孫玉明, 張 婷, 徐曉洋, 楊永恒, 張永俠, 徐敏月, 原海燕,①

〔1. 江蘇省中國科學院植物研究所(南京中山植物園), 江蘇 南京 210014;2. 江蘇省駱運水利工程管理處, 江蘇 宿遷 223800〕

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)，又名甜葉菊，為菊科(Asteraceae)甜菊屬(SteviaCav.)多年生草本植物，由于其葉片中富含的甜菊糖苷具有潛在藥用價值而備受關注。甜菊糖苷是包括甜菊苷、萊鮑迪苷A和萊鮑迪苷C等在內(nèi)的、由多種四環(huán)二萜類化合物組成的一類化合物。甜菊糖苷具有高甜度、低熱量的特征，并在降血糖、降血脂、預防齲齒以及提高人體免疫力等方面具有重要功能[1-3]。上述特點極力推動了甜菊糖苷在醫(yī)療和食品領域的應用以及甜菊商業(yè)化栽培的進程。

氮素是影響植物生長發(fā)育和生理過程的關鍵營養(yǎng)元素，增施氮肥可以顯著提高甜菊葉片光合碳同化速率以及干質量形成[4,5]。氮素還會直接影響植物初級代謝與次級代謝平衡，并在甜菊糖苷合成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。目前，大多數(shù)研究認為增施氮肥會降低甜菊葉片中甜菊糖苷總含量[5-7]，但是也有部分研究發(fā)現(xiàn)氮肥投入與葉片甜菊糖苷含量之間存在正相關關系[4,8]或無顯著相關關系[9,10]。甜菊糖苷含量對氮素的差異響應可能與土壤肥力、氮肥投入水平以及甜菊基因型等因子有關，并且最新研究發(fā)現(xiàn)，氮素對甜菊糖苷合成的影響可能與“生長-分化權衡”及葉片碳代謝重編程有關[11]。

生育期也是影響植物生長和代謝的關鍵因子，并且植物生育期進程和生理過程也會受到氮素的影響[12]。舒世珍[13]認為，甜菊葉片中的甜菊糖苷含量在現(xiàn)蕾期達到最高，進入開花期后，甜菊生長緩慢、枯葉掉落并且葉片中甜菊糖苷含量下降。因此，在甜菊實際生產(chǎn)中，通常將現(xiàn)蕾期定義為農(nóng)藝收獲的最佳時期。然而，目前鮮有研究關注甜菊現(xiàn)蕾期與開花期甜菊葉片甜菊糖苷含量的變化規(guī)律，并且關于氮素對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊生長和葉片甜菊糖苷合成的影響尚不清楚。

本研究選取甜菊品種‘中山8號’(‘Zhongshan No. 8’)作為研究對象，通過比較不同施氮處理下不同生育期(現(xiàn)蕾期和開花期)甜菊不同器官干質量、氮素吸收累積、全碳和可溶性糖含量以及葉片甜菊糖苷含量和累積量的變化，旨在明確施氮影響不同生育期甜菊葉片中甜菊糖苷含量變化的生理機制，并為確定高產(chǎn)優(yōu)質甜菊的收獲時間及相應施氮管理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為江蘇省中國科學院植物研究所自主選育的甜菊品種‘中山8號’1年生扦插苗，實驗地位于江蘇省中國科學院植物研究所試驗基地。實驗地耕作層土壤中有機質含量34.24 mg·g-1、全氮含量3.28 mg·g-1、速效磷含量57.84 mg·kg-1及速效鉀含量261.72 mg·kg-1，pH 7.21。

