儲(chǔ)莉鳴 馬梓汶* 陳守真

1.上海市浦東新區(qū)婦幼保健院(201206)；2.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院

目前臨床尚有50%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)原因不明，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)。諸多研究認(rèn)為RSA與妊娠早期母體免疫反應(yīng)相關(guān)，輔助性細(xì)胞Th17與調(diào)節(jié)細(xì)胞Treg的相互作用導(dǎo)致母體對(duì)胎兒發(fā)生免疫耐受與排斥反應(yīng)失衡是導(dǎo)致USAR的主要機(jī)制[1-2]。外周血高遷移率族蛋白B 1(HMGBl)具有較強(qiáng)致炎作用。參與機(jī)體炎性發(fā)生發(fā)展，不僅可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，促使炎性因子分泌且能通過促進(jìn)炎性細(xì)胞成熟使患者炎性反應(yīng)加重[3]。白細(xì)胞介素-17(IL-17)也是早期炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子，可通過釋放前炎性細(xì)胞因子來加重炎性反應(yīng)[4]。研究表明[5]：因炎性因子水平升高引發(fā)的母體細(xì)胞因子改變與URSA發(fā)生有一定相關(guān)性?；诖?，本研究探究外周血IL-17、HMGB1水平與Th17/Treg細(xì)胞的關(guān)系。以期為臨床規(guī)范提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2019年3月-2020年3月本院就診的URSA孕婦為URSA組。納入標(biāo)準(zhǔn)，①經(jīng)診斷確診為URSA，流產(chǎn)≥3次；②未發(fā)現(xiàn)明確流產(chǎn)病因。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腫瘤；②免疫疾?。虎廴旧惓?、生殖感染；④臨床資料不全；⑤既往孕期治療史。體檢健康孕婦60例為對(duì)照組。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，患者均簽署知情同意書。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1儀器試劑流式細(xì)胞儀(Attune NxT流式細(xì)胞儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)、流式抗體(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)、試劑盒(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司)、酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)、離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司)。

1.2.2檢測(cè)患者入院后采集靜脈血5ml(健康孕婦于體檢當(dāng)日)，抗凝分液后離心，分離外周單細(xì)胞，按1×106制成細(xì)胞懸液，鋪至培養(yǎng)板，加入10%胎牛血清，與50ng/ml豆蔻酰佛波醇乙酯2.5μl、1ug/ml離子霉素2μl、10ug/ml離子霉素2μl混勻，孵育4h；加入單抗CD420μl孵育20min，最后分別加入2ml染色緩沖液與20μl抗IL-17單抗孵育15min；再次離心10min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞，計(jì)算比值。血液離心分離血清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)HMGB1、IL-6、IL-10、IL-17、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)水平。

1.3 觀察指標(biāo)

檢測(cè)兩組HMGBl、Thl7、Treg、Thl7/Treg、IL-6(interleukin-6，IL-6)、IL-10(interleukin-10，IL-10)、IL-17、TGF-B等指標(biāo)；分析外周血IL-17、HMGB1水平與Th17/Treg細(xì)胞關(guān)系，以及IL-17、HMGB1的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況

URSA組60例，年齡(27.4±5.1)歲(21～35歲)，孕周(8.8±1.6)周(6～10周)；對(duì)照組60例，年齡(28.0±5.7)歲(21～36歲)，孕周(8.8±1.6)周(6～10周)。兩組年齡和孕周無差異(P>0.05)。

2.2 兩組外周血免疫指標(biāo)比較

URSA組Th17細(xì)胞、Th17/Treg值高于對(duì)照組，Treg細(xì)胞低于對(duì)照組(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組外周血免疫指標(biāo)比較

2.3 兩組炎癥因子指標(biāo)比較

URSA組HMGB1、IL-6、IL-17水平高于對(duì)照組，TGF-β、IL-10水平低于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組炎癥因子指標(biāo)比較

2.4 IL-17、HMGB1水平與免疫因子相關(guān)性

IL-17、HMGB1水平與Th17、Th17/Treg、IL-6正相關(guān)，與Treg、TGF-B、IL-10負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 IL-17、HMGB1水平與各免疫因子相關(guān)性

2.5 IL-17、HMGB1預(yù)測(cè)URSA價(jià)值

ROC曲線分析顯示，IL-17、HMGB1水平預(yù)測(cè)URSA的AUC分別為0.790、0.980，均具有一定價(jià)值；以約登指數(shù)的最大切點(diǎn)作為最佳臨界值，該點(diǎn)預(yù)測(cè)敏感度、特異度均較高。將IL-17、HMGB1水平納入logistic回歸模型，通過回歸系數(shù)得出兩項(xiàng)聯(lián)合的數(shù)值計(jì)算公式=IL-17 +(-0.278)/(-0.103)×HMGB1，得出聯(lián)合數(shù)據(jù)。進(jìn)一步ROC曲線分析顯示，兩項(xiàng)聯(lián)合預(yù)測(cè)敏感度最高。見表4。

