郭慶奪 楊秋影 馬美娜 于紅 王旭鵬 吳春玲 李睿 何慶

滄州市中心醫(yī)院1麻醉科，2供應(yīng)室（河北滄州 061000）

腦出血是臨床常見的急性腦血管病，病情危重、救治難度大、致殘率及病死率高。腦部血管破裂、血液進入腦實質(zhì)形成血腫是腦出血的病理生理特征，造成神經(jīng)損害的因素包括血腫壓迫腦實質(zhì)、顱內(nèi)壓升高等直接損傷因素以及血腫周圍炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、氧化應(yīng)激激活等繼發(fā)損傷因素［1-2］。右美托咪定（Dexmeditomidine，Dex）是一類具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用的α2 腎上腺素能受體激動劑，在全身麻醉手術(shù)中使用Dex 具有臟器保護作用。葉枝秀［3］的臨床研究證實血腫清除術(shù)的圍手術(shù)期應(yīng)用Dex，顯著改善高血壓腦出血患者的神經(jīng)功能，并抑制多種炎癥細胞因子的釋放，提示Dex可能可以用于腦出血的治療。另有基礎(chǔ)研究證實Dex 通過抑制蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路發(fā)揮生物學(xué)作用；腦出血的相關(guān)基礎(chǔ)研究證實腦出血大鼠血腫周圍腦組織中JAK2/STAT3 通路顯著激活且使用JAK2 抑制劑顯著減輕腦出血大鼠的神經(jīng)損害［6-7］。本研究將通在膠原酶誘導(dǎo)腦出血大鼠模型中研究Dex 對神經(jīng)功能及JAK2/STAT3 的影響，旨在為今后深入認識Dex 在腦出血中的治療價值及機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級雄性大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，8 ～10 周齡（上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)有限公司，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2017-0012）。本研究經(jīng)我院動物倫理委員會批準，批準號：AE20211015。

1.2 藥品與試劑 右美托咪定（江蘇恩華藥業(yè)有限公司），VII 型膠原酶（美國Sigma 公司），陰性對照（NC）及JAK2 的慢病毒注射液（滴度109TU/mL，上海漢恒生物科技公司），HE 染色試劑盒（武漢博士德公司），TUNEL 試劑盒（上海碧云天公司），核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X Protein，Bax）、裂解型caspase-3（Cleaved caspase-3）及β-actin 單克隆一抗（美 國Abcam 公司），JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3（美國CST 公司）。

1.3 儀器 全自動腦立體定位儀（71000 型，深圳瑞沃德生命科技公司），顯微鏡（TE2000S 型，日本Nikon 公司），凝膠電泳槽及電泳儀（Power Pac 型，美國Bio-rad 公司），凝膠成像系統(tǒng)（Tanon5200 型，上海天能公司）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及干預(yù) 第一部分動物實驗研究Dex 對腦出血大鼠神經(jīng)功能的調(diào)控作用，分組方法如下：分為假手術(shù)組、腦出血組、Dex 組，每組各8 例。腦出血組和Dex 組采用膠原酶誘導(dǎo)腦出血模型：用生理鹽水配置濃度0.2 U/μL 的膠原酶溶液，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀，暴露前囟并設(shè)置為原點，前0.1 mm、右側(cè)3.5 mm 鉆孔，將微量注射器固定在立體定位儀上并通過鉆孔緩慢進入6.0 mm、到達右側(cè)紋狀體區(qū)域，注入1 μL 預(yù)先配置好的膠原酶溶液，取出注射器、骨蠟封閉鉆孔。假手術(shù)組按照相同的方法進行麻醉、鉆孔、進針，但不注射膠原酶。造模當天開始進行給藥，Dex 組給予20 μg/kg Dex 腹腔注射、1 次/d、連續(xù)7 d；假手術(shù)組和腦出血組給予等劑量生理鹽水腹腔注射、1 次/d、連續(xù)7 d。

