多菌種發(fā)酵芝麻粕制備富含?；撬峄钚跃彪娘暳系墓に囇芯?/h1>
2022-06-21 06:19:18陳伶知胡雨靜任嘉敏唐建洲
畜禽業(yè) 2022年6期
張 宇，陳伶知，胡 譽，胡雨靜，任嘉敏，唐建洲，彭 亮
(長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 長沙 410022)
0 引言
隨著我國飼料工業(yè)的快速發(fā)展，常規(guī)蛋白原料如豆粕、魚粉的價格不斷上漲，飼料成本急劇增加，采用植物源蛋白替代魚粉以降低飼料成本成為市場關(guān)注的焦點[1]。但植物源蛋白相比于魚粉缺少?；撬帷Ｅ；撬崾切笄荼匦璧囊环N氨基酸，具有提高畜禽生長、繁殖性能、改善免疫力，促進采食等生物學(xué)功能[2]。
芝麻粕為芝麻榨油后的產(chǎn)物，粗蛋白含量高達38%～50%，蛋氨酸含量非常高，而蛋氨酸正是?；撬岷铣赏緩降那绑w物質(zhì)之一[3]。有研究表明，植物粕類可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生?；撬幔行Ы档推深愔械目?fàn)I養(yǎng)因子[4]，發(fā)酵產(chǎn)生的活性肽等容易被腸道黏膜直接吸收，并且采用多菌種固態(tài)發(fā)酵方法比單菌種發(fā)酵營養(yǎng)成分更為豐富[5]，可以補充大量活性益生菌，抑制有害菌的生長，改善腸道的微生態(tài)平衡，減少病害的發(fā)生[6]。另外，如果在飼料中直接添加?；撬嵋部梢赃_到效果，但是其成本高，飼喂效果不明顯[7-8]。因此本研究采用枯草芽孢桿菌YS-45、酵母S-78、黑曲霉PL-39共同發(fā)酵芝麻粕生產(chǎn)富含?；撬岬木彪娘暳希云诖婊虿糠执骠~粉，為飼料原料替代提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1)實驗菌株：枯草芽孢桿菌YS-45、酵母S-78、黑曲霉PL-39，長沙學(xué)院實驗室保藏。
2)主要試劑及發(fā)酵原料：?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；大米、芝麻粕、麩皮、豆粕均購買于長沙青草生物科技有限公司。
1.2 儀器設(shè)備
超凈工作臺、超純水系統(tǒng)、LGJ-10冷凍干燥機、高效液相色譜儀(島津LC-6AD)。
1.3 實驗方法
1)菌種活化及種子擴大培養(yǎng)。酵母菌、枯草芽孢桿菌活化條件為30℃，培養(yǎng)72 h；黑曲霉活化條件為37℃，培養(yǎng)120 h。將活化后的菌種制成菌懸液，按5%的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min，培養(yǎng)14～16 h，即制成種子菌懸液。
2)固體發(fā)酵。稱取發(fā)酵基質(zhì)20 g，混合均勻，121℃滅菌25 min。將制備的枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉種子菌懸液，接種到基質(zhì)中，在固態(tài)發(fā)酵罐中，30℃條件下發(fā)酵、烘干，即得富含?；撬岬幕钚跃彪娘暳?。
3)設(shè)置7個處理組，每組3個平行，每瓶總量為20 g。原料基質(zhì)打粉過60目篩，分裝至250 mL錐形瓶中，121℃滅菌25 min。分別將3種種子菌懸液接種到發(fā)酵基質(zhì)中，于30℃下發(fā)酵72h，烘干樣本備用。基質(zhì)配比如下：處理1，大米10 g、麩皮5 g、豆粕5 g、芝麻粕0 g；處理2，大米10 g、麩皮0 g、豆粕5 g、芝麻粕5 g；處理3，大米10 g、麩皮5 g、豆粕0 g、芝麻粕5 g；處理4，大米20 g、麩皮0 g、豆粕0 g、芝麻粕0 g；處理5，大米0 g、麩皮20 g、豆粕0 g、芝麻粕0 g；處理6，大米0 g、麩皮0 g、豆粕20 g、芝麻粕0 g；處理7，大米0 g、麩皮0 g、豆粕0 g、芝麻粕20 g。
4)不同菌種比例對活性菌氨肽飼料中牛磺酸含量的影響研究。取發(fā)酵基質(zhì)20 g分裝滅菌，冷卻接種，枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉為1:1:1、1:1:2、1:2:1、2:1:1，4個不同處理，每個處理3個平行，按體積比5%接種，于30℃下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為72 h，烘干樣本備用。
