袁莉敏 翟閃閃 趙嵐嵐 韓 笑 劉 靈

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院(450000)

流產(chǎn)是臨床較常見(jiàn)的妊娠并發(fā)癥之一，發(fā)病率為1%～5%[1]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尋找流產(chǎn)病因及風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)臨床開(kāi)展遺傳咨詢具有積極意義。有研究顯示[2]，偶發(fā)性流產(chǎn)與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者胚胎染色體異常存在差異。目前，關(guān)于流產(chǎn)次數(shù)與流產(chǎn)胚胎染色體異常以及拷貝數(shù)量間差異報(bào)道較少[3]。本研究分析染色體數(shù)目和拷貝數(shù)異常與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的可能關(guān)系及影響因素，為臨床診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基本資料

以本院2019年3月-2020年12月就診的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者為復(fù)發(fā)組，偶發(fā)性流產(chǎn)患者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：孕12周內(nèi)連續(xù)流產(chǎn)≥2次[7]；②上次流產(chǎn)距本次入組間隔時(shí)間>3個(gè)月；③未妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：免疫功能、解剖結(jié)構(gòu)及白帶異常。研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)倫理委員會(huì)論證通過(guò)。

1.2 流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體檢測(cè)

按照QIAamp DNA Blood Midi Kit(QIAGEN公司)標(biāo)準(zhǔn)操作提取流產(chǎn)組織細(xì)胞測(cè)定DNA濃度，使用染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)試劑盒(杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司)可逆末端終止測(cè)序法進(jìn)行DNA純化、文庫(kù)制備、qPCR定量、稀釋變性等，參照NextSeq CN500測(cè)序儀使用標(biāo)準(zhǔn)操作程序測(cè)序。數(shù)據(jù)通過(guò)科諾安數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)，排除母血污染和質(zhì)控不合格樣品，獲得目標(biāo)染色體的Z值和全部>100kb的染色體基因組拷貝數(shù)變異。

1.3 觀察指標(biāo)

分別對(duì)各組流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體單體、三體、四體、多倍體差異進(jìn)行比較，比較染色體拷貝異常情況。比較復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者染色體異常與年齡、自身免疫性抗體(抗磷脂抗體)陽(yáng)性率、流產(chǎn)次數(shù)關(guān)系。采用logistics多因素分析復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者染色體異常影響因素。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 分組及一般情況

復(fù)發(fā)組90例，年齡30.0±2.7歲，體質(zhì)指數(shù)(BMI)24.8±3.0 kg/m2；其中流產(chǎn)2次36例，年齡29.6±2.6歲，BMI 24.7±3.0 kg/m2；流產(chǎn)3次34例，年齡30.0±3.5歲，BMI 24.8±3.6 kg/m2；流產(chǎn)4次20例，年齡30.7±3.8歲，BMI 25.0±2.8 kg/m2。對(duì)照組50例，年齡29.8±1.9歲，BMI 24.4±2.0 kg/m2。各組年齡和BMI無(wú)差異(P>0.05)。

2.2 染色體核型分析

復(fù)發(fā)組與對(duì)照組流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體發(fā)生四體率、多倍體率無(wú)差異(P>0.05)，發(fā)生單體率低于對(duì)照組、發(fā)生三體率復(fù)發(fā)組高于對(duì)照組(P<0.05)；復(fù)發(fā)組不同流產(chǎn)次數(shù)患者發(fā)生染色體四體率、多倍體率無(wú)差異(P>0.05)，發(fā)生三體率和單體率均存在差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體核型分析[例(%)]

2.3 染色體拷貝異常情況

復(fù)發(fā)組染色體數(shù)目和拷貝異常率(76例，84.4%)高于對(duì)照組(21例，42.0%)(χ2=27.211，P<0.01)，染色體致病性拷貝變異率(14例，15.6%)高于對(duì)照組(2例，4.0%)(χ2=4.240，P=0.039)；且流產(chǎn)次數(shù)2次(3例，8.3%)、3次(4例，11.8%)、4次(7例，35.0%)患者的染色體拷貝異常率依次升高(χ2=7.558，P=0.023)。

