 nm 處測量吸光度，計算RNA 純度和總量。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，保存于-20 ℃冰箱。使用qPCR法進(jìn)行擴增，擴增引物序列見表1。PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃15 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)；72 ℃7 min。選擇U6 snRNA 作為miR-27a 檢測的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，使用相對定量2-ΔΔCt的循環(huán)閾值法計算miR-27a的相對表達(dá)量。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0 對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，結(jié)果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組結(jié)果比較用單因素方差分析，多重比較用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠缺血性腦卒中早期腦組織中miR-27a 表達(dá)及鐵死亡水平變化 與Sham組比較，各模型組大鼠神經(jīng)功能評分增加（P＜0.05），提示造模成功，見圖1A。與Sham組比較，隨著缺血時間的延長，各模型組腦組織中miR-27a的表達(dá)增多，GPX4和GSH含量下降，組織鐵和MDA 的含量升高（P＜0.05）。其中在缺血48 h 組變化最為明顯，在后續(xù)實驗中選擇此時點進(jìn)行缺血干預(yù)。與Control組相比，Sham組中上述結(jié)果變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1、2，表2。

Fig.1 Neurological function score and miR-27a expression in each group of rats圖1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和miR-27a表達(dá)情況

Tab.2 Comparison of GSH,Fe and MDA between the six groups of rats表2 6組中GSH、Fe及MDA水平比較（n=8，±s）

Tab.2 Comparison of GSH,Fe and MDA between the six groups of rats表2 6組中GSH、Fe及MDA水平比較（n=8，±s）

**P＜0.01；a與Sham 組比較，b與6 h 組比較，c與12 h 組比較，d與24 h組比較，P＜0.05。

組別Control組Sham組6 h組12 h組24 h組48 h組F GSH（μmol/L）372.0±39.0 378.0±40.0 291.0±35.0a 235.0±38.0ab 189.0±34.0abc 124.0±36.0abcd 59.931**Fe（μg/g）28.43±2.91 28.56±2.86 39.77±3.31a 47.67±3.26ab 56.33±3.74abc 61.05±3.86abcd 51.178**MDA（nmol/mg）3.63±0.49 3.58±0.57 5.17±0.73a 7.11±0.91ab 10.85±1.35abc 12.26±1.59abcd 39.492**

Fig.2 Expression of GPX4 protein in brain tissues of rats in each group of rats圖2 各組大鼠腦組織GPX4蛋白表達(dá)情況

2.2 Ferrostatin-1 可減輕缺血性腦卒中大鼠早期腦組織損傷 與I 48 h+DMSO 組比較，I 48 h+Fer-1 組大鼠腦梗死面積減?。≒＜0.01），同時GPX4 和GSH表達(dá)升高（P＜0.05），而組織鐵及MDA 含量減少（P＜0.05）；與I 48 h 組相比，I 48 h+DMSO 組變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、4，表3。

Fig.3 Cerebral infarct area of rats in each group of rats圖3 各組大鼠腦梗死面積情況

Fig.4 The relative expression of GPX4 in each group of rats圖4 各組大鼠GPX4相對表達(dá)情況

2.3 miR-27a促進(jìn)大鼠缺血性腦卒中早期鐵死亡和腦組織損傷 與I 48 h+NC組相比，I 48 h+ago-miR-27a組大鼠腦組織中miR-27a表達(dá)升高，腦梗死面積增加（P＜0.05），神經(jīng)功能評分升高（P＜0.05），GPX4和GSH 表達(dá)降低（P＜0.05），但組織鐵及MDA含量增多（P＜0.05）；而給予antago-miR-27a 干預(yù)后，ago-miR-27a 作用被逆轉(zhuǎn)；與I 48 h 組相比，I 48 h+NC 組中相關(guān)結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、6，表4。

Fig.5 The changes of GPX4 in each group of rats圖5 各組大鼠GPX4蛋白表達(dá)變化

3 討論

Tab.3 Comparison of GSH,Fe and MDA between the three groups of rats表3 3組中GSH、Fe及MDA水平比較（n=8，±s）

Tab.3 Comparison of GSH,Fe and MDA between the three groups of rats表3 3組中GSH、Fe及MDA水平比較（n=8，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01；a與I 48 h+DMSO組比較，P＜0.05。

組別I 48 h組I 48 h+DMSO組I 48 h+Fer-1組F GSH（μmol/L）124±36 113±38 267±65a 9.189*Fe（μg/g）61.05±3.86 65.52±5.50 39.68±3.67a 29.168**MDA（nmol/mg）12.26±1.59 11.85±1.60 7.63±1.43a 8.288*

Fig.6 The expression of miR-27a and changes of cerebral infarct size of rats in each group圖6 各組大鼠miR-27a表達(dá)和腦梗死面積變化