1.2 實驗設計

設置不施氮(N0)和施氮(N1)2個處理，每個處理設置3個小區(qū)作為重復，每個小區(qū)面積1.25 m×2.00 m。于2020年5月30日移栽長勢基本一致的甜菊扦插苗，每個小區(qū)移栽12株?；谇捌谘芯縖14]，施氮處理每小區(qū)施尿素163.0 g(折合氮300 kg·hm-2)，按照質量比5∶3∶2依次作為基肥、分枝肥和促花肥分次施用。每個小區(qū)均施磷酸鈣156.0 g和氯化鉀37.5 g(分別折合五氧化二磷75 kg·hm-2和氧化鉀90 kg·hm-2)，作為基肥一次性施入。分別在現(xiàn)蕾期(8月30日)和開花期(9月15日)采樣，每個小區(qū)每次取1株甜菊幼苗，將樣品帶回實驗室處理后用于各項指標的測定。

1.3 方法

1.3.1 甜菊干質量測定 用蒸餾水將甜菊植株沖洗干凈，然后將葉片、莖和花分離，分別放置在105 ℃烘箱中殺青30 min后再置于70 ℃烘箱中烘干至恒質量。使用JJ1000型百分之一電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠)稱量并記錄，然后用研缽將樣品均勻研磨，置于自封袋中，于干燥處儲存，待測。

1.3.2 全氮、全碳和可溶性糖含量的測定 參照鮑士旦[15]的方法，采用H2SO4-H2O2高溫消解并使用凱氏定氮法測定全氮含量;根據(jù)公式“氮素累積量=各器官干質量×相應器官全氮含量”和“氮素分配比例=(各器官氮素累積量/所有器官氮素累積量之和)×100%”分別計算甜菊各器官的氮素累積量和氮素分配比例；參照Shaw[16]的方法，采用重鉻酸鉀-濃硫酸外加熱并通過滴定法測定全碳含量；根據(jù)公式“碳氮比=各器官全碳含量/相應器官全氮含量”計算甜菊各器官的碳氮比；采用蒽酮比色法[17]測定可溶性糖含量。

1.3.3 葉片甜菊糖苷的提取及測定 參照文獻[18]的方法，提取和測定甜菊葉片中甜菊糖苷含量，計算總甜菊糖苷含量和單株總甜菊糖苷累積量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用EXCEL 2010軟件處理實驗數(shù)據(jù)，利用SPSS 16.0軟件進行方差分析，并采用Duncan’s多重比較法進行顯著性分析，利用SPSS 16.0軟件進行Pearson相關性分析。

2 結果和分析

2.1 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊干質量的影響

施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官干質量的影響見表1。由表1可以看出：與不施氮處理相比，施氮處理中，現(xiàn)蕾期甜菊莖、葉片和地上部干質量顯著增加，分別增加了149.23%、126.24%和141.15%；開花期甜菊莖、葉片、花和地上部干質量總體上顯著增加，分別增加了39.44%、64.18%、57.27%和48.65%。同一施氮水平下，開花期甜菊莖、葉片和地上部干質量明顯高于現(xiàn)蕾期。方差分析結果顯示：施氮水平和生育期對甜菊不同器官干質量有顯著或極顯著影響，但二者的交互作用對甜菊不同器官干質量均無顯著影響。

表1 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官干質量的影響

2.2 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊全氮含量以及氮素累積量和分配比例的影響

2.2.1 對全氮含量的影響 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官全氮含量的影響見表2。由表2可以看出：開花期甜菊花中全氮含量最高，現(xiàn)蕾期和開花期甜菊葉片中全氮含量均明顯高于莖。與不施氮處理相比，施氮處理中，現(xiàn)蕾期甜菊莖和葉片中全氮含量分別升高了27.81%和28.25%，開花期甜菊莖、葉片和花中全氮含量分別升高了27.77%、19.28%和18.61%，其中，現(xiàn)蕾期和開花期施氮處理甜菊葉片中全氮含量顯著高于不施氮處理。同一施氮水平下，甜菊莖和葉片中全氮含量在不同生育期間無顯著差異。方差分析結果顯示：施氮水平對甜菊莖和葉片中全氮含量有顯著或極顯著影響，對花中全氮含量無顯著影響；生育期對甜菊莖中全氮含量有顯著影響，但是對葉片中全氮含量無顯著影響；施氮水平與生育期的交互作用對甜菊莖和葉片中全氮含量均無顯著影響。

