張振興，吉濤，董正勖，胡騎，王斌，宋建領*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南 昆明 650224；2.云南省種羊繁育推廣中心，云南 昆明 655204； 3.威信縣動物疫病預防控制中心，云南 威信 657900)

禽白血病(Avian Leukosis，AL)是由禽白血病病毒( Avian Leukosis Virus， ALV)引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱[1]，其主要特征為脾臟、肝臟異常腫大，7周齡以上患病雞中易產(chǎn)生淋巴樣腫瘤等，造成雞群體重降低，產(chǎn)蛋量減少，嚴重者引起患病雞整體免疫能力下降，產(chǎn)生免疫抑制反應，從而繼發(fā)其他病毒或細菌混合感染等，給肉雞、蛋雞的養(yǎng)殖管理帶來了巨大的困難和挑戰(zhàn)[2]。ALV屬于反轉錄病毒科α 腫瘤病毒屬，依據(jù)ALV囊膜糖蛋白抗原的不同以及與宿主特異性相關的 gp85 蛋白抗原性的不同，又將ALV分為 A—K 11個亞群[3]，其中A、B、C、D、J、K等六個亞群為外源性ALV，其他亞群為內(nèi)源性ALV。外源性ALV對雞群具有較高的致病性，而內(nèi)源性ALV因主要以前病毒的形式存在，對雞群的致病性較低。20世紀80年代末由英國學者首次從感染肉雞中分離得到一株J亞群ALV(ALV-J)，我國于1999年由杜巖等分離得到第一株 ALV-J[4-6]，隨后幾年間，山東、河南、四川等地也陸續(xù)出現(xiàn)確診為ALV-J感染的報道。本實驗確診了云南省石林縣某土雜雞養(yǎng)殖場雞腫瘤疫病發(fā)病原因主要為ALV-J感染所致，同時對該病原gp85基因進行了遺傳進化分析，為該場雞白血病的防控提供了科學依據(jù)。

1 患病雞場概況

2020年2月，云南省石林縣某土雜雞場出現(xiàn)大量食欲不振、體重嚴重下降的雞只，且主要發(fā)生于7～16周齡。通過解剖發(fā)現(xiàn)，肝臟、脾臟異常腫大，并在肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊中發(fā)現(xiàn)淋巴瘤等。

2 材料與方法

2.1 病料的采集和處理

采集5只不同雞舍患病雞脾臟、肝臟、法氏囊等組織病料，于無菌超凈臺進行混合剪碎研磨，按照體積比1∶10的比例加入PBS，反復凍融3次后，用離心機3000r/min進行離心10min，取上清液提取核酸。檢測所需陽性對照均為本實驗室已經(jīng)測序后的陽性樣品。

2.2 核酸提取

按照RNA/DNA核酸提取試劑盒說明書，分別提取上清液中的核酸。

2.3 主要試劑

TaKaRa DNA核酸提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、PCR試劑盒、DL-2000Marker等， 均購自寶生物工程(大連)有限公司。

2.4 主要儀器

超凈工作臺(型號為LA2-4A1)，購自ESCO公司;PCR儀(型號為9700)，購自美國ABI(Applied Biosystems Inc)公司；凝膠成像系統(tǒng)(型號為2000)，購自美國伯樂BIO-RAD公司。

2.5 病原核酸檢測

根據(jù)國內(nèi)外已發(fā)表的ALV基因序列、雞傳染性貧血病病毒(CAV)基因序列、雞馬立克氏病病毒(MDV)基因序列、禽腺病毒(FAdV)基因序列、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒(REV)基因序列及參照參考文獻[7-9]，分別設計引物ALV-F/ALV-R、CAV-F/CAV-R、MDV-F/MDV-R、FAdV-F/FAdV-R、REV-F/REV-R,引物信息見表1，引物由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

表1 引物序列信息

2.6 gp85基因擴增和序列分析

選擇雞群中有ALV感染的典型臨床癥狀和剖檢變化且經(jīng)過RT-PCR檢測ALV核酸呈陽性的樣品，進行膠回收?；厥蘸蟮腄NA送往云南省昆明市生工生物工程有限公司進行測序。通過DNAStar MegAlign軟件對測序結果進行gp85基因序列比對和遺傳進化分析。

3 結果與分析

3.1 病原核酸檢測

經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測反應結果顯示，所獲得的目的條帶中在約545bp 處有一條帶與ALV預期條帶相符且與陽性對照組處于同一長度位置，陰性對照組無相應條帶，進一步驗證該土雜雞場發(fā)病原因為感染ALV(圖1)。CAV、MDV、FAdV、REV核酸檢測均為陰性(圖2—圖5)。