第二部分動物實驗研究JAK2/STAT3 通路在Dex 改善腦出血大鼠神經(jīng)功能中的作用，分組方法如下：分為NC 慢病毒+假手術(shù)組、NC 慢病毒+腦出血組、NC 慢病毒+Dex 組、JAK2 慢病毒+Dex 組，每組各8 例。首先進行慢病毒的側(cè)腦室注射，方法如下：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，俯臥位固定于腦立體定位儀，暴露前囟并設(shè)置為原點，后1.5 mm、右側(cè)1.0 mm 鉆孔，將微量注射器固定在立體定位儀上并通過鉆孔緩慢進入3.2 mm、到達右側(cè)側(cè)腦室，注入NC 或JAK2 慢病毒注射液10 μL，取出注射器、骨蠟封閉鉆孔。14 d 后按照第一部分動物實驗的方法進行腦出血造模及造模后Dex給藥，連續(xù)7 d。

1.4.2 神經(jīng)功能缺損評分（neurological severity scores，NSS）的評價 造模后6、24、48、72 h 及7 d時，參照GARCIA［8］制定的NSS 評分標準從運動、感覺、平衡、反射、運動、行走進行評價，18 分為正常，得分越低、神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.4.3 血腫周圍腦組織病理改變的檢測 完成NSS 評價后采用頸椎脫臼法處死大鼠，解剖得到血腫周圍腦組織，取適量組織用4%多聚甲醛固定后制作病理切片，按照試劑盒說明書進行HE 染色，蘇木素復(fù)染后封片，在顯微鏡下觀察病理改變。

1.4.4 血腫周圍腦組織中細胞因子含量的檢測 取血腫周圍腦組織約15 ～20 mg，加入組織裂解液后勻漿，4 ℃、12 000 g離心10 min，分離上清采用BCA法檢測蛋白濃度，采用ELISA 法檢測細胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）濃度，以細胞因子濃度與蛋白濃度的比值反映每毫克蛋白中細胞因子的含量。

1.4.5 血腫周圍腦組織中細胞凋亡率的檢測 取血腫周圍腦組織的病理切片，按照試劑盒說明書進行TUNEL 染色，DAPI 復(fù)染后封片，在顯微鏡下觀察陽性染色情況，TUNEL 陽性為凋亡細胞、DAPI 為總細胞，對細胞進行計數(shù)并計算細胞凋亡率。

1.4.6 血腫周圍腦組織中蛋白表達的檢測 取血腫周圍腦組織裂解后的勻漿液，4 ℃、12 000 g 離心10 min，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度后將含有30 μg 蛋白的裂解液與上樣緩沖液混合，煮沸變性后在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳、分離不同分子量的蛋白后進行電轉(zhuǎn)膜，將聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，依次進行5%脫脂牛奶封閉、特異性一抗孵育、HRP 二抗孵育，最后在凝膠成像系統(tǒng)中用ECL 法顯影，得到NF-κB、Bax、Cleaved caspase-3、JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3 及β-actin 的條帶及對應(yīng)的灰度值，計 算NF-κB/β-actin、Bax/β-actin、Cleaved caspase-3/β-actin、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3 灰度值的比值。

1.4.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件錄入數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料、以均數(shù)±標準差表示，3 組及4 組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Dex對腦出血大鼠造模后不同時間點NSS評分的影響 造模后6、24、48、72 h 及7 d 時，假手術(shù)組大鼠的NSS評分無明顯變化（F=0.004，P=0.999），腦出血組和Dex 組大鼠的NSS 評分均呈現(xiàn)先下降、后升高的趨勢且造模后48 h 時的NSS 評分最低。三組間造模后各個時間點的NSS 評分比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=92.137，P＜0.001）且腦出血組大鼠的NSS評分均低于假手術(shù)組、Dex組大鼠的NSS評分均高于腦出血組（F= 176.549，P＜0.001，F(xiàn)=50.293，P＜0.001）。

圖1 三組大鼠造模后不同時間點NSS 評分的比較Fig.1 Comparison of NSS scores among three groups at different time points after modeling

