廖益東，明江，張宇，廖一飛，徐卡婭，△

缺血性腦血管疾病可引起腦血管閉塞缺氧，致神經(jīng)元損害，而原代神經(jīng)元培養(yǎng)是神經(jīng)科學(xué)體外研究的重要途徑之一。近年研究表明，原代培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元可用于腦血管疾病體外模型研究，這種原代神經(jīng)元細(xì)胞模型較貼近于人體自身神經(jīng)元的病理生理特點(diǎn)，可模擬出腦卒中后神經(jīng)元缺血再灌注損傷、糖尿病性腦病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型［1-3］。此外，體外培養(yǎng)原代提取的神經(jīng)元有結(jié)果分析精確、易觀察以及實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)勢，已被越來越多地應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究［4-5］。此外，由于神經(jīng)元提取細(xì)節(jié)繁多，細(xì)胞培養(yǎng)難度大，國內(nèi)外相關(guān)研究中選取的消化酶及培養(yǎng)基配方亦不統(tǒng)一［1，6］。本研究采用出生24 h內(nèi)的SD 大鼠進(jìn)行神經(jīng)元提取，選用木瓜蛋白酶與DNA 酶順序消化方案，并對(duì)操作細(xì)節(jié)及接種后培養(yǎng)基選配進(jìn)行多項(xiàng)改進(jìn)，以期尋求一種更加簡便易行的提取方法，為后續(xù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究建立良好的體外細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生24 h內(nèi)清潔級(jí)SD大鼠9只，雌雄不限，體質(zhì)量20～35 g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黔）2018-0001；動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20211012Aazz0619000425。所有大鼠均在自然光照下自由飲食、飲水，溫度25 ℃，動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣，由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部飼養(yǎng)繁殖。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號(hào)：2101450）。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM-F12 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、Neurobasal-A 無血清培養(yǎng)液、B27 購自美國Gibco 公司；馬血清、木瓜蛋白酶粉購自索萊寶公司；L-多聚賴氨酸（1 g/L）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體、神經(jīng)元特異性核蛋白（Neun）試劑盒、β-Tubulin 抗 體、Alexa Fluor?488 標(biāo) 記 的 山 羊 抗 兔IgG 購 自Abcam 公司；DNA 酶粉購自賽國生物科技有限公司；DAB 辣根過氧化物酶（HRP）顯示試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；SABC-Cy3免疫熒光試劑盒購自博士德生物公司；青霉素及鏈霉素購自Hyclone公司。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、-80 ℃低溫冰箱購自美國Thermo 公司；熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，共聚焦顯微鏡購自德國蔡司集團(tuán)，正置熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 配制溶液 5 g/L DNA 酶：稱取5 mg DNA 酶粉，加入1 mL 無菌水溶液，經(jīng)0.22 μm 針式過濾器除菌后備用。將木瓜蛋白酶粉與DMEM-F12 培養(yǎng)基按2∶1 進(jìn)行配制，經(jīng)0.22 μm 針式過濾器除菌后備用。將1 g/L 的L-多聚賴氨酸用超純水稀釋10 倍，配制成0.1 g/L 的多聚賴氨酸。神經(jīng)元接種液：DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%FBS+1%青霉素鏈霉素溶液。神經(jīng)元培養(yǎng)液：Neurobasal-A培養(yǎng)基+2%B27+0.5%青霉素鏈霉素+0.5%谷氨酰胺。

1.3.2 包被培養(yǎng)板 使用0.1 g/L 的L-多聚賴氨酸溶液浸泡6孔板和細(xì)胞爬片，輕輕搖晃使孔底及爬片全部浸潤，37 ℃溫箱過夜，回收L-多聚賴氨酸溶液后，置超凈臺(tái)風(fēng)干，穩(wěn)定4 h備用。接種時(shí)用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗5 min，重復(fù)3次。