5)不同含水量對活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯?。按30%、35%、40%的含水量配制發(fā)酵基質(zhì)，各取發(fā)酵基質(zhì)20 g，每組設(shè)置3個平行樣，滅菌，冷卻接種，按體積比5%接種，于30℃下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為72 h，烘干樣本備用。
6)不同接種量對活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯俊Ｈ“l(fā)酵基質(zhì)20 g，按接種量為2%、4%、6%，每組設(shè)置3個平行樣，于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h，烘干樣本備用。
7)不同發(fā)酵時間對活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯?。取發(fā)酵基質(zhì)20 g分裝滅菌，冷卻接種，于30℃下發(fā)酵，發(fā)酵時間分別為48 h、72 h、96 h，烘干樣本備用。
8)?；撬針悠窓z測預(yù)處理。采用35 mL雙蒸水溶解5 g樣品，混勻后離心取上清，備用。上清液中加入等量三氯乙酸(10%)溶液混勻，靜置10 min后再加等量乙醚脫脂，離心取上清，蒸至5 mL，取樣100 μL加入300 μL衍生劑混勻衍生30 min，凍干，溶于1 mL雙蒸水，離心取上清，用高效液相色譜儀分析。
9)高效液相色譜法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岬暮?。配制流動相A、B液，將樣品和牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品上機檢測，通過計算牛磺酸含量。流動相配如下:A液:11.45 g無水醋酸鈉，溶于800 mL雙蒸水，加入100 μL三乙胺，定容至1 000 mL，冰醋酸調(diào)pH 5.8，取該溶液940 mL加入60 mL乙腈，0.45 μm膜過濾，超聲波除氣。B液:取600 mL乙腈，雙蒸水稀釋至1 000 mL，超聲波除氣。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同發(fā)酵基質(zhì)對菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊?/h3>
7個組合都能產(chǎn)生?；撬?，但是以純麩皮為發(fā)酵底物，?；撬岷孔钌?，這是由于麩皮中，合成牛磺酸的前體物質(zhì)蛋氨酸含量較低，只有0.18%左右。而發(fā)酵底物含豆粕或芝麻粕時，?；撬岷坑兴嵘?，這是因為豆粕和芝麻粕中蛋氨酸含量比較高。當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純豆粕時，?；撬岷棵黠@高于部分添加豆粕的兩組，這是因為同等質(zhì)量的豆粕中蛋氨酸含量要明顯高于大米和麩皮；當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純大米時，?；撬岷恳脖容^高，這可能是由于大米中營養(yǎng)成分相對比較全面，適合菌體生長和?；撬徂D(zhuǎn)化的原因。而當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純芝麻粕時，牛磺酸含量最高，這是因為芝麻粕中富含合成牛磺酸的前體物質(zhì)蛋氨酸，其含量高達0.82%。因此后續(xù)實驗進行以芝麻粕為底物的發(fā)酵工藝探索。多菌種發(fā)酵不同底物牛磺酸含量檢測結(jié)果如圖1所示。
圖1 多菌種發(fā)酵不同底物牛磺酸含量檢測結(jié)果
2.2 不同菌種比例發(fā)酵后?；撬岷繖z測結(jié)果
不同菌種比例處理組?；撬岷慷荚?.9%以上，菌種比例枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉=1:2:1時發(fā)酵效果最好?？赡芙湍钢饕玫鞍彼徇M行菌體生長，是促進?；撬岷铣傻年P(guān)鍵菌種，或者在這個比例下，3種菌協(xié)同生長狀態(tài)最好。