表2 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官中全氮含量的影響

2.2.2 對氮素累積量和分配比例的影響 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官中氮素累積量和分配比例的影響見表3。由表3可以看出：與不施氮處理相比，現(xiàn)蕾期和開花期施氮處理甜菊同一器官中氮素累積量均顯著升高，其中，現(xiàn)蕾期甜菊莖、葉片和地上部中氮素累積量分別升高了216.41%、186.69%和198.61%，開花期甜菊莖、葉片、花和地上部中氮素累積量分別升高了82.04%、107.33%、92.96%和94.61%。不施氮處理中，與現(xiàn)蕾期相比，開花期甜菊莖和地上部中氮素累積量顯著升高，而葉片中氮素累積量無顯著變化；施氮處理中，與現(xiàn)蕾期相比，開花期甜菊莖和葉片中氮素累積量無顯著變化，而地上部中氮素累積量顯著升高。方差分析結果顯示：施氮水平和生育期對甜菊不同器官中氮素累積量有顯著或極顯著影響，但二者的交互作用對甜菊不同器官中氮素累積量均無顯著影響。

由表3還可以看出：現(xiàn)蕾期甜菊氮素主要分配在葉片中；開花期甜菊葉片中氮素分配比例最大，莖中氮素分配比例次之，花中氮素分配比例最小。同一施氮水平下，與現(xiàn)蕾期相比，開花期甜菊葉片中氮素分配比例顯著降低，莖中氮素分配比例也有所降低，但無顯著變化。方差分析結果顯示：僅生育期對甜菊葉片中氮素分配比例有極顯著影響，施氮水平以及施氮水平與生育期的交互作用對甜菊莖和葉片中氮素分配比例均無顯著影響。

表3 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官中氮素累積量和分配比例的影響

2.3 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊全碳含量、碳氮比及可溶性糖含量的影響

施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官中全碳含量、碳氮比及可溶性糖含量的影響見表4。由表4可以看出：同一生育期施氮與不施氮處理間及同一施氮水平現(xiàn)蕾期與開花期間甜菊各器官中的全碳含量均無顯著變化。方差分析結果表明：施氮水平和生育期及二者的交互作用對甜菊不同器官中全碳含量均無顯著影響。

由表4還可以看出：與不施氮處理相比，施氮處理中，現(xiàn)蕾期甜菊莖和葉片中碳氮比分別降低了20.07%和23.11%，開花期甜菊莖、葉片和花中碳氮比分別降低了22.91%、18.61%和16.00%，其中，現(xiàn)蕾期和開花期施氮處理甜菊葉片中碳氮比顯著低于不施氮處理。方差分析結果顯示：施氮水平對甜菊莖和葉片中碳氮比有顯著或極顯著影響，但對花中碳氮比無顯著影響；生育期對甜菊莖中碳氮比有顯著影響，但對葉片中碳氮比無顯著影響；施氮水平與生育期的交互作用對甜菊莖和葉片中碳氮比均無顯著影響。

由表4還可以看出：與不施氮處理相比，施氮處理中，現(xiàn)蕾期甜菊莖中可溶性糖含量顯著升高，開花期甜菊莖和花中可溶性糖含量有所升高，但無顯著變化；現(xiàn)蕾期和開花期甜菊葉片中可溶性糖含量分別降低了8.15%和16.40%。不施氮處理中，與現(xiàn)蕾期相比，開花期甜菊莖中可溶性糖含量顯著升高，而葉片中可溶性糖含量顯著降低；施氮處理中，與現(xiàn)蕾期相比，開花期甜菊莖中可溶性糖含量無顯著變化，葉片中可溶性糖含量顯著降低。方差分析結果表明：施氮水平和生育期對甜菊莖和葉片中可溶糖含量均有顯著或極顯著影響，但是施氮水平與生育期的交互作用對甜菊莖和葉片中可溶性糖含量無顯著影響。