1.3.3 分離、消化新生SD 大鼠皮層神經(jīng)元 取24 h 內(nèi)新生SD大鼠，放入75%乙醇中浸泡2 min，取出后用預(yù)冷PBS沖洗干凈。處死乳鼠，快速使腦組織溫度降到0 ℃后迅速將頭顱離斷，放入盛有預(yù)冷DMEM-F12 培養(yǎng)基的燒杯中清洗，隨后轉(zhuǎn)移至另一盛有預(yù)冷10%馬血清和DMEM-F12 培養(yǎng)基的無菌平皿內(nèi)。解剖全程在冰上進(jìn)行，用彎鑷子、直顯微鑷分層剪開頭皮和顱骨，暴露大腦組織，在顯微鏡下充分除去腦組織表面血管膜與嵌入小血管，分離出乳鼠大腦皮層組織，PBS洗滌2 次，轉(zhuǎn)移入盛有DMEM-F12 培養(yǎng)基的10 cm 小皿中。將收集到的大腦皮層組織剪碎（大小為1～2 mm），吹打重懸混勻，順序加入無血清培養(yǎng)基配制的適量木瓜蛋白酶及DNA酶（100～300μL），于37 ℃溫箱里消化20 min，間隔5 min搖勻1次，消化完畢后，加入含有10%FBS的DMEM-F12溶液終止消化，并用巴氏吸管輕柔混勻，靜置5 min。見圖1。

Fig.1 The anatomy process of SD rats圖1 SD大鼠解剖過程

1.3.4 純化、培養(yǎng)神經(jīng)元單細(xì)胞 取上述消化后的細(xì)胞，加入適量DNA 酶，輕柔吹打10 次后靜置2 min；吸取上層單細(xì)胞懸液，將上清液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)備用，下層沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊保留，再加入1～2 mL DMEM-F12 培養(yǎng)液，重復(fù)上述操作3次，分層分步吹打，收集細(xì)胞。將收集到的所有細(xì)胞懸液經(jīng)100 目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液；用含10%FBS 的DMEM-F12 神經(jīng)元接種液重懸細(xì)胞，隨后，將細(xì)胞懸液接種至內(nèi)含細(xì)胞爬片的6 孔板內(nèi)，搖勻，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 h 后及時(shí)更換預(yù)熱的含B27 的Neurobasal-A 神經(jīng)元培養(yǎng)液，并在換液前使用DMEM-F12洗去細(xì)胞器碎片與雜質(zhì)；首次換液為24 h 內(nèi)進(jìn)行全量換液，之后每隔2～3 d 半量換液，培養(yǎng)至7 d 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，并鏡下觀察，拍照記錄細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 接種不同濃度神經(jīng)元單細(xì)胞 將上述純化的單細(xì)胞懸液，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度，經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)將神經(jīng)元細(xì)胞液分為3 種不同的細(xì)胞密度，分別為1×105、5×105、1×106細(xì)胞/mL，接種于6孔板內(nèi)，每孔2 mL。置于37 ℃、5%CO2原代專用培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，使神經(jīng)元貼壁生長，24 h 后拍照記錄并對(duì)比細(xì)胞形態(tài)，選擇5×105細(xì)胞/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 β-Tubulin免疫熒光法鑒定皮層神經(jīng)元 取培養(yǎng)7 d后的神經(jīng)元單細(xì)胞經(jīng)37 ℃復(fù)溫后，使用預(yù)熱的PBS洗滌5 min。采用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min。0.25%TritonX-100 室溫下處理細(xì)胞15 min，PBS 洗滌3次，每次5 min。10%山羊血清封閉30 min，吸去山羊血清，勿洗。滴加β-Tubulin抗體（1∶200）于蓋玻片上，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min。滴加Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶500）于蓋玻片上，室溫避光孵育2 h，PBS 洗滌3次，每次5 min，滴加適量的內(nèi)含4，6-二氨基-2苯基吲哚二鹽酸鹽（DAPI）抗熒光萃滅劑封片。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，用PBS代替一抗，其余方法同上，使用共聚焦顯微鏡觀察并拍攝。

