吳田方 戴東 王常元

1黔南州人民醫(yī)院肝膽外科（貴州黔南 558000）；2天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院分子影像及核醫(yī)學(xué)診療科（天津 300000）；3貴州省人民醫(yī)院肝膽外科（貴陽 550000）

肝細(xì)胞癌（HCC）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，是全球腫瘤相關(guān)死亡第四大常見原因［1］，是中國(guó)腫瘤相關(guān)死亡的第二大常見原因［2］。隨著索拉非尼和免疫檢查點(diǎn)抑制劑等新藥的發(fā)展，HCC 患者生存期顯著延長(zhǎng)，但是HCC 患者的5年生存率依然很低［3-4］。因此，迫切需要探索HCC的分子機(jī)制，以確定新的診斷生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

環(huán)狀RNA（circRNA）在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。如：circ-RPPH1 調(diào)節(jié)miR-146b-3p/E2F2 通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［5］；在非小細(xì)胞肺癌中circ-MYBL2 海綿吸附miR-28 進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］；在肝細(xì)胞癌中circRNA-5692 通過海綿吸附miR-328-5p 上調(diào)DAB2IP 表達(dá)抑制肝細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展［7］；circ-FN1通過海綿吸附miR-1205 和調(diào)節(jié)E2F1 的表達(dá)介導(dǎo)肝癌細(xì)胞對(duì)索拉非尼的耐藥［8］。這些研究表明circRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)circ-0008583 在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，通過干擾circ-0008583 表達(dá)，探索其對(duì)HCC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為肝細(xì)胞癌的臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人肝永生化細(xì)胞（THLE-2）購自上海弘順生物科技有限公司；人高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞（MHCC97-H）購自通派（上海）生物科技有限公司；人肝癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞株（HCCLM3）購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；人肝癌細(xì)胞株（Huh-7）購自中科院（上海）細(xì)胞庫；HCC-2 購自舜冉（上海）生物科技有限公司；BEGM 培養(yǎng)基購自賽因百奧生物技術(shù)（北京）有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自Thermo Fisher Scientific（中國(guó)）；protein A/G 免疫沉淀磁珠購自bimake生物科技有限公司（美國(guó)）；RNase R 購自廣州吉賽生物科技股份有限公司；放線菌素D 購自南京羅邁美生物科技有限公司；EIF4A3 兔單克隆抗體、GAPDH 兔多克隆抗體、IgG 兔多克隆抗體、U2AF65兔多克隆抗體以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白IgG 二抗均購自Abcam（美國(guó)）。人肝癌及癌旁組織由黔南州人民醫(yī)院提供，本研究由黔南州人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，已告知患者知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THLE-2 用含10%FBS 和1%青/鏈霉素的BEGM 培養(yǎng)基，MHCC97-H 用含10%FBS和1%青/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，HCCLM3、Huh-7 以及HCC-2 用含10%FBS 和1%青/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞放在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 ～3 天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 從將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%的時(shí)候，按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 試劑盒說明書將circ-0008583 siRNA 及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到對(duì)應(yīng)細(xì)胞分組中，并通過qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 按照Trizol（Invitrogen）試劑說明書的方法從各處理組的細(xì)胞中提取總RNA，Q3000 超微量核酸蛋白檢測(cè)儀（Quawell Technology）檢測(cè)RNA 的純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒合成cDNA，并按照制造商說明書提供的方法使用SYBR Green 進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。circ-0008583 以18 s 為內(nèi)參，EIF4A3、U2AF65、DLG1 以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行歸一化處理，并通過2-ΔΔCt值來計(jì)算各組細(xì)胞中目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所用引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室所用引物序列Tab.1 Sequence of primers used in the laboratory

1.2.4 環(huán)狀RNA 穩(wěn)定性檢測(cè) 按照RNase R 試劑使用說明書，配置RNase R 反應(yīng)液，37 ℃消化RNA 15 min，70 ℃處理10 min 使RNase R 滅活，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ-0008583、DLG1的表達(dá)水平。用2 μg/mL 的放線菌素D 處理細(xì)胞6、12、18、24 h 后，按照1.2.3方法提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)circ-0008583、DLG1 的表達(dá)水平。