表4 IL-17、HMGB1水平診斷URSA價(jià)值

3 討論

母胎界面在正常妊娠情況下存在一定量的免疫細(xì)胞，而免疫細(xì)胞的正常存在與比例構(gòu)成免疫耐受，對(duì)妊娠正常分娩具有保護(hù)作用[6]。在某些病理因素的影響下，例如炎性因子的增加，機(jī)體免疫細(xì)胞的數(shù)量改變、比例失衡，可直接和(間接)損傷機(jī)體免疫功能，不僅使患者感染率和免疫疾病的發(fā)病率升高，且促使母體對(duì)胚胎發(fā)生免疫排除反應(yīng)，最終導(dǎo)致流產(chǎn)，URSA發(fā)生[7-8]。

Thl7是Th細(xì)胞亞群中的一種，具有強(qiáng)促炎作用，參與免疫疾病與排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。Treg是轉(zhuǎn)錄因子FOXP3的一種，具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能，可在細(xì)胞接觸與分泌抑制過程發(fā)揮抗炎作用，維持自身免疫耐受[9-10]。本研究結(jié)果顯示，URSA組Th17細(xì)胞、Th17/Treg值均高于對(duì)照組，Treg細(xì)胞低于對(duì)照組?？赡茉?yàn)閁RSA患者的免疫耐受功能受損，抗炎作用減弱，炎性反應(yīng)加強(qiáng)，Treg細(xì)胞減少，Thl7細(xì)胞增多。有研究表明[11]，Treg可通過免疫抑制對(duì)母體免疫耐受起到促進(jìn)作用，Treg數(shù)量及功能欠缺會(huì)減弱母體免疫耐受維持，導(dǎo)致URSA發(fā)生。

IL-17是Thl7的效應(yīng)因子，具有誘導(dǎo)機(jī)制金屬蛋白酶、趨化因子表達(dá)、中性粒子聚集作用，引發(fā)組織浸潤(rùn)與破壞[12]。HMGB1通過參與細(xì)胞復(fù)制轉(zhuǎn)錄重組修復(fù)全過程，誘導(dǎo)信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)，放大機(jī)體炎癥[13]。本研究結(jié)果顯示，URSA組HMGB1、IL-6、IL-17水平均高于對(duì)照組，TGF-B、IL-10水平均低于對(duì)照組。可能原因： IL-6、IL-17是Thl7的相關(guān)因子，在URSA表達(dá)與Thl7具有一致性； IL-10、TGF-β是Treg的相關(guān)細(xì)胞因子，表達(dá)亦具有一致性； IL-17、HMGB是炎性表達(dá)因子，URSA時(shí)患者免疫抑制細(xì)胞減少，炎性放大，IL-17、IL-6、HMGB水平上升，TGF-β、IL-10水平下降。

本研究對(duì)IL-17、HMGB1水平與各指標(biāo)相關(guān)性進(jìn)行分析顯示，IL-17、HMGB1水平與Th17、Th17/Treg、IL-6及組別正相關(guān)，與Treg、TGF-B、IL-10負(fù)相關(guān)。提示機(jī)體炎性發(fā)生、母體界面的免疫失衡與IL-17、HNGBI、TH17/Treg值和IL-6水平異常升高有關(guān)。Treg、TGF-B、IL-10下降，進(jìn)一步反映IL-17、HMGB1與免疫細(xì)胞存在關(guān)聯(lián)，參與了Th17與Treg平衡調(diào)節(jié)與URSA發(fā)病過程?？赡茉?yàn)閇14-16]： HMGB1、IL-17通過Th17發(fā)揮作用，促進(jìn)炎性細(xì)胞釋放，Th17細(xì)胞及相關(guān)的IL-6、IL-17水平增加； HMGB1、IL-17促使炎性程度加重，通過作用于Treg細(xì)胞參與免疫因子調(diào)控，使Treg細(xì)胞及相關(guān)IL-10、TGF-β水平減少；HMGB1、IL-17作用于Th17、Treg細(xì)胞，導(dǎo)致Th17與Treg比例失衡。有研究表明[17]，HMGB1表達(dá)異常常出現(xiàn)于病理妊娠，高表達(dá)的HMGB1與URSA發(fā)生關(guān)系密切，與本研究結(jié)論一致。通過IL-17、HMGB預(yù)測(cè)URSA具有較好的準(zhǔn)確性；從敏感度、特異度來看，IL-17、HMGB預(yù)測(cè)URSA均有一定價(jià)值，而兩者聯(lián)合運(yùn)用提高了預(yù)測(cè)敏感度。由于本研究例數(shù)較少，兩項(xiàng)指標(biāo)診斷預(yù)測(cè)效果仍需深入研究，但可看出與URSA發(fā)生關(guān)聯(lián)密切，臨床可將其作為觀察指標(biāo)，為診治URSA提供參考依據(jù)。

綜上所述，URSA患者外周血IL-17、HMGB1水平呈異常高表達(dá)，與Th17/Treg細(xì)胞呈正相關(guān)，臨床可將其作為治療觀察指標(biāo)。