1.3.7 Neun 抗體免疫組織化學(xué)法鑒定皮層神經(jīng)元 取培養(yǎng)7 d 后的神經(jīng)元單細(xì)胞，使用預(yù)熱的PBS 洗滌5 min，37 ℃溫箱下4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min。5%羊血清室溫封閉45 min，加入Neun一抗（1∶200），4 ℃冰箱過夜，PBS洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，避光孵育1 h，加入DAB反應(yīng)顯色，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，鏡下觀察染色部位。

1.3.8 MAP2 免疫熒光法鑒定皮層神經(jīng)元純度 提取培養(yǎng)7 d 后的神經(jīng)元單細(xì)胞，使用預(yù)熱的PBS 洗滌5 min，采用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，每次5 min；室溫下采用0.25%TritonX-100 破膜15 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min；采用10%山羊血清室溫封閉30 min，吸去山羊血清，勿洗。加入一抗MAP2（1∶100），4 ℃冰箱中孵育過夜，37 ℃復(fù)溫10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，加入二抗羊抗兔IgG（1∶100），避光37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，加入SABC-Cy3避光37 ℃孵育45 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min。將細(xì)胞爬片取出，固定于載玻片，并用含有DAPI 的封片液核染色10 min。用倒置熒光顯微鏡觀察。紅色熒光為神經(jīng)元標(biāo)志物，藍(lán)色為細(xì)胞核，分別攝取神經(jīng)元和細(xì)胞核的熒光圖像，計(jì)算同一視野下神經(jīng)元的數(shù)量占該視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比，每張玻片隨機(jī)讀取3個(gè)視野觀察，每次實(shí)驗(yàn)觀察3個(gè)樣本，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取百分比的平均數(shù)為神經(jīng)元的純度。

2 結(jié)果

2.1 不同接種密度對(duì)神經(jīng)元生長狀態(tài)的影響 密度為1×105細(xì)胞/mL孔內(nèi)的神經(jīng)元密度較小，突觸相隔較遠(yuǎn)；5×105細(xì)胞/mL孔內(nèi)的神經(jīng)元僅有少數(shù)聚團(tuán)，但胞體飽滿、胞體間形成交聯(lián)，突觸生長均勻；1×106細(xì)胞/mL 孔內(nèi)的神經(jīng)元密度過大，神經(jīng)元聚集成團(tuán)明顯，個(gè)別神經(jīng)元出現(xiàn)擠壓情況。見圖2。

2.2 皮層神經(jīng)元的生長形態(tài)學(xué)觀察 以密度5×105細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液接種24 h后，細(xì)胞部分貼壁，胞體胞核光暈明顯，僅有少數(shù)樹突生長，見圖3A。接種3 d 后，貼壁細(xì)胞逐漸增多，神經(jīng)元突觸進(jìn)一步生長并延長，交聯(lián)成稀疏網(wǎng)絡(luò)，見圖3B。接種7 d 后，神經(jīng)元仍大量生長，胞體豐滿，并形成更為緊密的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，見圖3C。

2.3 皮層神經(jīng)元β-Tubulin免疫熒光鑒定 共聚焦顯微鏡下可見細(xì)胞胞體和突觸均能被β-Tubulin 抗體所標(biāo)記，證明此細(xì)胞為神經(jīng)元，見圖4。

2.4 皮層神經(jīng)元Neun免疫組織化學(xué)染色 Neun免疫組化染色結(jié)果表明，培養(yǎng)細(xì)胞胞體和樹突均顯棕色，染色呈陽性，證明提取培養(yǎng)細(xì)胞是神經(jīng)元，見圖5。