2.3 不同含水量發(fā)酵后牛磺酸含量檢測結(jié)果
由圖2可知，不同含水量處理組中，含水量為35%處理組?；撬岷孔罡??？赡艿脑蚴?0%含水量不足夠3種菌種同時生長；而40%含水量過多，導(dǎo)致黑曲霉生長過慢，影響整體發(fā)酵效果。
圖2 不同含水量檢測結(jié)果
2.4 不同接種量發(fā)酵后牛磺酸含量檢測結(jié)果
由圖3可知，不同接種量處理組中，4%的接種量發(fā)酵效果好?？赡艿脑蚴?%的接種量下，菌體前期生長迅速，但由于中期菌體數(shù)量過多，產(chǎn)酸較多不利于3種菌綜合生長。
圖3 不同接種量檢測結(jié)果
2.5 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵后牛磺酸檢測結(jié)果
由圖4可知，不同發(fā)酵時間組中，發(fā)酵時間為72 h最好。48 h可能由于發(fā)酵時間較短，菌種數(shù)量不夠?qū)е掳l(fā)酵效果較差；96 h可能有菌體已經(jīng)發(fā)生自溶，不再利于?；撬岬姆e累。
圖4 不同發(fā)酵時間檢測結(jié)果
2.6 最佳單因素條件下發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繖z測結(jié)果
通過單因素實驗法探索出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:發(fā)酵時間為72 h，菌種接種比例為枯草:酵母:黑曲霉=1:2:1，含水量為35%，接種量為4%。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繛?.5%。通過查閱文獻可知，進口魚粉?；撬岷繛?.514%～1.06%，本實驗結(jié)果顯示多菌種發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)物中?；撬岷渴莾?yōu)質(zhì)魚粉的1.4倍。
3 結(jié)論
試驗采用單因素方法，確定了芝麻粕活性菌氨肽飼料中?；撬岬淖罴寻l(fā)酵工藝為:含水量35%，菌種比例為枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉=1:2:1，接種量為4%，發(fā)酵時間為72 h，綜合條件下發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繛?.5%。
本實驗運用微生物發(fā)酵的方法，解決了植物源蛋白抗?fàn)I養(yǎng)因子的問題，可以通過加入芝麻粕，代替或部分代替魚粉，解決了植物源蛋白制備小肽飼料缺乏牛磺酸的問題，具有創(chuàng)新意義，為新型蛋白飼料的研發(fā)提供了理論依據(jù)。
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芝麻粕為芝麻榨油后的產(chǎn)物，粗蛋白含量高達38%～50%，蛋氨酸含量非常高，而蛋氨酸正是?；撬岷铣赏緩降那绑w物質(zhì)之一[3]。有研究表明，植物粕類可通過微生物發(fā)酵產(chǎn)生?；撬幔行Ы档推深愔械目?fàn)I養(yǎng)因子[4]，發(fā)酵產(chǎn)生的活性肽等容易被腸道黏膜直接吸收，并且采用多菌種固態(tài)發(fā)酵方法比單菌種發(fā)酵營養(yǎng)成分更為豐富[5]，可以補充大量活性益生菌，抑制有害菌的生長，改善腸道的微生態(tài)平衡，減少病害的發(fā)生[6]。另外，如果在飼料中直接添加?；撬嵋部梢赃_到效果，但是其成本高，飼喂效果不明顯[7-8]。因此本研究采用枯草芽孢桿菌YS-45、酵母S-78、黑曲霉PL-39共同發(fā)酵芝麻粕生產(chǎn)富含?；撬岬木彪娘暳希云诖婊虿糠执骠~粉，為飼料原料替代提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1)實驗菌株：枯草芽孢桿菌YS-45、酵母S-78、黑曲霉PL-39，長沙學(xué)院實驗室保藏。
2)主要試劑及發(fā)酵原料：?；撬針?biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；大米、芝麻粕、麩皮、豆粕均購買于長沙青草生物科技有限公司。
1.2 儀器設(shè)備
