張錦陽 孫莉麗 遲 祥 王 楊

遼油寶石花醫(yī)院(盤錦，124010)

不良妊娠結局包括胚胎生長停滯、自然流產、早產、死產、胎兒畸形、出生缺陷等病理性妊娠以及分娩并發(fā)癥，在我國發(fā)生率為10%～15%[1]。有研究指出，生育年齡推遲、生物學因素(如病毒、細菌、寄生蟲感染等)、免疫因素以及生活壓力均可能導致其發(fā)生[2]。作為葉酸代謝途徑中的關鍵酶，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)編碼基因位于染色體1p36.3上，當發(fā)生基因變異時可降低葉酸利用率，與反復流產、胎兒生長受限和死產等不良妊娠結局相關[3]。本研究對基于259例遼寧省盤錦地區(qū)妊娠期孕婦MTHFR基因多態(tài)性與不良妊娠結局相關性進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年10月-2020年10月于本院就診的、既往有不良妊娠結局史婦女為觀察組，既往無不良妊娠結局史孕婦為對照組。納入標準：①不良妊娠組既往有明確不良妊娠史，包括胚胎停育、無腦兒、腦積水、腦癱、唇腭裂、先天性心臟病、自然流產、神經管缺陷、肛門閉鎖以及多發(fā)畸形等；②對照組 有≥1次正常妊娠史，且無不良妊娠史；③兩組孕期均無服用違規(guī)藥物史及放射性物質接觸史；④籍貫均為遼寧盤錦，且對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：①有家族遺傳病史；②合并糖尿病、甲狀腺功能異常等；③合并惡性腫瘤；④合并精神類疾??；⑤臨床資料不全。本研究經本院倫理委員會審批。

1.2 MTHFR基因多態(tài)性檢測

取研究對象靜脈血，采用柱式DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，檢測DNA濃度及純度，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)檢測MTHFR基因C677T和 A1298C的多態(tài)性。PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，反應體系：DNA模板1μl，上游引物和下游引物各0.5μl，10×Buffer(Mg2+)2.5μl，dNTP Mixture 2μl，rTaq DNA聚合酶1μl，ddH2O 17.5μl，反應條件和引物序列見表1。在DNA擴增結束后，將所得產物酶切后(RFLP試劑購自新西蘭BioLabs公司)置37℃ 2h，行2%瓊脂糖凝膠電泳，分析MTHFR基因分型。

表1 目的基因引物序列及反應條件

1.4 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0分析處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料以(%)表示，兩組間比較采用χ2檢驗；采用Hardy-weinberg檢驗兩組基因型的頻率分布是否達到遺傳平衡。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

觀察組124例，年齡(27.9±2.7)歲(23～36歲)，收縮壓/舒張壓(114.3±6.2/82.8±5.7)mmHg，體質指數(shù)(BMI)(21.8±2.5)kg/m2；對照組135例，年齡(28.5±2.7)歲(22～36歲)，收縮壓/舒張壓(113.1±5.7/81.7±4.9)mmHg，BMI(21.6±2.4)kg/m2。兩組年齡、血壓及BMI無差異(P>0.05)。

2.2 Hardy-weinberg平衡檢驗

行Hardy-weinberg平衡檢驗兩組標本的群體代表性和可靠性。結果表明，MTHFR C677T、A1298C兩個位點2和P分別為(χ2=2.852，P=0.093；χ2=2.156，P=0.164)，基因型頻率分布無差異(P>0.05)，表明收集人群樣本基因型頻率分布達到遺傳平衡，為同一孟德爾群體結果，標本具有可比性和區(qū)域代表性。

2.3 基因型頻率比較

觀察組C677T位點TT頻率和A1298C位點CC頻率均高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組基因型頻率比較[例(%)]

2.4 等位基因頻率比較

觀察組C677T等位基因T位點頻率、A1298C等位基因C位點頻率均高于對照組(P<0.05)(表3)。

表3 兩組等位基因頻率比較[例(%)]

2.5 聯(lián)合基因型頻率比較

以CC/AA聯(lián)合基因型頻率分布作為對照，比較兩組間各聯(lián)合基因型頻率的分布差異。結果表明，觀察組攜帶CC/CC、CT/CC、TT/AA和TT/AC聯(lián)合基因型頻率均高于對照組(P<0.05)(表4)。

表4 兩組C677T和A1298C聯(lián)合基因型頻率比較[例(%)]