鐵死亡是由鐵和脂質(zhì)過氧化物的積累所引起的，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Fe2+增多時，會引起細(xì)胞發(fā)生芬頓（Fenton）反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧以及羥自由基等氧化物質(zhì)；這些物質(zhì)會在細(xì)胞中與多不飽和脂肪酸結(jié)合，進(jìn)而形成大量脂質(zhì)過氧化物和MDA，最終導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生［10］。鐵螯合劑如去鐵胺、去鐵酮，鐵死亡抑制劑Ferrostatin-1 通過降低鐵和脂質(zhì)過氧化物抑制鐵死亡的發(fā)生。GPX4 是重要的抗氧化物，GSH 是其發(fā)揮作用的輔助因子，GSH 和GPX4 減少是引起鐵死亡產(chǎn)生的關(guān)鍵因素［11］。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin 通過抑制胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運體減少GSH合成，使得GPX4合成原料不足，活性下降，促進(jìn)鐵死亡［3］。鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3則直接抑制GPX4活性［12］。因此，鐵、MDA、GSH和GPX4被作為檢測鐵死亡的生物標(biāo)志物，其中前兩者為促鐵死亡因子，后兩者被視為抗鐵死亡因子。當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生時，會引發(fā)腦組織中興奮性毒性反應(yīng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞中GSH 以及GPX4 產(chǎn)生減少［13-14］；同時，當(dāng)缺血性腦卒中發(fā)生后，腦組織中鐵和脂質(zhì)過氧化物積累增加［15-16］，進(jìn)一步促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生。因此，探究鐵死亡與缺血性腦卒中的關(guān)系，對缺血性腦卒中的機制研究以及防治均有重要意義。

Tab.4 Comparison of neurological function score and ferroptosis-associated indicators in brain tissue between the four groups of rats表4 4組中神經(jīng)功能評分和鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的水平比較 （n=8，±s）

Tab.4 Comparison of neurological function score and ferroptosis-associated indicators in brain tissue between the four groups of rats表4 4組中神經(jīng)功能評分和鐵死亡相關(guān)指標(biāo)的水平比較 （n=8，±s）

**P＜0.01；a與I 48 h+NC組比較，b與I 48 h+ago-miR-27a 組比較，P＜0.05。

組別I 48 h組I 48 h+NC組I 48 h+ago-miR-27a組I 48 h+antago-miR-27a組F神經(jīng)功能評分（分）2.63±0.52 2.63±0.52 3.63±0.52a 1.38±0.52ab 25.118**GPX4相對表達(dá)量0.42±0.07 0.39±0.08 0.22±0.04a 0.78±0.11ab 26.603**GSH（μmol/L）124.0±36.0 128.0±33.0 52.0±26.0a 263.0±44.0ab 18.617**Fe（μg/g）61.05±3.86 63.21±3.94 89.47±5.26a 45.67±4.52ab 50.491**MDA（nmol/mg）12.26±1.59 12.47±1.78 17.84±2.25a 7.82±1.31ab 16.170**

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠缺血性腦卒中模型中GSH 含量明顯減少，脂質(zhì)活性氧（ROS）的含量增加［17］。Tuo等［18］研究顯示，在單側(cè)短暫性大腦中動脈閉塞存在的情況下，tau蛋白等與鐵水平的升高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)使用Ferrostatin-1可抑制心肌細(xì)胞鐵死亡，減輕心肌損傷［19］。上述研究表明鐵死亡是一些疾病的重要病理因素之一，抑制鐵死亡的發(fā)生可減輕疾病的病理損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中早期，大鼠腦組織中GPX4、GSH表達(dá)水平降低，而鐵和MDA含量升高，提示鐵死亡參與缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程。本研究進(jìn)一步使用Ferrostatin-1 干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，其可使腦組織中GPX4、GSH表達(dá)水平升高，降低鐵和MDA含量，同時明顯減輕大鼠腦組織損傷。提示抑制鐵死亡的發(fā)生可減輕缺血性腦卒中損傷。

miR-27a 是miR-23a～27a～24-2 基因簇中 的 一員，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［20-21］。有研究報道，在大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞擬缺血損傷模型中，miR-27a 表達(dá)升高，可以參與缺血性腦血管疾病發(fā)病過程［22］；而給予外泌體miR-27a 后可以明顯增加缺血的腦組織損傷［23］，表明miR-27a 具有潛在的促腦缺血損傷作用。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-27a可促進(jìn)鐵死亡的產(chǎn)生［24］，故本研究推測miR-27a 可能與缺血性腦卒中過程中鐵死亡的發(fā)生有關(guān)。為了明確miR-27a 是否參與了缺血性腦卒中的病理過程，筆者觀察了miR-27a的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中miR-27a表達(dá)出現(xiàn)顯著升高，抑制miR-27a 表達(dá)后，大鼠神經(jīng)功能評分降低，腦梗死面積明顯減小，而GPX4 和GSH 的產(chǎn)生增多，且鐵和MDA含量降低。而使用agomiR-27a 促進(jìn)miR-27a 表達(dá)具有相反的效果。提示miR-27a具有加重腦組織損傷的作用，該作用是通過促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生實現(xiàn)的。

綜上所述，在大鼠缺血性腦卒中早期miR-27a的表達(dá)增多，其通過促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生，從而加重腦組織損傷。本研究為探究miR-27a和鐵死亡在缺血性腦卒中過程中的機制以及臨床預(yù)防和治療缺血性腦卒中提供了新的方法和途徑，但miR-27a 與鐵死亡之間的具體作用機制還需更進(jìn)一步研究。