超凈工作臺、超純水系統(tǒng)、LGJ-10冷凍干燥機、高效液相色譜儀(島津LC-6AD)。
1.3 實驗方法
1)菌種活化及種子擴大培養(yǎng)。酵母菌、枯草芽孢桿菌活化條件為30℃，培養(yǎng)72 h；黑曲霉活化條件為37℃，培養(yǎng)120 h。將活化后的菌種制成菌懸液，按5%的接種量接種到種子培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min，培養(yǎng)14～16 h，即制成種子菌懸液。
2)固體發(fā)酵。稱取發(fā)酵基質(zhì)20 g，混合均勻，121℃滅菌25 min。將制備的枯草芽孢桿菌、酵母菌和黑曲霉種子菌懸液，接種到基質(zhì)中，在固態(tài)發(fā)酵罐中，30℃條件下發(fā)酵、烘干，即得富含?；撬岬幕钚跃彪娘暳?。
3)設(shè)置7個處理組，每組3個平行，每瓶總量為20 g。原料基質(zhì)打粉過60目篩，分裝至250 mL錐形瓶中，121℃滅菌25 min。分別將3種種子菌懸液接種到發(fā)酵基質(zhì)中，于30℃下發(fā)酵72h，烘干樣本備用。基質(zhì)配比如下：處理1，大米10 g、麩皮5 g、豆粕5 g、芝麻粕0 g；處理2，大米10 g、麩皮0 g、豆粕5 g、芝麻粕5 g；處理3，大米10 g、麩皮5 g、豆粕0 g、芝麻粕5 g；處理4，大米20 g、麩皮0 g、豆粕0 g、芝麻粕0 g；處理5，大米0 g、麩皮20 g、豆粕0 g、芝麻粕0 g；處理6，大米0 g、麩皮0 g、豆粕20 g、芝麻粕0 g；處理7，大米0 g、麩皮0 g、豆粕0 g、芝麻粕20 g。
4)不同菌種比例對活性菌氨肽飼料中牛磺酸含量的影響研究。取發(fā)酵基質(zhì)20 g分裝滅菌，冷卻接種，枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉為1:1:1、1:1:2、1:2:1、2:1:1，4個不同處理，每個處理3個平行，按體積比5%接種，于30℃下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為72 h，烘干樣本備用。
5)不同含水量對活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯?。按30%、35%、40%的含水量配制發(fā)酵基質(zhì)，各取發(fā)酵基質(zhì)20 g，每組設(shè)置3個平行樣，滅菌，冷卻接種，按體積比5%接種，于30℃下進行發(fā)酵，發(fā)酵時間為72 h，烘干樣本備用。
6)不同接種量對活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯俊Ｈ“l(fā)酵基質(zhì)20 g，按接種量為2%、4%、6%，每組設(shè)置3個平行樣，于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h，烘干樣本備用。
7)不同發(fā)酵時間對活性菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊懷芯?。取發(fā)酵基質(zhì)20 g分裝滅菌，冷卻接種，于30℃下發(fā)酵，發(fā)酵時間分別為48 h、72 h、96 h，烘干樣本備用。
8)?；撬針悠窓z測預(yù)處理。采用35 mL雙蒸水溶解5 g樣品，混勻后離心取上清，備用。上清液中加入等量三氯乙酸(10%)溶液混勻，靜置10 min后再加等量乙醚脫脂，離心取上清，蒸至5 mL，取樣100 μL加入300 μL衍生劑混勻衍生30 min，凍干，溶于1 mL雙蒸水，離心取上清，用高效液相色譜儀分析。
9)高效液相色譜法檢測發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岬暮?。配制流動相A、B液，將樣品和牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品上機檢測，通過計算牛磺酸含量。流動相配如下:A液:11.45 g無水醋酸鈉，溶于800 mL雙蒸水，加入100 μL三乙胺，定容至1 000 mL，冰醋酸調(diào)pH 5.8，取該溶液940 mL加入60 mL乙腈，0.45 μm膜過濾，超聲波除氣。B液:取600 mL乙腈，雙蒸水稀釋至1 000 mL，超聲波除氣。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同發(fā)酵基質(zhì)對菌氨肽飼料中?；撬岷康挠绊?/h3>