3 討論

葉酸是生理過程中必需維生素，需被葉酸還原酶激活才能發(fā)揮其生理活性。MTHFR是葉酸代謝途徑中的限速酶，在催化作用下可將5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，同時還可產生大量甲基供體，使同型半胱氨酸被甲基化生成甲硫氨酸[4]。多項研究表明[1,5]，MTHFR基因變異與胚胎發(fā)育異常和流產等有關。

3.1 MTHFR基因多態(tài)性

MTHFR基因位于1號染色體短臂(1p36.22)，基因片段總長度1980bp，由12個外顯子和10個內含子組成，編碼656個氨基酸[6]。截至目前已經報道了數(shù)百種該基因的DNA序列變異，其中研究最多的兩個單核苷酸多態(tài)性是C677T(Rs1801133)和A1298C(Rs1801131)[7]。第4外顯子677T等位基因導致222位氨基酸丙氨酸被纈氨酸替代，與野生型(CC基因型)相比，MTHFR的TT純合子和CT雜合子處理葉酸效率分別只有10%～20%和65%[8]。第7外顯子1298C等位基因導致429位谷氨酸被丙氨酸替代，導致酶活性和耐熱性降低。有多項研究報道了多種疾病與MTHFR基因變異相關，包括心腦血管疾病、唐氏綜合征、習慣性流產、先天性出生缺陷、不育以及腫瘤等[9]。流行病學顯示，677位點的變異頻率因國家、地區(qū)、民族不同而具有顯著差異。歐洲人群677T等位基因頻率為22%～44%，非洲撒哈拉地區(qū)黑人為7%，日本人為34%，我國北方地區(qū)女性 TT型頻率為37.35%，南方地區(qū)女性為10.44%[10]。有研究表明[11]，C677T和A1298C兩個位點存在協(xié)同作用，雜合型MTHFR基因型組合的酶活性較野生型純合子降低了50%，二者均可導致機體高同型半胱氨酸血癥，進一步導致多種APOs的發(fā)生。

3.2 MTHFR基因多態(tài)性與APOs的相關性

本研究表明，觀察組C677T位點TT頻率、A1298C位點CC頻率、C677T等位基因T位點頻率、A1298C等位基因C位點頻率均高于對照組，攜帶CC/CC、CT/CC、TT/AA和TT/AC 聯(lián)合基因型頻率均高于對照組。因此，MTHFR基因多態(tài)性與不良妊娠結局發(fā)生相關，是不良妊娠遺傳易感性因素。MTHFR基因多態(tài)性導致的不良妊娠結局病理機制，筆者總結既往報道認為可能有以下原因[12-16]：①MTHFR活性下降導致DNA和蛋白質甲基化障礙，胎兒生長發(fā)育受限最終發(fā)生流產和出生缺陷，如在神經管發(fā)育期間可導致神經管閉合障礙而引起神經管缺陷；②高同型半胱氨酸血癥使機體處于高氧化應激狀態(tài)并增加血栓形成的風險，引起的胎盤毒性作用和血栓栓塞致使流產發(fā)生；③高同型半胱氨酸血癥可通過促進血小板活化、聚集等機制損傷血管內皮細胞，從而增加妊娠期婦女發(fā)生妊高癥的風險；④高同型半胱氨酸血癥可誘導脂肪細胞分泌胰島素拮抗素，引起胰島素抵抗增加妊娠期糖尿病發(fā)生風險；⑤先天性心臟病病因復雜，目前普遍認為是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果，高同型半胱氨酸血癥具有胚胎毒性，心血管的生長發(fā)育因此受到影響，通過與其他基因和外界因素的交互作用共同導致先心病發(fā)生；⑥胚胎神經管和顱面部的發(fā)育均起源于神經嵴細胞，葉酸缺乏是神經管缺陷的危險因素，因此MTHFR多態(tài)性也可能與非綜合征性唇腭裂的發(fā)病相關。本研究未發(fā)現(xiàn)677和1298位點TT/CC聯(lián)合基因型，根據(jù)自然選擇的觀點，可能是由于這種聯(lián)合變異基因型存活數(shù)目較少，在胚胎或胎兒時期就因自然流產而被淘汰。

本研究還一定不足，如樣本量較小且未將妊娠期婦女受教育程度、月經情況及妊娠期間服用葉酸情況等因素納入研究，下一步可擴大樣本量并進行多因素分析研究以提高研究結果的質量。

綜上所述，MTHFR基因多態(tài)性與不良妊娠結局的發(fā)生有一定相關性，可對備孕人群篩查MTHFR基因多態(tài)性并早期干預，如在孕早期及時補充葉酸和維生素B12以降低血漿同型半胱氨酸水平，對降低不良妊娠發(fā)生、預防出生缺陷具有十分重要的意義。