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h 后的各組細(xì)胞移植到6 孔板當(dāng)中（每孔500 個(gè)細(xì)胞）。培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 周后，甲醇固定15 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.6 TUNEL 染色 將處理后各組細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌1 次后，加入含0.1%Triton X-100 的PBS，冰浴孵育2 min。PBS 洗滌2 次后，加入TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗滌后，用抗熒光猝滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，加入等體積細(xì)胞裂解液冰浴裂解5 min后，收集裂解物。重懸protein A/G 免疫沉淀磁珠，NT-2 buffer 洗滌磁珠2 次 后，加 入EIF4A3 以 及U2AF65 抗體以及陰性對(duì)照IgG，室溫混懸1 h，棄去上清，在NT-2 buffe 重懸的磁珠中加入細(xì)胞裂解液，使用垂直混合器在4 ℃條件下孵育過夜。加入NT-2 洗滌磁珠后，蛋白酶K 消化后提取RNA 進(jìn)行后續(xù)分析。本實(shí)驗(yàn)所用溶液均不含RNA 酶。

1.2.8 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot） 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的全蛋白裂解液冰浴10 min 裂解細(xì)胞，提取總蛋白。BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量分析，取50 μg 蛋白在100 V 條件下SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h。在60 V 條件下轉(zhuǎn)膜2 h，將分離的蛋白轉(zhuǎn)到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌2 ～3 次后，加入HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，加入ECL 反應(yīng)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光儀下觀察并拍照。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，并用GraphPad Prism8.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ-0008583 在肝癌組織及細(xì)胞中高表達(dá) 在GSE94508 芯片數(shù)據(jù)中，和正常組織相比，circ-0008583 在肝癌組織中高表達(dá)；在我院收集的30 例癌及癌旁組織中發(fā)現(xiàn)，和癌旁組織相比，circ-0008583在肝癌組織中高表達(dá)（t=56.74，P＜0.001）；在肝癌細(xì)胞系中，和人肝永生化細(xì)胞THLE-2相比，circ-0008583 在肝癌細(xì)胞（MHCC97-H、HCCLM3、Huh-7、HCC-2）中高表達(dá)（MHCC97-H：t= 22.92，HCCLM3：t=9.40，Huh-7：t=25.46，HCC-2：t=5.06，P＜0.01）。由于circ-0008583 在MHCC97-H、Huh-7細(xì)胞中表達(dá)最高，故而選擇這兩種細(xì)胞進(jìn)行下一步研究。

2.2 circ-0008583 的circRNA 特 性驗(yàn)證 RNase R能夠降解線性RNA，故而多用RNase R 處理驗(yàn)證circRNA的環(huán)狀特性。在MHCC97-H、Huh-7細(xì)胞中，用RNase R 處理顯著降低DLG1 mRNA 的表達(dá)水平（MHCC97-H：t= 9.16，Huh-7：t=9.79，P＜0.001），而對(duì)circ-0008583 的表達(dá)水平無影響（P＞0.05）。circRNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定性大大增加。在MHCC97-H、Huh-7細(xì)胞中，與circ-0008583 相比，放線菌素D 處理加速DLG1 mRNA 降解（MHCC97-H：t= 11.30，Huh-7：t=21.10，P＜0.001）。

2.3 干擾circ-0008583 抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡 circ抑制組顯著降低MHCC97-H、Huh-7細(xì)胞中circ-0008583的表達(dá)水平（circ抑制組1：t=12.77，circ 抑制組2：t= 21.40，circ 抑制組3：t= 17.25，P＜0.001），其中circ 抑制組2 抑制效果最為顯著（圖1A-B），故而選擇其進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。見圖1C-D，和陰性對(duì)照組相比，circ 抑制組2 的細(xì)胞克隆數(shù)降低（MHCC97-H：t=8.49，Huh-7：t=6.19，P＜0.01）。見圖1E-F，和陰性對(duì)照組相比，circ 抑制組2 細(xì)胞凋亡水平升高（MHCC97-H：t= 14.18，Huh-7：t=19.38，P＜0.001）。

圖1 干擾circ-0008583 抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡Fig.1 Interference with CIRC-0008583 can inhibit the proliferation and promote apoptosis of HCC cells

2.4 circ-0008583 與EIF4A3 互相結(jié)合 通過檢索Circular RNA Interactome 數(shù)據(jù)庫（https：//circinteractome.irp.nia.nih.gov/）發(fā)現(xiàn)circ-0008583能夠與EIF4A3和U2AF65 結(jié)合。RIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在MHCC97-H、Huh-7 細(xì)胞中circ-0008583 均與EIF4A3 和U2AF65結(jié)合（圖2）。

圖2 circ-0008583 與EIF4A3 互相結(jié)合Fig.2 circ-0008583 is combined with EIF4A3

2.5 EIF4A3在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá) 在我院收集的30 例肝癌及癌旁組織中，與癌旁組織相比，EIF4A3 在癌組織中高表達(dá)（t= 43.15，P＜0.001）。qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)和western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與THLE-2細(xì)胞相比，EIF4A3 在肝癌細(xì)胞系（MHCC97-H、HCCLM3、Huh-7、HCC-2）中高表達(dá)（EIF4A3 mRNA：MHCC97-H：t= 22.19，HCCLM3：t= 14.24，Huh-7：t=14.81，HCC-2：t=5.00，均P＜0.001）。