2.5 MAP2免疫熒光法鑒定皮層神經(jīng)元純度 免疫熒光染色可見神經(jīng)元胞體及樹突著色，結(jié)果顯示，經(jīng)MAP2 鑒 定得到神 經(jīng) 元 純度為（91.06±1.51）%，見圖6。

Fig.2 Growth status of neurons at different inoculation densities(×40)圖2 不同接種密度神經(jīng)元生長狀態(tài)（×40）

Fig.3 Image of SD rat cortical neurons under an inverted microscope(×100)圖3 SD大鼠皮層神經(jīng)元在倒置顯微鏡下圖像（×100）

Fig.4 Cortex neurons identified by β-Tubulin immunofluorescence(×400)圖4 皮層神經(jīng)元β-Tubulin免疫熒光鑒定（×400）

Fig.5 Neun staining of cortical neurons(×400)圖5 皮層神經(jīng)元Neun染色（×400）

Fig.6 MAP2 immunofluorescence identification of cortex neurons圖6 皮層神經(jīng)元的MAP2免疫熒光鑒定

3 討論

隨著細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，原代神經(jīng)元模型已被廣泛應(yīng)用于腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究中［7］。已有研究證實(shí)原代皮層神經(jīng)元可作為體外研究神經(jīng)疾病的模型，如在干細(xì)胞治療缺血性腦卒中的研究中，通過缺血缺氧皮層神經(jīng)元與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞通過線粒體轉(zhuǎn)移的方式發(fā)揮對(duì)受損神經(jīng)元的修復(fù)作用［8-9］。同時(shí)根據(jù)原代神經(jīng)元培養(yǎng)情況，可更加直觀地研究每個(gè)階段神經(jīng)元的發(fā)育，且能夠單獨(dú)觀察局部神經(jīng)元可塑性［10-11］。目前，國內(nèi)外提取神經(jīng)元消化方案及培養(yǎng)步驟繁多復(fù)雜，方案也不統(tǒng)一，既往部分研究者選擇胎鼠進(jìn)行皮層神經(jīng)元提取，但胎鼠的胎齡難以掌握，取材難度大，且增加了操作步驟，極易造成孕鼠死亡［1，12］。在消化酶選擇方面，Brewer［6］比較了多種消化酶，發(fā)現(xiàn)木瓜酶用于原代神經(jīng)元提取時(shí)具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞活性的顯著優(yōu)勢。