2.2 Dex 對腦出血大鼠造模后7 d 時血腫周圍腦組織病理改變的影響 假手術(shù)組腦組織中細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰；腦出血組血腫周圍腦組織中細胞腫脹變形、排列混亂、出現(xiàn)多個出血壞死灶；Dex組血腫周圍腦組織的病理改變較腦出血組減輕。

圖2 三組大鼠血腫周圍腦組織病理改變的比較Fig.2 Comparison of pathological changes of brain tissue around hematoma among three groups of rats

2.3 Dex 對腦出血大鼠造模后7 d 時血腫周圍腦組織炎癥反應(yīng)的影響 腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中NF-κB 的表達水平及TNF-α、IL-6 的含量均高于假手術(shù)組（t= 29.585，P＜0.001；t= 8.870，P＜0.001；t= 15.771，P＜0.001）；Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中NF-κB 的表達水平及TNF-α、IL-6 的含量均低于腦出血組（t= 19.212，P＜0.001；t= 3.579，P=0.009；t=9.680，P＜0.001）。

2.4 Dex 對腦出血大鼠造模后7 d 時血腫周圍腦組織細胞凋亡的影響 腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達水平均高于假手術(shù)組（t= 17.146，P＜0.001；t=11.855，P＜0.001；t=7.112，P＜0.001）；Dex組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達水平均低于腦出血組（t= 11.573，P＜0.001；t=5.699，P=0.001；t=8.338，P＜0.001）。

2.5 Dex 對腦出血大鼠造模后7 d 時血腫周圍腦組織JAK2/STAT3 通路的影響 腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中p-JAK2、p-STAT3 的表達水平均高于假手術(shù)組（t= 17.852，P＜0.001；t= 10.575，P＜0.001）；Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中p-JAK2、p-STAT3 的表達水平均低于腦出血組（t= 14.632，P＜0.001；t=10.580，P＜0.001）。

圖3 三組大鼠血腫周圍腦組織中炎癥反應(yīng)程度的比較Fig.3 Comparison of inflammatory degree in brain tissue around hematoma among three groups of rats

圖4 三組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡的比較Fig.4 Comparison of apoptosis in brain tissue around hematoma among three groups of rats

2.6 局部注射JAK2 慢病毒對血腫周圍腦組織JAK2/STAT3 通路的影響 NC 慢病毒+腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中p-JAK2、p-STAT3 的表達水平均高于NC 慢病毒+假手術(shù)組（t= 14.650，P＜0.001；t= 12.769，P＜0.001）；NC 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中p-JAK2、p-STAT3 的表達水平均低于NC 慢病毒+腦出血組（t= 16.552，P＜0.001；t= 13.622，P＜0.001）；JAK2 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中p-JAK2、p-STAT3 的表達水平均高于NC 慢病毒+Dex 組（t= 18.067，P＜0.001；t=18.137，P＜0.001）。

圖5 三組大鼠血腫周圍腦組織中JAK2/STAT3 通路的比較Fig.5 Comparison of JAK2/STAT3 pathway in brain tissue around hematoma among three groups of rats

圖6 四組大鼠血腫周圍腦組織中JAK2/STAT3 通路的比較Fig.6 Comparison of JAK2/STAT3 pathway in brain tissue around hematoma in four groups

2.7 過表達JAK2 對Dex 改善腦出血大鼠NSS 評分的影響 造模后6、24、48、72 h 及7 d 時，NC 慢病毒+假手術(shù)組大鼠的NSS 評分無明顯變化（F=0.201，P= 0.936），其余三組大鼠的NSS 評分均呈現(xiàn)先下降、后升高的趨勢且造模后48 h 時的NSS評分最低。四組間造模后各個時間點的NSS 評分比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 0.201，P＜0.001）且NC 慢病毒+腦出血組大鼠的NSS 評分均低于NC 慢病毒+假手術(shù)組、NC 慢病毒+Dex 組大鼠的NSS 評分均高于NC 慢病毒+腦出血組、JAK2 慢病毒+Dex 組大鼠的NSS 評分均低于NC 慢病毒+Dex組（F= 138.250，P＜0.001；F= 30.388，P＜0.001；F=10.241，P＜0.001）。

