王莉 劉小靜 張建勇

貴州省遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科（貴州遵義 563000）

支氣管哮喘（簡稱哮喘），是一種慢性氣道疾病，主要特征有氣道慢性炎癥、氣道高反應性及氣道黏液高分泌［1］。其中，氣道黏液高分泌是在多種致病因素的刺激下，導致氣道杯狀細胞肥大和增生所致的分泌高反應現(xiàn)象，其產(chǎn)生的大量黏液可引起氣流受限、氣道阻塞，甚至窒息導致哮喘患者死亡［2］，其中，黏蛋白MUC5ac 被認為是氣道黏液最主要的成分之一，氣道上皮杯狀細胞增生及高分泌可引起其過度表達［3-4］，因此氣道MUC5ac表達被作為氣道黏液高分泌的強度的一個重要指標。同時，多種細胞因子在哮喘中發(fā)生發(fā)展發(fā)揮作用，如IL-4、IL-5 促進嗜酸性粒細胞增多、黏液分泌增加。CXC 趨化因子受體4（CXC chemotactic rese-ptor4，CXCR4）是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，其配體是CXCL12，又稱基質(zhì)細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1），兩者共同作用可趨化炎癥細胞、調(diào)節(jié)其他細胞因子的表達及促進血管新生、重建等。AMD3100 是一種CXCR4 拮抗劑，與CXCR4 有效的結合可阻斷SDF-1 與CXCR4 之間的信號轉(zhuǎn)導發(fā)揮作用［5］。WANG 等［6］發(fā)現(xiàn)CXCR4可能在哮喘氣道炎癥和氣道重塑中起作用，表現(xiàn)為CXCR4 在哮喘8 周模型組支氣管壁面積、支氣管平滑肌面積和氣道壁平滑肌細胞數(shù)量較哮喘4 周模型組表達增加，但是否參與氣道黏液高分泌，目前尚未明確。本研究通過卵清白蛋白致敏和激發(fā)構建小鼠哮喘模型，觀察AMD3100 干預CXCR4 蛋白表達對哮喘小鼠氣道黏蛋白MUC5ac的影響，探討其抑制哮喘氣道黏液高分泌的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級6～8 周齡，BALB/C 小鼠24 只，體質(zhì)量（18.06 ± 1.24）g ，雌性，由湖南斯萊克實驗動物有限公司［SCXK（湘）2019-0004］。倫理審查編號：KLLY（A）-2019-101。

1.1.2 實驗試劑 AMD3100（美國Sigma 公司）、卵清蛋白（OVA）（Ⅱ和Ⅴ級）、氫氧化鋁凝膠（英國invivogen 公司），小鼠IL-4、IL-5 試劑盒（北京四正柏生物技術有限公司），小鼠CXCR4 試劑盒（上海江萊生物技術有限公司），AB-PAS 染色（北京索來寶生物技術有限公司），兔抗小鼠-MUC5ac 單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗小鼠-CXCR4 多克隆抗體（Proteintech 中國公司），免疫組化檢測（二步法）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（北京中杉生物技術有限公司），RNAiso Reagent、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?GREEN PCR Master Mix（大連TaKaRa 公司），CXCR4、β-actin 實時熒光定量PCR 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。實驗儀器：標準霧化箱（27 cm × 24 cm × 11 cm，自制），壓縮式霧化器NE-C900（大連歐姆龍有限公司），-80 ℃冰箱及Multiskan spectrum 酶標儀（美國Thermo 公司），離心機、核酸蛋白測量儀、熒光定量PCR 儀分別來自德國Eppe-ndorf公司、美國Nanodrop公司及BIO-RAD公司，電子天平（BS210S）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 隨機將小鼠分為正常組、哮喘組、CXCR4 阻滯劑AMD3100 組，每組8 只。參照KIM 等［7］和CASARO 等［8］方法，結合本課題多年哮喘小鼠模型制作方法并綜合改進，將單獨腹腔注射或腹腔注射聯(lián)合單個部位皮下注射OVA致敏，改進為腹腔注射聯(lián)合多個部位皮下注射OVA 致敏。哮喘組、CXCR4 阻滯劑AMD3100 組分別在第1、13 天腹腔注射等劑量40 μg OVA+1 mg氫氧化鋁，共0.2 mL，同時頸部皮下注射20 μg 0.1 mL OVA+1 mg 0.1 mL 氫氧化鋁及雙側大腿根部皮下分別注射10 μg 0.1 mL OVA+1 mg 0.1 mL氫氧化鋁注射致敏。第19 ～23 天，通過自制霧化箱對小鼠進行霧化治療，10% OVA（Ⅱ級）通過生理鹽水稀釋形成氣溶膠霧化激發(fā)，每天30 分鐘，共1 次；共計16 只小鼠成功構建哮喘模型，無小鼠死亡。正常組于第1 天和第13 天腹腔注射PBS 0.2 mL 聯(lián)合頸部、雙側大腿根部皮下注射0.9%氯化鈉注射液0.1 mL 致敏，第19 ～23 天，小鼠置于密閉霧化箱中霧化，生理鹽水氣溶膠霧化激發(fā)，每天1 次，每次30 min，至第24 天，無小鼠死亡。