2.4 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)染色體數(shù)目和拷貝異常單因素分析

復(fù)發(fā)組染色體拷貝異?；颊吣挲g、流產(chǎn)次數(shù)以及自身免疫抗體陽(yáng)性率均高于染色體拷貝正?；颊?。見(jiàn)表2。

表2 復(fù)發(fā)組染色體數(shù)目和拷貝異常單因素分析

2.5 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)染色體數(shù)目和拷貝異常多因素分析

通過(guò)多因素分析，年齡高、流產(chǎn)次數(shù)多以及自身免疫抗體陽(yáng)性高均是造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者染色體數(shù)目和拷貝異常的危險(xiǎn)因素。見(jiàn)表3。

表3 復(fù)發(fā)組染色體數(shù)目和拷貝異常多因素分析

3 討論

對(duì)流產(chǎn)患者遺傳學(xué)研究中，胚胎染色體數(shù)目異常是其主要原因。有研究報(bào)道[5]，自然流產(chǎn)患者中染色體數(shù)目未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中，隨著患者流產(chǎn)次數(shù)增多細(xì)胞染色體異常升高[6]。在對(duì)復(fù)雜性流產(chǎn)患者染色體分析研究中，染色體拷貝數(shù)目異常備受關(guān)注。以往研究發(fā)現(xiàn)[7-9]，染色體拷貝異常與出生后生長(zhǎng)發(fā)育異常以及智力障礙相關(guān)。在5號(hào)染色體中缺失26.65M則提示顯著發(fā)生貓叫綜合征；但有研究[10]認(rèn)為，多數(shù)基因片段缺失或重復(fù)并不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn)，而多個(gè)基因片段共同作用可能會(huì)導(dǎo)致顯著臨床癥狀[11]。所以在對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)疾病發(fā)生與染色體異常關(guān)系分析中需要較大樣本才能予以驗(yàn)證。

本研究中，復(fù)發(fā)組流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體拷貝異常率顯著高于對(duì)照組，且隨著復(fù)發(fā)流產(chǎn)次數(shù)增加染色體拷貝異常率逐步升高。有研究[12]顯示，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與患者高齡、子宮異常、夫妻染色體異常以及內(nèi)分泌異常顯著相關(guān)。但在排除了流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體異常、內(nèi)分泌異常以及生殖道畸形后，仍有35%～50%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因不明。本文對(duì)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者染色體拷貝異常影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示孕婦年齡、流產(chǎn)次數(shù)以及自身免疫抗體陽(yáng)性率升高均是危險(xiǎn)因素。分析認(rèn)為：隨著女性年齡增長(zhǎng)，卵母細(xì)胞紡錘絲的形成以及染色體排列順序發(fā)生顯著變化，線粒體功能下降，機(jī)體發(fā)生整倍體及表觀遺傳學(xué)變化風(fēng)險(xiǎn)升高。國(guó)外有研究顯示[13]，35歲以上女性發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)胚胎染色體異常概率顯著升高；而隨著流產(chǎn)次數(shù)增加，患者抗磷脂抗體以及磷脂綜合征風(fēng)險(xiǎn)升高。女性自身免疫性抗體水平升高，也在一定程度上增加了發(fā)生復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明[10]，免疫抑制基因參與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生過(guò)程，免疫抑制可以治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)。王文華等[14]在分析復(fù)發(fā)性流產(chǎn)危險(xiǎn)因素指出，患者年齡較高是造成流產(chǎn)組織細(xì)胞染色體異常的影響因素。

綜上所述，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者染色體數(shù)目和拷貝數(shù)異常發(fā)生率增加，而年齡較高、流產(chǎn)次數(shù)增加以及自身免疫性抗體水平升高均是造成復(fù)發(fā)性流產(chǎn)者染色體異常的危險(xiǎn)因素。