M：DNA相對標準分子量；1:陽性對照；

M：DNA相對標準分子量；1:陽性對照；

M：DNA相對標準分子量；1:陽性對照；

M：DNA相對標準分子量； 1:陽性對照；

M：DNA相對標準分子量；1:陽性對照；

3.2 gp85基因序列分析

PCR產(chǎn)物測序后，從 GenBank上下載有關ALV的相關序列作為參考毒株(見表2)，并通過DNAStar軟件對核苷酸序列同源性進行比對發(fā)現(xiàn)(見表3)，云南省石林縣某土雜雞場ALV陽性樣品2020SL與ALV-J的gp85核苷酸序列同源性較高，同源性在75%～94.2%，其中與2010年國內(nèi)分離得到的ALV-J亞群毒株KC711043-J同源性最高，為94.2%；與埃及ALV-J亞群毒株DQ316908-J同源性最低，為75%；與其他ALV-J亞群毒株同源性在90.1%～92.7%；與A亞群代表毒株MF926337-A的同源性為48.9%；與B亞群代表毒株JF826241-B同源性為49.6%；與C亞群代表毒株KY5490695-C同源性為49.6%；與D亞群代表毒株KY490696-D同源性為49.5%；與E亞群代表毒株KC610517-E同源性為49.2%。遺傳進化分析結果顯示(圖6)，云南省石林縣某土雜雞場ALV陽性樣品2020SL與其他8株ALV-J亞群毒株均在GroupⅠ分支上，而ALV A—E亞群毒株在另一分支GroupⅡ上。綜合上述結果表明，云南省石林縣某土雜雞場ALV陽性樣品2020SL屬于ALV-J亞群，且該雞場感染的ALV毒株gp85基因變異較小。

表2 參考毒株信息

表3 ALV gp85基因核苷酸同源性分析

圖6 ALV gp85基因遺傳進化分析

4 討論

禽白血病、馬立克氏病、雞傳染性貧血、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生等免疫抑制病的共同特征是侵害機體的免疫器官,導致機體免疫力下降,感染雞群后一般不表現(xiàn)臨床癥狀, 通常是亞臨床感染或混合感染,后期引起內(nèi)臟器官腫大或形成腫瘤， 給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[7]。另外禽腺病毒4型、巴氏桿菌、弧菌性肝炎等也可以引起家禽內(nèi)臟器官腫大，因此，引起家禽腫瘤性疫病或內(nèi)臟腫大的病因很難通過臨床剖檢確診。為了針對性采取防控措施，必須通過實驗室檢測技術，找到發(fā)病原因，才能獲得比較理想的防控效果。本研究通過RT-PCR檢測結合基因序列分析，發(fā)現(xiàn)云南省石林縣某土雜雞場的主要病因是感染了ALV，為該場的疫病防控提供了科學依據(jù)。

ALV-J亞群囊膜糖蛋白的gp85 基因與其他亞群ALV 相比, 缺少93-126 堿基對, 與其他A—E 亞群ALV 的gp85 基因只有40%同源性,因此, gp85 囊膜糖蛋白是ALV-J 的亞群表型決定因素[10]。本研究通過比對Genbank收錄的ALV gp85基因分析結果發(fā)現(xiàn)，云南ALV gp85基因與ALV-J亞群毒株的gp85基因同源性為75%～94.2%，與其他亞群gp85基因同源性僅為48.9%～49.6%；與2010年國內(nèi)分離得到的ALV-J亞群毒株KC711043-J同源性最高，為94.2%，與埃及J亞群毒株DQ316908-J同源性最低，為75%。證明此次陽性樣品屬于ALV-J亞群感染，也預示著近幾年J亞群ALV一直處于緩慢地變化之中[11，12]。因此推斷，可以利用ALV囊膜糖蛋白基因gp85作為參考，對ALV的分子流行病學特點及遺傳進化做更深一步的探究[13]。

禽白血病可通過垂直傳播和水平傳播引起成年肉雞、蛋雞和地方品種雞[14，15]發(fā)病，目前缺乏有效的疫苗和藥物，只有通過種群的凈化和生物安全措施才能做到有效防控[16-18]?！吨腥A人民共和國動物防疫法》(修訂版)、“十四五”全國畜牧獸醫(yī)行業(yè)發(fā)展規(guī)劃等都強調(diào)加強種畜禽疫病凈化工作，因此，在加快畜禽種業(yè)自主創(chuàng)新的同時，做好種雞群的白血病凈化工作，為養(yǎng)殖場提供優(yōu)質(zhì)的雞苗，是防控禽白血病垂直傳播的重要舉措。外源性ALV污染弱毒疫苗是雞群中ALV水平傳播的最可能因素之一[19-21]，建議養(yǎng)雞場購買信用度高的正規(guī)疫苗生產(chǎn)廠家的疫苗進行免疫，切斷因疫苗免疫造成該病水平傳播的途徑，保障雞群健康。