1.2.2 給藥方法 CXCR4 阻滯劑AMD3100 組第19 ～23 天，于每次激發(fā)前30 min 腹腔注射10 mg/kg AMD3100［9］（配制方法：予磷酸鹽緩沖液5 mL 加入5 mg AMD3100 固體粉末中使其溶解，此刻濃度為1 mg/mL，每只小鼠腹腔注射0.2 mL）；正常組和哮喘組采用等劑量PBS 代替OVA 腹腔注射。

1.2.3 標本采集 末次激發(fā)24 h 后麻醉處死各組小鼠，打開胸腔剪取分別取右肺上中葉、右肺下葉，置于EP 管中-80 ℃冰箱保存及4% 多聚甲醛中常溫固定，分別予備mRNA 提取及制備石蠟標本、切片，右肺下葉用于HE、AB-PAS 染色及免疫組化測定放。右肺下葉置于4% 多聚甲醛中室溫固定，沿頸部正中切開，充分暴露頸部氣管并行“V”型切口，留置針于切口處插入氣管，生理鹽水0.3 mL 緩慢注入肺內(nèi)，回抽灌洗液置于EP 管，共3次，回收80%以上，4 ℃離心，上清液保存于-80 ℃冰箱，沉淀涂片行細胞分類及計數(shù)。

1.2.4 肺組織病理學檢查及圖像分析 根據(jù)試劑盒說明書對肺組織切片行HE、AB-PAS 染色。在普通光學顯微鏡下觀察。參照HENDERSON 等［10］方法對HE 染色進行支氣管周圍炎癥細胞浸潤評分，炎癥細胞浸潤有5 個評分標準，分別為無、少許、較多分布不均勻、大量均勻不成團、大量均勻并成團，分數(shù)為0 ～4 分；兩位病理科醫(yī)生進行盲法評價。AB-PAS 染色：有酸性、中性及混合黏液物質(zhì)及細胞表達，分別呈現(xiàn)為藍色、紅色及紫紅色，根據(jù)圖像分析軟件測量氣道黏液物質(zhì)表達情況。

1.2.5 各組小鼠BALF 中CXCR4、IL-4、IL-5 含量 使用ELISA 法根據(jù)試劑盒說明書進行操作并計算BALF 中各檢測指標的濃度。

1.2.6 免疫組化（immunohistochemical，IHC）檢測肺組織MUC5ac 及CXCR4 蛋白含量 常規(guī)脫蠟至水、微波抗原修復，3%過氧化氫去酶，其余操作嚴格按說明書進行。陽性對照：MUC5ac 黏蛋白單克隆抗體及兔抗小鼠CXCR4 多克隆抗體的稀釋濃度均為1∶100；空白對照用：PBS 代替一抗。MUC5ac 蛋白陽性染色為細胞漿、細胞膜，CXCR4蛋白陽性染色位于細胞膜和細胞質(zhì)之中，光學顯微鏡下觀察陽性細胞為棕黃色。