圖7 四組大鼠造模后不同時間點NSS 評分的比較Fig.7 Comparison of NSS scores among four groups at different time points after modeling

2.8 過表達JAK2 對Dex 改善腦出血大鼠血腫周圍腦組織病理改變的影響 NC 慢病毒+假手術(shù)組腦組織中細胞排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰；NC 慢病毒+腦出血組血腫周圍腦組織中細胞腫脹變形、排列混亂、出現(xiàn)多個出血壞死灶；NC 慢病毒+Dex 組血腫周圍腦組織的病理改變較NC 慢病毒+腦出血組減輕；JAK2 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織的病理改變較NC 慢病毒+Dex 組加重。

2.9 過表達JAK2對Dex改善腦出血大鼠血腫周圍腦組織炎癥反應(yīng)的影響 NC 慢病毒+腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中NF-κB 的表達水平及TNF-α、IL-6的含量均高于NC慢病毒+假手術(shù)組（t=8.868，P＜0.001；t=16.795，P＜0.001；t=13.967，P＜0.001）；NC 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中NF-κB的表達水平及TNF-α、IL-6 的含量均低于NC 慢病毒+腦出血組（t= 4.993，P＜0.001；t= 7.670，P＜0.001；t=7.256，P＜0.001）；JAK2 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中NF-κB 的表達水平及TNFα、IL-6 的含量均高于NC 慢病毒+Dex 組（t=5.571，P＜0.001；t=7.448，P=0.001；t=4.584，P=0.003）。

圖8 四組大鼠血腫周圍腦組織的病理改變Fig.8 Pathological changes of brain tissue around hematoma in four groups of rats

圖9 四組大鼠血腫周圍腦組織中炎癥反應(yīng)程度的比較Fig.9 Comparison of inflammatory degree in brain tissue around hematoma among four groups of rats

圖10 四組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡的比較Fig.10 Comparison of apoptosis in brain tissue around hematoma among four groups of rats

2.10 過表達JAK2 對Dex 改善腦出血大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡的影響 NC 慢病毒+腦出血組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達水平均高于NC 慢病毒+假手術(shù)組（t=21.224，P＜0.001；t=10.160，P＜0.001；t=8.455，P＜0.001；）；NC 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3的表達水平均低于NC慢病毒+腦出血組（t=15.281，P＜0.001；t=3.469，P＜0.010；t=8.498，P＜0.001）；JAK2 慢病毒+Dex 組大鼠血腫周圍腦組織中細胞凋亡率及Bax、Cleaved caspase-3 的表達水平均高于NC 慢病毒+Dex 組（t= 15.102，P＜0.001；t= 7.696，P＜0.001；t=7.978，P＜0.001）。

3 討論

腦出血發(fā)病后血腫周圍腦組織中炎癥反應(yīng)、細胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)環(huán)節(jié)的異常激活是造成神經(jīng)功能損害的繼發(fā)損傷因素［9-10］，針對繼發(fā)損傷因素進行干預(yù)和治療對改善腦出血預(yù)后、降低死亡率具有重要意義。Dex 是一種具有抗炎、抗凋亡作用的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物，臨床上主要用于全麻手術(shù)的誘導(dǎo)及術(shù)中維持，在體外循環(huán)手術(shù)、顱腦手術(shù)中使用Dex 能夠起到神經(jīng)保護作用［8，11-13］。近些年多項基礎(chǔ)研究［14-16］在腦、心肌、脊髓等缺血再灌注損傷模型中證實Dex 顯著減輕臟器損傷。目前Dex 在腦出血中的應(yīng)用尚缺乏直接證據(jù)，僅國內(nèi)葉枝秀［3］的臨床研究將Dex 用于高血壓腦出血的血腫清除術(shù)，通過圍手術(shù)期使用Dex 顯著改善患者的神經(jīng)功能。