2.6 過表達(dá)EIF4A3 逆轉(zhuǎn)干擾circ-0008583 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響 見圖3A，在MHCC97-H 細(xì)胞中，circ抑制組2降低EIF4A3的蛋白表達(dá)水平；同時(shí)過表達(dá)EIF4A3 則在一定程度上提高EIF4A3 蛋白表達(dá)（t= 5.80，P＜0.001）。見圖3B，circ抑制組2降低MHCC97-H 細(xì)胞的克隆形成能力（t= 10.59，P＜0.001），而過表達(dá)EIF4A3 使細(xì)胞克隆形成能力得到一定程度的回復(fù)（t=5.48，P＜0.001）。見圖3C，circ抑制組2促進(jìn)MHCC97-H細(xì)胞的凋亡（t=24.08，P＜0.001），而過表達(dá)EIF4A3 使細(xì)胞凋亡得到一定程度的抑制（t=7.33，P＜0.001）。

圖3 過表達(dá)EIF4A3 逆轉(zhuǎn)干擾circ-0008583 對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響Fig.3 Overexpression of EIF4A3 reverses the effect of circ-0008583 on proliferation and apoptosis of HCC cells

3 討論

circRNA 是一類生物體內(nèi)廣泛存在、穩(wěn)定且保守的非編碼RNA，通過其3′和5′末端的反向剪接形成共價(jià)環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)［9］。由外顯子、內(nèi)含子、外顯子-內(nèi)含子等多種方式環(huán)化形成，通過調(diào)節(jié)可變剪接、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、海綿吸附miRNA 等多種方式進(jìn)一步發(fā)揮其分子作用［10-12］。circRNA 廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，是腫瘤潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)［13-14］。關(guān)于circ-0008583 在肝癌中的作用機(jī)制仍需要研究。本研究發(fā)現(xiàn)，circ-0008583在肝癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)。由于circRNA 特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。用RNase R處理RNA，發(fā)現(xiàn)circ-0008583 不被降解，證實(shí)circ-0008583 具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步通過放線菌素D處理RNA，發(fā)現(xiàn)circ-0008583 的穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于DLG1 mRNA。為了明確circ-0008583在肝癌細(xì)胞中的分子功能，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾circ-0008583 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。最近也有報(bào)道稱Has_circ_0008583 影響肝癌惡性進(jìn)展，其機(jī)制可能與miR-1301-3p/METTL3通路有關(guān)［15］。circRNA能夠通過與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡和周期組織［16-17］。因此推測(cè)circ-0008583 可能有類似的調(diào)控作用。通過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)circ-0008583 能夠和EIF4A3 和U2AF65 結(jié)合，并通過RIP 實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ-0008583 與兩個(gè)蛋白都能夠結(jié)合。由于EIF4A3 中circ-0008583 的富集程度最高，故而選擇其進(jìn)一步探索。EIF4A3 是EIF4A 真核翻譯起始因子家族成員之一，轉(zhuǎn)錄后修飾蛋白的表達(dá)［18］。本研究發(fā)現(xiàn)EIF4A3 在肝癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)，和其他研究保持一致。而在干擾circ-0008583 表達(dá)的同時(shí)過表達(dá)EIF4A3，發(fā)現(xiàn)其能逆轉(zhuǎn)干擾circ-0008583 表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞系增殖抑制作用和凋亡的促進(jìn)作用。EIF4A3 在腫瘤的惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，如在結(jié)直腸癌中，circCSE1L 與EIF4A3 結(jié)合下調(diào)PCNA 表達(dá)，抑制了結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖［19］；此外，在肝癌中，EIF4A3高表達(dá)和肝癌患者預(yù)后不良相關(guān)；長(zhǎng)鏈非編碼RNA CASC11 通過EIF4A3介導(dǎo)E2F1激活促進(jìn)肝癌發(fā)生和HCC惡性進(jìn)展［20］；circ_0072995通過調(diào)節(jié)miR-1253/EIF4A3 信號(hào)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲［21］。

本研究通過生物信息學(xué)分析、臨床組織及細(xì)胞系驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)circ-0008583 在肝癌組織及細(xì)胞系中高表達(dá)。體外功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾circ-0008583表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。分子機(jī)制研究表明circ-0008583 與EIF4A3 結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡。然而circ-0008583 和EIF4A3 在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制仍然需要在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步的驗(yàn)證，該研究為肝癌的治療提供新的治療思路和理論依據(jù)。