1.2.7 RT-PCR 檢測小鼠肺組織CXCR4 mRNA水平根據(jù)說明書提取小鼠肺組織中的RNA，將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板行RT-PCR 擴增。設置CXCR4 mRNA 引物序列：上游引物：5′-ACTGGCATAGTCGGCAA-3，下游引物：5′-TGACAAAGAGGAGGTCAGC-3；βactin 上游引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGAC-3，下游引物：5′-AGGCTGGAAAAGAGCCT-3′。由計算機自動計算并讀出每個樣本定量結果Ct值（threshold cycle）。采用2-△△Ct法計算CXCR4 mRNA（△Ct=Ctβ-actin-Ct CXCR4）的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0 進行數(shù)據(jù)分析，實驗統(tǒng)計結果以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤病理評分比較 正常組、哮喘組和AMD3100 組小鼠炎癥浸潤評分分別為（0.50 ± 0.54）、（3.66 ± 0.52）、（2.67± 0.82）分，AMD3100 組小鼠支氣管周圍炎癥病理評分較哮喘組降低，但仍高于正常組（P＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤病理評分比較Tab.1 Comparison of pathological scores of peribronchial inflammatory cell infiltration in each group ±s

表1 各組小鼠支氣管周圍炎癥細胞浸潤病理評分比較Tab.1 Comparison of pathological scores of peribronchial inflammatory cell infiltration in each group ±s

注：*表示與正常組比較，P ＜0.01；#表示與哮喘組比較，P ＜0.05

組別正常組哮喘組AMD3100 組氣道數(shù)20 20 20支氣管周圍炎癥細胞浸潤（分）0.50±0.54 3.66±0.52*2.67±0.82*#

2.2 HE 染色 見圖1。

圖1 肺組織病理學變化Fig.1 Pathological changes of lung tissue

2.3 各組小鼠氣道上皮AB-PAS 染色結果 正常組小鼠氣道組織中極少觀察到杯狀細胞，黏液分泌少；哮喘組小鼠染色后氣道組織中出現(xiàn)大量杯狀細胞，管腔狹窄，黏液分泌增多，黏液物質(zhì)相對著色面積較正常組升高（P＜0.01）；AMD3100 組氣道上皮杯狀細胞和黏液物質(zhì)相對著色面積較哮喘組降低（P＜0.01）。見表2、圖2。

圖2 各組小鼠肺組織AB-PAS 染色Fig.2 AB-PAS staining of lung tissue in each group of mice

表2 各組小鼠氣道上皮AB-PAS 的變化Tab.2 AB-PAS staining of lung in airway epithelium of mice in each group ±s

表2 各組小鼠氣道上皮AB-PAS 的變化Tab.2 AB-PAS staining of lung in airway epithelium of mice in each group ±s

注：*表示與正常組比較，P ＜0.01；#表示與哮喘組比較，P ＜0.01

組別正常組哮喘組AMD3100 組氣道組織黏液物質(zhì)陽性相對著色面積（%）2.31±0.62 32.14±2.13*22.81±2.05*#

2.4 各組小鼠BALF 中炎癥因子水平比較 AMD 3100 組小鼠BALF 中IL-4、IL-5、CXCR4 水平較哮喘組降低，但仍然高于正常組（P＜0.01），見表3。

表3 各組小鼠BALF 的CXCR4、IL-4、IL-5 的含量變化Tab.3 The contents of CXCR4，IL-4 and IL-5 in BALF of each group were changed ±s

表3 各組小鼠BALF 的CXCR4、IL-4、IL-5 的含量變化Tab.3 The contents of CXCR4，IL-4 and IL-5 in BALF of each group were changed ±s

注：*表示與正常組比較，P ＜0.01；#表示與哮喘組比較，P ＜0.01

組別正常組哮喘組AMD3100 組CXCR4（ng/mL）0.77±0.08 1.82±0.08*1.24±0.02#IL-4（pg/mL）14.80±2.34 55.47±3.35*32.69±1.72#IL-5（pg/mL）123.71±13.64 319.00±6.12*220.86±8.16#

2.5 各組小鼠肺組織MUC5ac 蛋白、CXCR4 蛋白和CXCR4mRNA含量比較 IHC染色顯示MUC5ac蛋白陽性表達主要在氣道上皮杯狀細胞及管腔內(nèi)；AMD3100 組小鼠肺組織MUC5ac 蛋白、CXCR4蛋白和CXCR4mRNA 含量較哮喘組降低，但仍高于正常組（P＜0.01）。見表4、5 和圖3、4。

表4 各組小鼠肺組織MUC5ac、CXCR4 蛋白水平Tab.4 Protein levels MUC5ac and CXCR4 in kung tissue of mice in each group ±s