本研究將Dex 用于腦出血的治療，通過膠原酶誘導(dǎo)腦出血大鼠模型后觀察到DSS 評分降低且血腫周圍腦組織出現(xiàn)細胞腫脹變形、排列混亂及出血壞死灶，符合腦出血的病理改變。在腦出血造模后連續(xù)7 d 給予Dex 腹腔注射干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)Dex 干預(yù)的大鼠DSS 評分明顯增加、血腫周圍腦組織中病理改變明顯改善，表明Dex 顯著改善DSS大鼠的神經(jīng)功能及血腫周圍腦組織病理改變，與臨床研究中Dex 改善高血壓腦出血患者血腫清除術(shù)后神經(jīng)功能的結(jié)果吻合，提示Dex 可能在腦出血的治療中起到積極價值。

多項關(guān)于Dex 的研究證實該藥物具有抗炎及抗凋亡效應(yīng)［4-5，14-16］。本研究也從抗炎和抗凋亡的角度深入探究Dex 改善腦出血后神經(jīng)功能的相關(guān)機制。NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和Bax 介導(dǎo)的細胞凋亡與腦出血后神經(jīng)功能發(fā)生繼發(fā)損傷密切相關(guān)，NF-κB 能夠促進TNF-α、IL-6 的釋放并引起炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，Bax 能夠促進細胞色素C 釋放、增加Cleaved caspase-3 表達并激活細胞凋亡［17-19］。本研究在腦出血模型大鼠的血腫周圍腦組織中檢測到細胞凋亡率、NF-κB、Bax、Cleaved caspase-3 表達及TNF-α、IL-6 含量均增加，符合腦出血后炎癥反應(yīng)和細胞凋亡激活的病理特征。經(jīng)Dex 干預(yù)后，腦出血大鼠血腫周圍腦組織中炎癥反應(yīng)和細胞凋亡均受到抑制，表明Dex 改善腦出血后神經(jīng)功能的作用與其抑制炎癥反應(yīng)和細胞凋亡有關(guān)。

腦出血后繼發(fā)損傷因素的發(fā)生涉及復(fù)雜的分子機制及信號通路，其中JAK2/STAT3 通路已經(jīng)被多項研究證實在腦出血后血腫周圍腦組織中表達增加，并且使用該通路的抑制劑顯著改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能［6-7］。本研究也在腦出血模型大鼠的血腫周圍腦組織中檢測到p-JAK2、p-STAT3表達增加，給予Dex 干預(yù)后p-JAK2、p-STAT3 的表達明顯降低。JAK2/STAT3 通路激活的主要效應(yīng)包括通過NF-κB 通路促進炎癥反應(yīng)、通過Bax 促進細胞凋亡，本研究證實Dex 抑制血腫周圍腦組織中JAK2/STAT3 通路的激活，推測這可能是Dex 改善腦出血大鼠神經(jīng)功能的分子機制。為了驗證這一推測，本研究設(shè)計了過表達JAK2 的慢病毒，在腦出血造模前進行JAK2 腺病毒的側(cè)腦室注射、造模后繼續(xù)給予Dex 干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)腺病毒過表達p-JAK2、p-STAT3 后，Dex 用于腦出血大鼠改善神經(jīng)功能、抑制炎癥反應(yīng)及細胞凋亡的作用均明顯削弱，表明JAK2/STAT3 通路在血腫周圍腦組織中參與炎癥反應(yīng)及細胞凋亡的調(diào)控，Dex 改善腦出血大鼠神經(jīng)功能的作用與抑制JAK2/STAT3 通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及細胞凋亡有關(guān)。

綜上所述，本研究的動物實驗結(jié)果表明Dex用于腦出血大鼠的治療能夠改善神經(jīng)功能及血腫周圍腦組織病理改變、抑制血腫周圍腦組織的炎癥反應(yīng)及細胞凋亡，上述治療作用與抑制JAK2/STAT3 通路的激活有關(guān)。上述結(jié)果為深入認識Dex 在腦出血中的治療價值及機制提供了實驗依據(jù)，也為今后研究腦出血后炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等繼發(fā)損傷因素的相關(guān)分子機制提供了思路。