本研究結(jié)合國內(nèi)外皮層神經(jīng)元的提取方法及自身的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)并加以改進(jìn)，總結(jié)得到以下幾點(diǎn)：（1）培養(yǎng)基的選擇?？墒褂脽o血清培養(yǎng)基Neurobasal-A，同時(shí)添加B27和谷氨酰胺為神經(jīng)元供能。此法配制的培養(yǎng)基可最大限度地抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長，得到狀態(tài)穩(wěn)定的神經(jīng)元。（2）SD 乳鼠解剖。解剖全程需在冰上進(jìn)行，處死乳鼠后，需快速使腦組織溫度降到0 ℃，盡可能保證神經(jīng)元的存活率。同時(shí)，為保證細(xì)胞代謝，解剖過程需浸泡在含有10%馬血清和DMEM-F12 培養(yǎng)基中進(jìn)行，因?yàn)檠蹇蔀殡x體的神經(jīng)元提供代謝能量及營養(yǎng)物質(zhì)。（3）剝離取材腦皮層段。應(yīng)盡可能去除腦組織外包裹的血管膜和血管，如果去除不完全，會(huì)影響后續(xù)步驟。同時(shí)還會(huì)影響消化步驟，增加操作難度，降低細(xì)胞存活率，無法得到高質(zhì)量的神經(jīng)元。此外，乳鼠的出生時(shí)間越短，腦血管膜越容易剝離，血管膜剝離越干凈，提取的皮層神經(jīng)元純度越高［13-15］。（4）消化步驟。本研究未采用胰酶消化，因?yàn)橐让赶瘯r(shí)間難以控制，且濃度過高會(huì)導(dǎo)致消化過度，本實(shí)驗(yàn)選取木瓜蛋白酶和適量DNA 酶混合消化，既保證細(xì)胞消化完全，又避免過度消化而損失。木瓜蛋白酶較為溫和，消化效果良好，能柔和地處理皮層組織，得到純度更高的神經(jīng)元細(xì)胞［12］。（5）分步分層吹打。FBS 終止消化后，本研究對(duì)吹打方案進(jìn)行改進(jìn)，采用分步分層吹打法，此法的優(yōu)勢在于分步吹打的過程中，盡可能保證收獲更多神經(jīng)元單細(xì)胞，避免了細(xì)胞被過度吹打、損傷。經(jīng)分層分步操作之后如還有團(tuán)塊沉淀，應(yīng)果斷丟棄，造成此原因可能是血管膜未剝離完全，同時(shí)為了防止細(xì)胞懸液結(jié)團(tuán)和黏稠，還應(yīng)該在操作前加入適量的DNA酶。（6）純化神經(jīng)元。需使用100目細(xì)胞過濾網(wǎng)濾除細(xì)胞雜質(zhì)與未清除完全的血管膜組織，此法可最大限度地濾去剪碎的細(xì)胞器碎片，減少影響神經(jīng)元純度的因素［16］。（7）接種細(xì)胞密度的選擇。經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，采用L-多聚賴氨酸過夜浸泡細(xì)胞爬片，PBS 清洗后滴加適合密度的細(xì)胞懸液，此方案可有效避免神經(jīng)元后期的聚集現(xiàn)象。細(xì)胞密度在實(shí)驗(yàn)中較為重要。首先，種板密度低，神經(jīng)元較難存活和成熟，細(xì)胞間難以形成交聯(lián)。其次，膠質(zhì)細(xì)胞及雜細(xì)胞會(huì)大量分裂，導(dǎo)致神經(jīng)元存活率降低，實(shí)驗(yàn)失敗。本研究發(fā)現(xiàn)每孔為5×105細(xì)胞/mL 最為適宜，接種7 d后，得到的神經(jīng)元生長狀態(tài)穩(wěn)定。原代細(xì)胞液中混有的細(xì)胞器碎片和雜質(zhì)超過12 h 會(huì)貼壁牢固，且在后續(xù)換液中難以清除，細(xì)胞器碎片及雜質(zhì)將直接影響神經(jīng)元存活和正常代謝，因而種板4～6 h后需及時(shí)進(jìn)行換液。種植細(xì)胞12 h后，膠質(zhì)細(xì)胞也開始分裂，需及時(shí)更換預(yù)熱37 ℃的無血清培養(yǎng)基來抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長。此外，本研究在操作過程中發(fā)現(xiàn)，冰冷的培養(yǎng)基可能會(huì)影響皮層神經(jīng)元，導(dǎo)致貼壁神經(jīng)元脫落，因此預(yù)熱培養(yǎng)基尤為重要。種植細(xì)胞完成后的換液，禁止使用PBS 清洗，需用DMEM 清洗，既能除去雜質(zhì)和細(xì)胞碎片，也可減少細(xì)胞脫落，得到貼壁更加牢固的神經(jīng)元。隨后，本研究采用β-Tubulin免疫熒光法和Neun 抗體免疫組化法鑒定細(xì)胞為神經(jīng)元且接種7 d，MAP2免疫熒光法鑒定神經(jīng)元純度較高，為（91.06±1.51）%。

綜上所述，采用24 h內(nèi)新生SD大鼠大腦經(jīng)木瓜蛋白酶與DNA 酶順序消化可得到優(yōu)質(zhì)皮層神經(jīng)元單細(xì)胞懸液。以5×105細(xì)胞/mL/孔密度接種7 d 后，得到的神經(jīng)元生長狀態(tài)穩(wěn)定、純度高，可作為研究各類神經(jīng)疾病的細(xì)胞模型，為神經(jīng)元的提取及原代培養(yǎng)提供了切實(shí)可行的方案。