表4 各組小鼠肺組織MUC5ac、CXCR4 蛋白水平Tab.4 Protein levels MUC5ac and CXCR4 in kung tissue of mice in each group ±s

注：*表示與正常組比較，P ＜0.01；#表示與哮喘組比較，P ＜0.01

組別正常組哮喘組AMD3100 組Muc5ac 蛋白陽性著色面積（IOD）7.41±2.20 114.80±4.95*55.32±3.79#CXCR4 蛋白陽性著色面積（IOD）4.84±0.72 76.20±4.19*37.69±2.15#

表5 各組小鼠肺組織CXCR4 mRNA 相對表達量Tab.5 The relative expression of XCXR4 mRNA in lung tissue of mice in each group ±s

表5 各組小鼠肺組織CXCR4 mRNA 相對表達量Tab.5 The relative expression of XCXR4 mRNA in lung tissue of mice in each group ±s

注：*表示與正常組比較，P ＜0.01；#表示與哮喘組比較，P ＜0.01

組別正常組哮喘組AMD3100 組CXCR4（ΔCT）0.386±0.022 1.530±0.060*1.061±0.027#

圖3 各組小鼠肺組織MAU5ac 表達Fig.3 MAU5ac Expression in lung tissue in each group mice

圖4 各組小鼠肺組織CXCR4 表達Fig.4 CXCR4 expression in lung tissue in each group of mice

3 討論

哮喘是一種以反復發(fā)作性喘息、咳嗽、氣促及胸悶為主要臨床表現(xiàn)，肺組織病理學變化為發(fā)生、發(fā)展的病理學基礎［11］的一種慢性氣道炎癥疾病。小鼠的哮喘癥狀以煩躁不安、呼吸急促、抓耳撓腮、弓背直立、腹肌收縮等異常行為為主［12］。本課題組既往以OVA 腹腔注射致敏改進為腹腔注射聯(lián)合多個部位皮下注射OVA 致敏后激發(fā)制備哮喘模型；小鼠臨床表現(xiàn)為呼吸急促、焦躁不安、弓背直立、抓耳撓腮、二便失禁等。在OVA 激發(fā)前給予小鼠AMD3100 腹腔注射，可觀察到哮喘小鼠焦躁不安、呼吸急促等臨床癥狀減輕。肺組織病理學結果顯示，AMD3100 組小鼠支氣管周圍炎癥病理評分較哮喘組降低，炎癥細胞浸潤減輕，杯狀細胞增殖及氣道分泌物減少，但仍高于正常組。提示AMD3100 干預可改善哮喘BALB/c 小鼠的臨床癥狀及肺組織病理學情況。哮喘的發(fā)病機制尚未完全闡明，多種細胞及細胞組分共同參與及相互作用形成氣道炎癥仍是其主要機制之一，其中，T 淋巴細胞和嗜酸性粒細胞（eosinophilegranulocyte，EOS）在氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。正常情況下，Th1/Th2 免疫應答處于平衡狀態(tài)，當發(fā)生免疫應答失衡如以Th2 型輔助T 細胞發(fā)揮作用時，會導致哮喘患者炎癥因子IL-4、IL-5等細胞因子的過度產(chǎn)生［13-14］。IL-4 主要參與機體免疫應答，可引起EOS 激活、黏液分泌、IgE 表型轉(zhuǎn)變等而誘發(fā)超敏反應［15］；且可直接作用于氣道上皮細胞，誘導黏液蛋白基因表達［16］。IL-5 作為哮喘發(fā)作的一個關鍵細胞因子，通過依賴和非依賴途徑共同作用，不僅能調(diào)節(jié)EOS 的增殖、分化，同時可在IL-13 的參與下誘導EOS 向肺部聚集及對氣道上皮起作用［17］。研究發(fā)現(xiàn)變應原刺激哮喘患者后出現(xiàn)IL-5 水平升高及EOS 大量浸潤，同時吸入重組人IL-5 后，可發(fā)生氣道高反應及痰EOS 細胞增加，證實IL-5 在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用，可作為反映哮喘發(fā)作的重要指標。本實驗發(fā)現(xiàn)哮喘組小鼠BALF 中IL-4、IL-5 水平均高于正常組，說明兩個細胞因子在哮喘急性發(fā)作中均發(fā)揮一定的作用。氣道黏液高分泌現(xiàn)已成為如慢阻肺、哮喘、肺囊性纖維化發(fā)病過程中主要臨床特征之一，不僅是一種“臨床癥狀”，更是一種高危因素，炎癥刺激下氣道上皮細胞可引起黏液大量分泌，細菌滋生，加重氣流受限及氣道阻塞，炎癥反復，形成惡性循環(huán)［3］，成為了慢性氣道炎癥性疾病的高危發(fā)病因素、加速疾病進展的重要組成部分及影響患者預后的制約因素，MUC5ac 是氣道黏液的主要組成部分，是杯狀細胞增生及高分泌的標志。本實驗證實哮喘組小鼠肺組織中MUC5ac 表達水平顯著高于正常組，與既往研究一致，表明小鼠肺組織中MUC5ac 表達水平上調(diào)在氣道黏液高分泌中發(fā)揮重要作用。CXCR4是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，也屬于CXC 趨化因子家族，參與造血和免疫系統(tǒng)的歸巢和趨化。SDF-1 是CXCR4 的配體，與CXCR4 結合啟動不同了的信號傳導途徑，可引起多種反應，如細胞存活、增殖、細胞內(nèi)鈣增加和基因轉(zhuǎn)錄等。CXCR4 已與HIV感染、癌癥、肺動脈高壓和肺損傷［18］等多種疾病相關。莫碧文等［19］研究表明CXCR4 可能在哮喘氣道炎癥和氣道重塑中起作用。CHEN 等［20］研究指出CXCR4 可能通過Th17 細胞通路在哮喘氣道炎癥及氣道高反應性中發(fā)揮作用。已有研究證實支氣管哮喘患兒外周血SDF-1、CXCR4 水平顯著高于對照組［21］。本實驗中AMD3100 組BALF 中CXCR4 含量減少、肺組織中CXCR4 蛋白水平及CXCR4 的mRNA 相對表達量較哮喘組顯著降低，說明AMD3100 可以阻滯CXCR4。哮喘組BALF 中CXCR4 含量、肺組織中CXCR4 蛋白水平及CXCR4的mRNA 相對表達量較正常組明顯升高，可以說明CXCR4 表達增高與哮喘氣道炎癥、氣道重塑相關，而氣道黏液高分泌和氣道炎癥、氣道重塑密切相關，因此有理由相信CXCR4 是哮喘氣道炎癥、氣道重塑及氣道黏液高分泌發(fā)病機制的重要因子。