7個組合都能產(chǎn)生?；撬?，但是以純麩皮為發(fā)酵底物，?；撬岷孔钌?，這是由于麩皮中，合成牛磺酸的前體物質(zhì)蛋氨酸含量較低，只有0.18%左右。而發(fā)酵底物含豆粕或芝麻粕時，?；撬岷坑兴嵘?，這是因為豆粕和芝麻粕中蛋氨酸含量比較高。當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純豆粕時，?；撬岷棵黠@高于部分添加豆粕的兩組，這是因為同等質(zhì)量的豆粕中蛋氨酸含量要明顯高于大米和麩皮；當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純大米時，?；撬岷恳脖容^高，這可能是由于大米中營養(yǎng)成分相對比較全面，適合菌體生長和?；撬徂D(zhuǎn)化的原因。而當(dāng)發(fā)酵基質(zhì)為純芝麻粕時，牛磺酸含量最高，這是因為芝麻粕中富含合成牛磺酸的前體物質(zhì)蛋氨酸，其含量高達0.82%。因此后續(xù)實驗進行以芝麻粕為底物的發(fā)酵工藝探索。多菌種發(fā)酵不同底物牛磺酸含量檢測結(jié)果如圖1所示。
圖1 多菌種發(fā)酵不同底物牛磺酸含量檢測結(jié)果
2.2 不同菌種比例發(fā)酵后?；撬岷繖z測結(jié)果
不同菌種比例處理組?；撬岷慷荚?.9%以上，菌種比例枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉=1:2:1時發(fā)酵效果最好?？赡芙湍钢饕玫鞍彼徇M行菌體生長，是促進?；撬岷铣傻年P(guān)鍵菌種，或者在這個比例下，3種菌協(xié)同生長狀態(tài)最好。
2.3 不同含水量發(fā)酵后牛磺酸含量檢測結(jié)果
由圖2可知，不同含水量處理組中，含水量為35%處理組?；撬岷孔罡??？赡艿脑蚴?0%含水量不足夠3種菌種同時生長；而40%含水量過多，導(dǎo)致黑曲霉生長過慢，影響整體發(fā)酵效果。
圖2 不同含水量檢測結(jié)果
2.4 不同接種量發(fā)酵后牛磺酸含量檢測結(jié)果
由圖3可知，不同接種量處理組中，4%的接種量發(fā)酵效果好?？赡艿脑蚴?%的接種量下，菌體前期生長迅速，但由于中期菌體數(shù)量過多，產(chǎn)酸較多不利于3種菌綜合生長。
圖3 不同接種量檢測結(jié)果
2.5 不同發(fā)酵時間的發(fā)酵后牛磺酸檢測結(jié)果
由圖4可知，不同發(fā)酵時間組中，發(fā)酵時間為72 h最好。48 h可能由于發(fā)酵時間較短，菌種數(shù)量不夠?qū)е掳l(fā)酵效果較差；96 h可能有菌體已經(jīng)發(fā)生自溶，不再利于?；撬岬姆e累。
圖4 不同發(fā)酵時間檢測結(jié)果
2.6 最佳單因素條件下發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繖z測結(jié)果
通過單因素實驗法探索出最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:發(fā)酵時間為72 h，菌種接種比例為枯草:酵母:黑曲霉=1:2:1，含水量為35%，接種量為4%。在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繛?.5%。通過查閱文獻可知，進口魚粉?；撬岷繛?.514%～1.06%，本實驗結(jié)果顯示多菌種發(fā)酵芝麻粕產(chǎn)物中?；撬岷渴莾?yōu)質(zhì)魚粉的1.4倍。
3 結(jié)論
試驗采用單因素方法，確定了芝麻粕活性菌氨肽飼料中?；撬岬淖罴寻l(fā)酵工藝為:含水量35%，菌種比例為枯草芽孢桿菌:酵母菌:黑曲霉=1:2:1，接種量為4%，發(fā)酵時間為72 h，綜合條件下發(fā)酵產(chǎn)物中?；撬岷繛?.5%。
本實驗運用微生物發(fā)酵的方法，解決了植物源蛋白抗?fàn)I養(yǎng)因子的問題，可以通過加入芝麻粕，代替或部分代替魚粉，解決了植物源蛋白制備小肽飼料缺乏牛磺酸的問題，具有創(chuàng)新意義，為新型蛋白飼料的研發(fā)提供了理論依據(jù)。
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