2.4 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊葉片甜菊糖苷含量及累積量的影響

施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊葉片甜菊糖苷含量及累積量的影響見表5。由表5可以看出：與不施氮處理相比，施氮處理中，現(xiàn)蕾期甜菊葉片中甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C和總甜菊糖苷含量顯著降低，分別降低了15.82%、59.56%、51.32%和46.56%；開花期甜菊葉片中甜菊苷、萊鮑迪苷C和總甜菊糖苷含量顯著降低，分別降低了31.31%、44.12%和25.64%，萊鮑迪苷A含量無顯著變化。與現(xiàn)蕾期相比，不施氮處理中開花期甜菊葉片中萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C和總甜菊糖苷含量顯著降低，甜菊苷含量無顯著變化；施氮處理中開花期甜菊葉片中甜菊苷和萊鮑迪苷C含量顯著降低，萊鮑迪苷A和總甜菊糖苷含量無顯著變化。方差分析結果表明：施氮水平和生育期對甜菊葉片中各甜菊糖苷含量均有極顯著影響，施氮水平與生育期的交互作用對萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷C和總甜菊糖苷含量有顯著或極顯著影響，對甜菊苷含量的影響不顯著。

表4 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊不同器官中全碳含量、碳氮比及可溶性糖含量的影響

表5 施氮對現(xiàn)蕾期和開花期甜菊葉片中甜菊糖苷含量及累積量的影響

由表5還可以看出：在同一生育期，與不施氮處理相比，施氮處理甜菊單株總甜菊糖苷累積量有所升高，但差異未達到顯著水平。方差分析結果表明：施氮水平和生育期及二者的交互作用對甜菊單株總甜菊糖苷累積量無顯著影響。

2.5 甜菊葉片中總甜菊糖苷含量及其他因子間的相關性分析

甜菊葉片中總甜菊糖苷含量及其他因子間的Pearson相關系數(shù)見表6。由表6可以看出：甜菊葉片中總甜菊糖苷含量與全氮含量和干質量間分別呈顯著和極顯著負相關關系，與碳氮比和可溶性糖含量間分別呈顯著和極顯著正相關關系，與全碳含量無顯著相關關系。此外，甜菊葉片干質量與全氮含量間呈極顯著正相關關系，但是與碳氮比和可溶性糖含量分別呈極顯著和顯著負相關關系。

表6 甜菊葉片中總甜菊糖苷含量及其他因子間的Pearson相關系數(shù)1)

3 討論和結論

作為氨基酸、酶以及核酸等物質的重要組成成分，氮素是植物生長和代謝過程中必需的大量營養(yǎng)元素，并在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著不可或缺的作用。研究結果表明：氮素缺失會導致植物氮代謝過程受到抑制、葉片光合速率下降、葉綠素降解以及發(fā)育遲緩等問題，進而限制作物產(chǎn)量[19,20]。本研究中，與不施氮相比，增施氮肥總體上顯著提高甜菊的氮素吸收累積并促進干質量形成。此外，與現(xiàn)蕾期相比，施氮對開花期甜菊葉片全氮含量無顯著影響但是導致葉片中氮素分配比例顯著降低，這主要是由于花器官發(fā)育導致植物源庫關系發(fā)生變化。