AMD3100 是CXCR4 拮抗劑，通過抑制SDF-1/CXCR4 軸而發(fā)揮作用。在小鼠模型上，通過減少嗜酸性粒細胞及免疫細胞向氣道聚集，隨后減少炎性細胞因子的釋放而控制哮喘氣道炎癥［22］。本實驗通過AMD3100 干預哮喘小鼠后IL-4、IL-5、CXCR4、肺組織HE 染色氣道周圍炎癥細胞浸潤評分較哮喘組明顯減低，可以說明AMD3100 可減輕哮喘氣道炎癥及氣道重塑；HIROYUKI 等［23］研究發(fā)現(xiàn)CXCR4 在嗜酸性粒細胞浸潤性肺疾病BALF中表達明顯增高，通過抗體阻斷CXCR4 時嗜酸性粒細胞向炎癥部位轉(zhuǎn)移則減弱。滕捷明等［24］研究表明CXCR4 蛋白在支氣管上皮細胞表面表達受IL-4 的調(diào)控，當Th2 細胞因子IL-4 的表達下降時，細胞表面CXCR4 表達減少影響嗜酸性粒細胞向炎癥部位的遷移及在炎癥部位的分布，減輕氣道炎癥反應。該實驗中，AMD3100組BALF中CXCR4含量減少、肺組織中CXCR4 蛋白水平及CXCR4 的mRNA 相對表達量較哮喘組顯著降低，AMD3100干預可減輕哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑及氣道MUC5ac 分泌。

綜上所述，AMD3100 干預可降低CXCR4 蛋白的表達，抑制哮喘小鼠氣道炎癥反應，通過下調(diào)氣道黏蛋白MUC5ac 的表達水平，減輕氣道黏液高分泌。