植物代謝進程及作物品質形成受到氮素的調(diào)控。研究結果表明：增加氮素供應通常會促進植物體內(nèi)氨基酸、蛋白質以及含氮生物堿的生物合成，但是對植物體內(nèi)碳基次級代謝產(chǎn)物如酚類和萜類化合物合成產(chǎn)生負面影響[21-24]。甜菊糖苷是決定甜菊品質和經(jīng)濟價值的一類萜類化合物。本研究結果顯示：與不施氮相比，施氮會抑制現(xiàn)蕾期和開花期甜菊葉片中不同甜菊糖苷組分的含量。礦質營養(yǎng)對碳基次級代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控與植物“生長-分化權衡”以及生物量引起的“稀釋效應”有關[21,25]。這2種機制在氮營養(yǎng)背景下并不沖突，即在氮充足條件下，植物優(yōu)先促進生長和生物量形成，因而導致了對碳基次級代謝過程的抑制或相對“稀釋”。本研究中，施氮對甜菊葉片全氮含量和碳氮比的影響顯著高于莖，表明葉片碳氮代謝對土壤氮素水平變化的敏感性[21]，同時也強調(diào)了氮肥管理在以葉片為主要收獲器官的甜菊生產(chǎn)中的重要性。本研究發(fā)現(xiàn)，甜菊葉片可溶性糖含量和總甜菊糖苷含量均受到施氮處理的負調(diào)控且葉片可溶性糖含量與總甜菊糖苷含量之間存在極顯著正相關關系。高氮供應對植物可溶性糖含量及碳基次級代謝產(chǎn)物的協(xié)同負調(diào)控作用也在卡琪花蒂瑪(LabisiapumilaBenth.)[26]和杭白菊(Chrysanthemum×morifoliumRamat.)[27]的相關研究中得到印證。上述結果表明：可溶性糖作為碳基次級代謝產(chǎn)物合成底物，在甜菊糖苷對氮素響應中發(fā)揮決定性作用[28,29]。

生育期是影響植物生長發(fā)育和生理代謝的關鍵因子。已有研究結果表明：從苗期到現(xiàn)蕾期，甜菊葉片中甜菊糖苷含量隨營養(yǎng)生長進程逐漸增加，但是在甜菊開花后出現(xiàn)不同程度的下降[30,31]。Yang等[32]通過室內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)，與現(xiàn)蕾期相比，開花后甜菊葉片中甜菊糖苷含量及甜菊糖苷合成相關基因的表達水平顯著降低。本研究中，在施氮和不施氮處理中，開花期甜菊葉片不同甜菊糖苷組分含量均較現(xiàn)蕾期出現(xiàn)不同程度的降低，再次表明現(xiàn)蕾期是甜菊葉片收獲的最佳時期。生育期還極顯著影響甜菊葉片氮素分配比例和可溶性糖含量，這表明甜菊開花后源庫關系發(fā)生變化，甜菊向花器官轉移營養(yǎng)物質以促進花器官發(fā)育[33]，這會導致葉片可溶性糖含量的降低并抑制甜菊糖苷合成。此外，氮素也可以通過調(diào)控源庫關系影響開花期甜菊碳代謝。研究表明：增施氮肥會通過增加生殖器官(如花和果實)的大小促進庫容，并促進光合碳同化產(chǎn)物(可溶性糖)從營養(yǎng)器官向生殖器官轉運[34]。因此，甜菊開花期較高的葉片氮素水平會促進碳氮物質向花器官轉運，并對葉片可溶性糖及甜菊糖苷含量產(chǎn)生進一步的負面影響。

環(huán)境條件導致的生物量變化會“權衡”作物品質，并對作物產(chǎn)量及品質綜合調(diào)控有重要影響。例如：在大氣CO2濃度升高或土壤水分含量降低等環(huán)境條件下，小麥(TriticumaestivumLinn.)和牧草的產(chǎn)量和品質之間也存在“權衡”關系[35,36]。甜菊葉片中總甜菊糖苷累積量并未受到施氮水平和生育期的顯著影響，這是葉片干質量增加及甜菊糖苷含量降低的“權衡”結果。

綜上所述，施氮水平和生育期均會影響甜菊生長和葉片甜菊糖苷含量。與現(xiàn)蕾期相比，開花期甜菊葉片中可溶性糖和甜菊糖苷含量均顯著降低，增施氮肥會促進可溶性糖向花器官轉運并進一步加劇花后甜菊葉片中甜菊糖苷含量的降低。因此，在甜菊實際生產(chǎn)過程中，應在甜菊現(xiàn)蕾期及時采收葉片，同時減少甜菊生育后期的氮肥投入以減少葉片可溶性糖向花器官轉運。